发酵乳清蛋白制备抗氧化肽工艺的优化

发酵乳清蛋白制备抗氧化肽工艺的优化

胡姝敏;刘宝华;孙欣瑶;李晓东;王春潮

【摘 要】利用微生物发酵法制得的乳清蛋白抗氧化肽是一种天然抗氧化剂,副产物少,有发酵的芳香,安全无毒.主要利用微生物发酵法制备乳清蛋白抗氧化肽,通过菌株的筛选及乳清蛋白肽制备条件的优化,得到乳清蛋白肽最佳制备工艺.结果表明,选择瑞士乳杆菌CICC 22818发酵最终水解度为9.36％,菌株活力达到8.5 LogCFU/g,且产酸能力较强,因此选择瑞士乳杆菌CICC 22818作为最终发酵菌株.发酵乳清蛋白的最佳工艺为:乳清蛋白含量10％,发酵时间63 h、发酵温度43.3℃、接种量3.5％,此时DPPH自由基清除率为26.4％,同时乳清蛋白肽纯化后DPPH自由基清除率提高到35.62％,·OH自由基清除率达到20.58％.

【期刊名称】《中国乳业》

【年(卷),期】2018(000)004

【总页数】11页(P71-81)

【关键词】乳清蛋白;发酵;抗氧化肽;工艺

【作 者】胡姝敏;刘宝华;孙欣瑶;李晓东;王春潮

【作者单位】黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司;黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司;黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司;东北农业大学食品学院;东北农业大学食品学院

【正文语种】中 文

抗氧化剂在国内外发展较快，在越来越广泛的领域进行应用。Harman提出的自由基理论指出，过多的自由基会造成细胞受损害，如磷脂膜、蛋白损害和DNA损害，这和一些疾病息息相关，如肥胖症、动脉粥样硬化、癌症等[1～3]。人们也有这样的意识，即人体内因氧化产生的自由基是导致人衰老和部分疾病的原因[4]，抗氧化剂应用范围广，不仅可以用于食品中以延长保质期，而且可用于保健食品及化妆品中作为功能成分。抗氧化剂有繁多的种类，但是化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等使用受限，其使用不当可以引起DNA损伤，且本身具有毒副作用[5，6]，为增加安全性，很多国家对抗氧化剂的添加量都规定了ADI值[7]。因此，人们逐渐开始研究提取天然抗氧化剂，主要是从植物、动物组织中提取，已研制出乳清蛋白肽、大豆多肽及肌肽等，根据其不同的功能性应用于不同的产品中，如抗氧化肽、降胆固醇肽、降血压肽、抗菌肽[8]等。活性肽是对机体健康有影响的特殊蛋白质片断，对促进机体健康，防御疾病功能具有积极作用[9]，能使机体组织损伤降低到最小，其功能主要取决于所含的氨基酸组成和序列，可以添加到功能性食品或特殊的营养应用中[10]。

发酵方法相比于蛋白酶解法有其独特的优点，微生物产酶的过程和酶水解蛋白的过程结合为一步，酶的分离和产物纯化步骤被省去，生产成本也随之降低。微生物产生的端肽酶对活性肽末端起到修饰的作用，因此小肽不但苦味降低，同时还有发酵产生的天然芳香味，有较好的适口性[11]。抗氧化肽能有效地清除体内累积的自由基生物活性物质，有效保护细胞及组织的生理功能。氧化与人类及其它动物的许多疾病相关[12，13]，例如癌症、衰老、心脑疾病等，适当摄入具有抗氧化活性的物质会起到预防疾病的作用。抗氧化肽能避免脂质过氧化的发生，减缓油脂的氧化速率，延长产品的保藏期。通过对抗氧化多肽的研究开发，能够为更多领域提供更安全、更可靠、抗氧化活性更高的抗氧化剂，为抗氧化多肽的进一步研究提供依据，相信抗氧化多肽会有一个更广阔的应用前景。本研究主要是确定发酵菌种和优化抗氧化多肽发酵工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验菌株：瑞士乳杆菌（lactobacillus Helveticas）CICC22818、CICC22815，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）20538、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus

rhamnosus）22173、23119，来自东北农业大学食品学院重点试验室菌种保藏库。

乳清浓缩蛋白（WPC80）：湖北欣和生物科技有限公司提供；DPPH：Sigma公司；甘氨酸：天津博迪化工股份有限公司；茚三酮：天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.2 仪器与设备

JD500-2电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；85-2恒温磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司；数显恒温水浴箱：上海比朗仪器有限公司；离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UT-1800紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司。

表1 甘氨酸标准曲线的制作试剂管号0 1 2 3 4 5甘氨酸稀释溶液（mL） 0 2.0

2.0 2.0 2.0 2.0茚三酮显色剂（mL） 1 1 1 1 1 1 40%乙醇（mL） 5 5 5

5 5 5甘氨酸含量（μg/mL） 0 4 8 12 16 20

2 试验方法

2.1 菌株的筛选

2.1.1 产酸能力的测定

使用PHS-3C精密pH计进行测定。pH计使用前应分别使用pH值为4.01和6.88的标准缓冲溶液（20 ℃）进行校准。

2.1.2 活菌数的测定

在无菌操作下取5mL发酵样品，加入45 mL无菌生理盐水中，充分振荡混匀，然后根据样品中含菌量的不同，做10 倍系列不同浓度稀释，取适当梯度的稀释液倒在MRS琼脂平板上，37 ℃恒温培养72 h，对菌落数进行计数（以每mL样品中的菌落数进行计数）。

2.1.3 水解度的测定

水解度的测定[14]采用茚三酮显色法，用甘氨酸的量计算。原理为：蛋白质水解物和茚三酮发生显色反应生成蓝色物质，用分光光度计进行测定。

（1）甘氨酸标准曲线的绘制

准确称取0.1g干燥的甘氨酸，溶解定容至100 mL容量瓶中，再吸取2.00 mL溶液定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为20 μg/mL的溶液。再以此溶液分别稀释成甘氨酸含量为2～20 μg/mL的溶液用于绘制标准曲线（表1）。取稀释液2.00 mL于试管中，加入1.00 mL显色剂，混匀后沸水浴中加热15 min，同时作空白试验，冷水冷却后，加入5.0 mL 40%（V/V）乙醇溶液混匀，并放置15

min，用空白组在570 nm处调零，测定试验组的吸光值。（2）茚三酮显色剂的配制

2 g茚三酮溶解于100 mL蒸馏水中，溶液置于棕色瓶中保存，现用现配。

（3）茚三酮法测定蛋白水解度

取蛋白水解液0.5 mL定容至50 mL容量瓶中，再从中取0.40 mL稀释液于试管中，用蒸馏水稀释5倍，加入1.00 mL茚三酮溶液，混匀后沸水浴15 min，同时作空白试验。根据测得的吸光度计算乳清浓缩蛋白水解度。

计算蛋白水解度公式如下：

其中：htot是指每克被裂解蛋白质的肽键毫摩尔数，WPC htot=8.8（mmol/g）；6.25×N为乳清蛋白含量（g/L），采用凯氏定氮法进行测定。

2.2 乳清蛋白抗氧化肽制作工艺的优化

2.2.1 单因素试验

（1）乳清蛋白含量对水解度和DPPH自由基清除率的影响

取适量乳清蛋白浓缩粉〔6%、8%、10%、12%、14%（W/V）〕，用去离子水配制，在63 ℃条件下灭菌30 min，冷却到室温，并按照2%的比例接种瑞士乳杆菌CICC 22818，在恒温培养箱中37 ℃培养24 h，于6 000 rpm条件下离心15

min，测定蛋白水解度，以蛋白水解度为指标，并测定不同浓度的乳清浓缩蛋白对DPPH自由基清除能力的影响。

（2）发酵时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响

取适量乳清蛋白浓缩粉，加入去离子水配制成浓度为10%（W/V）的溶液，在63 ℃条件下灭菌30 min，冷却到室温，并按照2%的比例接种瑞士乳杆菌CICC

22818，在恒温培养箱中37 ℃条件下分别培养24、36、48、60、72 h，取20

mL加入离心管中，6 000 r/min离心15 min，测定蛋白水解度和DPPH自由基清除能力，研究发酵时间对蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影响。

（3）接种量对水解度和DPPH自由基清除率的影响

取适量乳清蛋白浓缩粉，加入去离子水配制成浓度为10%（W/V）的溶液，在63 ℃条件下灭菌30 min，冷却到室温，瑞士乳杆菌CICC 22818接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，在恒温培养箱中37 ℃条件下分别培养24 h，取20

mL加入离心管中，6 000 r/min离心15 min，测定蛋白水解度和DPPH自由基清除能力，研究接种量对蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影响。

（4）发酵温度对水解度和DPPH自由基清除率的影响

取适量乳清蛋白浓缩粉，加入去离子水配制成浓度为10%（W/V）的溶液，在63 ℃条件下灭菌30 min，冷却到室温，并分别按照2%比例接种瑞士乳杆菌CICC 22818，在恒温培养箱中在37、40、43、45、50 ℃条件下分别培养24 h，取20 mL加入离心管中，6 000 r/min离心15 min，测定蛋白水解度和DPPH自由基清除率，研究温度对蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影响。

2.2.2 乳清浓缩蛋白发酵测定指标

（1）水解度

测定方法见2.1.3。

（2）DPPH自由基清除能力

参考Shimada等[15]的方法进行测定，原理为DPPH在乙醇中呈紫色，于517

nm处有强吸收能力，加入抗氧化剂后会褪色，其颜色变浅程度可反映抗氧化剂的抗氧化能力。将 DPPH用无水乙醇配成浓度为6.5×10-4 mol/L的溶液，在冰箱存放，用时稀释为6.5×10-5 mol/L溶液。将1.0 mL 5.00 mg/mL蛋白水解液加入到2.0 mL DPPH溶液中，避光保存30 min后在517 nm处测定样品吸光值。吸光值越低其抗氧化性越强。

2.2.3 抗氧化肽制备工艺的优化

选择发酵浓度、发酵时间、接种量、发酵温度为变量，选定四因素三水平，Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计，采用响应面分析法分析试验，以DPPH自由基清除能力为指标，对抗氧化肽工艺参数进行优化，并做验证试验。

2.3 乳清蛋白肽抗氧化性的测定

瑞士乳杆菌CICC 22818发酵乳清浓缩蛋白WPC 80，在最佳发酵条件下，即发酵温度为43 ℃，发酵时间为60 h，接种量为3%，乳清蛋白浓度为10%时，以水解液的·OH自由基清除能力、还原力为指标，测定蛋白发酵液的抗氧化能力，并与未优化发酵条件的蛋白水解液对比抗氧化能力，检测抗氧化性提高的情况。 2.3.1 ·OH自由基清除能力的测定

根据贾之慎等[16]方法对·OH自由基清除能力进行测定。先取一定量的样品，用磷酸缓冲溶液进行溶解。取0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL于试管中，加入0.15 mol/L磷酸缓冲液（pH值7.4）2 mL和蒸馏水1 mL，混匀后加入1

mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液和1 mL双氧水，37℃水浴60 min，测得损伤管吸光值A损。未损伤管以蒸馏水代替损伤管中的双氧水，方法同上，测定未损伤管的吸光值A未。样品管用样品代替损伤管中的蒸馏水，在536 nm处测吸光值。按下列公式计算清除率。

2.3.2 还原力的测定

根据Oyaizu[17]方法对还原力进行测定。取一定质量浓度的乳清蛋白水解产物样品溶液1.00 mL，加入2.00 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值6.6）和1%铁氰化钾溶液各2.50 mL，50 ℃水浴20 min，然后加入质量分数为10%的三氯乙酸2.50

mL，3 000 r/min条件下离心10 min。取2.50 mL上清液和 0.50 mL三氯化铁（0.1%，W/V）混合，10 min后在700 nm处测定吸光度A，A越大还原能力越强。

2.4 乳清浓缩蛋白发酵液的纯化及冻干

2.4.1 超滤处理乳清浓缩蛋白发酵液

取乳清浓缩蛋白发酵液，在6 000 r/min条件下离心15 min，除去菌体及部分大分子物质。取上清液超滤去除大分子物质及盐类等杂质，乳清浓缩蛋白发酵液使用10 Ku截留分子量薄膜进行超滤浓缩，超滤温度为40 ℃，压力为0.2 MPa，WPC浓度为10%。

2.4.2 乳清蛋白肽的冷冻干燥

先将多肽降温使其冻结，然后用冷冻干燥机干燥样品。具体操作如下：（1）取发