小鼠胚胎干细胞hprt基因的定位致变

体细胞hprt基因位点在电离辐射及其它致突物质研
究中的应用
HPRT基因是一种碱基重组的锌指蛋白，它可以用来检测细胞的敏感性，以及细胞的耐受性和重新组合的可能性。

细胞的外源态电离辐射（如电离辐射和放射性转换）可以使细胞中DNA出现片段化、衍生物核酸等变化，从而改变碱基序列，导致基因突变。

HPRT基因位点可以用来检测电离辐射对细胞的影响，它可以测定电离辐射的毒性致突实验中的克隆稳定性和正确性。

此外，HPRT基因位点可以用来评估其它致突物质（如药物和化学物质）对细胞的影响。

HPRT基因位点的检测可以进一步了解这些致突物质对细胞的敏感性，从而为毒理学研究和安全检测提供参考。

・诺贝尔奖工作回顾・小鼠基因修饰基本原理及其在医学研究中的应用———2007年诺贝尔生理学或医学奖及其相关工作介绍汤富磊1　冯　娟2(1北京大学精神卫生研究所,北京100083;2北京大学医学部生理学与病理生理学系,北京100083) 2007年10月8日,瑞典皇家卡罗琳医学研究院诺贝尔生理学或医学奖评审委员会宣布,美国科学家Mari o R .Capecchi 、O liver S m ithies 和英国科学家Martin J.Evans 在“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发现”[1]而获得2007年度诺贝尔生理学或医学奖(图1)。

图1　2007年度诺贝尔生理学或医学奖获得者Mari o R.Capecchi 1937年出生于意大利。

1967年获哈佛大学生物物理学博士学位,长期担任美国犹他大学人类遗传学和生物学教授,同时在霍华德2休斯医学研究所(Howard 2Hughes Medical I nstitute )工作。

O liver S m ithies 1925年出生于英国。

1951年获牛津大学生物化学博士学位,现在美国北卡罗来纳大学教会山分校工作。

Mari o R.Capecchi 和O li 2ver S m ithies 分别独立地发现了利用两段DNA 片段的同源重组可以对哺乳动物基因组进行可控的基因修饰。

Martin J.Evans1941年出生于英国,1963年从剑桥大学毕业后进入伦敦学院解剖与胚胎系攻读博士学位。

现在英国加的夫大学担任哺乳动物遗传学教授。

1981年,Evans 从小鼠胚胎中成功地分离出未分化的胚胎干细胞,这些细胞是生物成体所有细胞的来源。

他还建立了一系列基本技术,包括对胚胎干细胞进行细胞培养、遗传操作,以及将遗传改造过的胚胎干细胞转入代孕母鼠体内以产生经遗传操作的后代。

上述三位科学家的工作,使人们可以在哺乳动物的生殖细胞中进行特定的基因改造,并繁殖出成功表达这种新基因的后代。

小鼠淋巴细胞hprt基因突变检测的研究进展
杨录军;曹佳
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2006(018)005
【摘要】肿瘤的发生、发展与突变事件密切相关.人类在环境中接触的突变剂的检出依赖于致突变试验.以次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, hprt)基因为报告基因的 hprt突变试验是几个重要的致突变试验之一,其优点在于不仅能检测出突变剂的致突变能力大小,还可以对突变体进行突变谱分析,并且能为多种与 hprt基因突变相关的人类疾病提供研究资料.以小鼠啮齿动物为试验模型的淋巴细胞 hprt基因突变试验近年来得到广泛应用,本文对其研究进展作一综述.
【总页数】3页(P414-416)
【作者】杨录军;曹佳
【作者单位】第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038
【正文语种】中文
【中图分类】Q754
【相关文献】
1.大鼠外周血淋巴细胞和脾淋巴细胞HPRT基因突变的比较 [J], 崔凤梅;赵经涌;胡明江;宁萍;劳勤华;王六一
2.2450 MHz微波辐照对小鼠外周血淋巴细胞HPRT基因突变的影响 [J], 庞轶兵;丁桂荣;郭国祯;任东青;宫越顺二
3.大鼠外周血淋巴细胞HPRT基因突变检测的方法学探讨 [J], 徐永忠;劳勤华
4.体细胞HPRT基因突变检测用于辐射剂量估算的可行性研究 [J], 段志凯;陈英;张淑贤;徐洪兰;王明明
5.辐射诱发外周血淋巴细胞HPRT基因位点突变的研究进展 [J], 崔凤梅;赵经涌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠淋巴细胞hprt基因突变检测的研究进展杨录军;曹佳【摘要】肿瘤的发生、发展与突变事件密切相关.人类在环境中接触的突变剂的检出依赖于致突变试验.以次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, hprt)基因为报告基因的 hprt突变试验是几个重要的致突变试验之一,其优点在于不仅能检测出突变剂的致突变能力大小,还可以对突变体进行突变谱分析,并且能为多种与 hprt基因突变相关的人类疾病提供研究资料.以小鼠啮齿动物为试验模型的淋巴细胞 hprt基因突变试验近年来得到广泛应用,本文对其研究进展作一综述.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2006(018)005【总页数】3页(P414-416)【关键词】hprt;突变;突变谱;淋巴细胞【作者】杨录军;曹佳【作者单位】第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038;第三军医大学军事毒理学教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】Q754次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosy1transferase,hprt)基因突变试验是几个重要的致突变试验之一。

hprt基因编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶,催化次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸反应,生成相应的核苷-5-单磷酸(NMP)。

这是一条生成NMP的补充途径。

如果存在6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、6-巯基嘌呤(6-MP)、8-氮鸟嘌呤(8-AG)等碱基类似物,则以这些物质为底物可生成相应的NMP,参与DNA合成而导致细胞死亡。

如果突变剂使hprt基因失活(hprt-）将导致细胞中的HPRT酶活性大幅度下降从而使(hprt-）细胞能在一定的嘌呤类似物浓度下正常生长而这个浓度足以导致HPRT 酶水平正常的细胞(hprt+)发生死亡。

制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。

具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。

这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。

2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。

质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。

3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。

4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。

5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。

这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。

6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。

通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。

《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）在生命科学研究领域得到了广泛的应用。

它们在细胞生物学、发育生物学、疾病模型和药物研发等方面具有重要作用。

因此，建立稳定、高效的小鼠新型胚胎干细胞系是科学研究的关键任务之一。

本文将详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其潜在应用。

二、研究目的和意义本研究的目的是建立一种新型的小鼠胚胎干细胞系，旨在提高干细胞的分化潜能、稳定性以及可操控性。

这种新型胚胎干细胞系将有助于更好地研究细胞发育和分化机制，为疾病模型研究、药物研发和再生医学提供有力工具。

三、研究方法1. 实验材料与试剂：本实验采用小鼠胚胎组织作为起始材料，使用特定培养基和生长因子进行细胞培养。

2. 细胞培养：从早期胚胎中获取内细胞团（ICM），将其置于特定的培养条件下进行培养和扩增。

3. 细胞克隆和筛选：通过特定标记和筛选方法，从培养的细胞中筛选出具有干细胞特性的克隆。

4. 遗传和表型分析：对筛选出的干细胞进行遗传学和表型分析，评估其特性和稳定性。

5. 数据分析与统计：采用适当的统计方法对实验数据进行处理和分析，以验证实验结果的有效性。

四、实验结果1. 细胞培养与扩增：成功从早期胚胎中获取内细胞团，并培养成新型胚胎干细胞系。

经过多次传代，细胞保持稳定增殖。

2. 细胞克隆和筛选：通过特定标记和筛选方法，成功筛选出具有干细胞特性的克隆，并建立新型胚胎干细胞系。

3. 遗传和表型分析：新型胚胎干细胞系在遗传学和表型分析中表现出良好的稳定性和可操控性。

4. 数据分析与统计：通过适当的统计方法对实验数据进行处理和分析，验证了新型胚胎干细胞系的有效性和可靠性。

五、讨论本研究成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，具有较高的分化潜能、稳定性和可操控性。

与传统的胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在细胞生物学、发育生物学、疾病模型和药物研发等方面具有更广泛的应用前景。

小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制在生命科学的广袤领域中，小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）自我更新的信号调控机制一直是备受关注的研究热点。

这不仅对于深入理解胚胎发育的奥秘至关重要，还为再生医学和疾病治疗带来了无限的可能。

要明白小鼠胚胎干细胞的自我更新机制，首先得清楚什么是胚胎干细胞。

简单来说，胚胎干细胞是一种具有全能性的细胞，它们有潜力分化成身体内的各种细胞类型。

而自我更新，则指的是这些细胞在保持未分化状态的同时，能够不断地分裂增殖，产生更多的相同类型的胚胎干细胞。

那么，是什么在背后操控着这一神奇的过程呢？其中，一系列的信号通路起着关键的调控作用。

首先，LIF/STAT3 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中扮演着重要角色。

LIF（Leukemia Inhibitory Factor，白血病抑制因子）与细胞表面的受体结合后，激活了 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，信号转导与转录激活因子 3）。

活化的 STAT3 进入细胞核，调控一系列与自我更新相关的基因的表达。

当 LIF 存在时，STAT3 被激活，促进胚胎干细胞的自我更新；而缺乏 LIF 时，STAT3活性降低，胚胎干细胞容易发生分化。

再者，BMP（Bone Morphogenetic Protein，骨形态发生蛋白）信号通路也对小鼠胚胎干细胞的自我更新有着重要影响。

BMP 与相应的受体结合后，通过一系列的信号转导，激活下游的 Smad 蛋白。

这些被激活的 Smad 蛋白会与其他转录因子相互作用，调节与自我更新和多能性相关的基因表达，从而维持胚胎干细胞的未分化状态。

除了上述两条主要的信号通路，还有其他一些因素也参与其中。

例如，Wnt 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中也发挥了一定的作用。

当 Wnt 信号通路被激活时，它可以抑制胚胎干细胞的分化，促进其自我更新。

1、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代2 、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。

不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。

下文中暂不提及Feed细胞。

Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。

分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。

贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。