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SDS-PAGE电泳标准操作规程（SOP）rosoftOfficeWord文档SDS-PAGE电泳标准操作规程(SOP)一．仪器装置1．电泳仪2．夹心式垂直电泳槽3．玻璃板：长14.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm4．可调微量移液器5．微量进样器6．转移脱色摇床二．试剂配制1．丙烯酰胺液（30%T/2.7%C）用天平分别称取58.4g丙烯酰胺（Acr）和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis），溶于120ml温热（37℃左右，以利于溶解Bis）的去离子水中，然后转移至200ml容量瓶中，补加去离子水至刻度，摇匀，用滤纸过滤后，检查其pH值应不大于7.0，贮存在棕色瓶中，4℃保存。
每隔2个月重新配制。
小心：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套。
如不慎接触皮肤，应立即用水和肥皂清洗。
2．分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.8）用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
3．浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH6.8）用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
4．10% 十二烷基硫酸钠溶液用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠（SDS），加180ml去离子水，68℃水浴使溶解后，用去离子水定容至200ml，室温保存。
5．10% 过硫酸铵溶液用天平称取0.50g过硫酸铵（APS），溶于5ml去离子水中，分装Eppendof管冰冻保存。
6．四甲基乙二胺（TEMED）液7．分离胶覆盖液（（0.375M Tris-HCl，pH8.8，0.1% SDS）取分离胶缓冲液25ml、10% SDS溶液1.0ml，混匀，加去离子水定容至100ml，室温保存。
聚丙烯酰氨凝胶电泳一简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
二作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
SDS-PAGE电泳标准操作规程1.目的：制定本规程以规范还原性SDS-PAGE和非还原性SDS-PAGE电泳方法分离蛋白的操作过程。
2.范围：抗原或是抗体的定性鉴定、纯度鉴定和相对定量比较。
3.责任：质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。
4.定义：N/A5.设备、材料和试剂：5.1设备、材料设备名生产商型号/货号设备编号备注电泳仪伯乐PowerpacHC TM HV JS026垂直电泳槽伯乐Miniprotean JS025干式恒温浴K30 JS045离心机eppendorf F-45-12-11 JS020单道移液器（10ul,100ul）Eppendorf Research plus JH07931,GH15898冰箱TCL BCD-211KD3 N/A摇床QILIM BEIER N/APH仪梅特勒5.2试剂试剂名称生产商货号批号APS国药集团化学试剂F20111213甲醇国药集团化学试剂20130407 冰醋酸国药集团化学试剂130420考马斯亮蓝R-250 国药集团化学试剂20130322 Tris-HCl 国药集团化学试剂201300422 甘油国药集团化学试剂F201000115 溴酚蓝国药集团化学试剂20120929 无水乙醇国药集团化学试剂甘氨酸国药集团化学试剂SDSDTTProtein Marker盐酸国药集团化学试剂2×PAGE 7.5%凝胶制备试剂盒Promoton PG111 分离胶缓分离胶溶液4%浓缩胶Promoton 浓缩胶预混液6.溶液配制6.1分离胶以1mm板，配两块为例：取7.5%的分离胶缓冲液和分离胶各5ml混匀，再向其加入10%的APS溶液100μl混匀。
6.2 浓缩胶以1mm板，配两块为例：取浓缩胶的预混液4ml，向其加入10%的APS溶液40μl混匀。
6.3 上样缓冲液（loading buffer）：6.4 10%过硫酸铵称取1g APS，加入10ml纯水搅拌溶解（现配现用）也可储存4~8℃冰箱中保存，保存期为1-2周。
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.815.1g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.35×电极缓冲液 Tris2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。
1. ＳＤＳ主要的作用有４：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
所以不能断开二硫键。
ＤＴＴ：还原剂，可以断开二硫键。
有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体，如果加入β－巯基乙醇，它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，这样，电泳的样品将会被完全还原成单体形式，不加的样品中则会保持聚体的形式，这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了。
2. SDS-PAGE有非还原性（non-reduced）SDS-PAGE和还原性（reduced）SDS-PAGE之分，均是变性条件下的电泳。
还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂（如DTT或2-巯基乙醇等）。
非变性（non-denaturing）PAGE又称为天然（native）PAGE，操作的基本过程与SDS-PAGE相似，唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性，包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂（如SDS）、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。
3. 我现在经过多方面咨询，问了几个海龟和公司的技术顾问，已经搞明白了，就是这个抗体针对的位点含有二硫键，所以所有的western试剂中都不能含有还原剂（如DTT，巯基乙醇等，包括裂解液和上样缓冲液，有些裂解液如果是买公司的，可能公司会加入还原剂）。
因为还原剂会打开二硫键而变成巯基。
所以抗体就不识别了。
蛋白的样品处理方法有3种：还原SDS处理，带有烷基化作用的SDS处理，非还原SDS处理。
还原SDS处理：是常规的SDS—PAGE，在上样缓冲液中加入还原剂，DTT等，打开二硫键，SDS打开非共价键，所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。
带有烷基化作用的SDS处理：烷基可以永久并且牢固的保护巯基，维持单体形成，防止蛋白再次形成二硫键的空间结构。
非还原SDS处理：样品中只加入ＳＤＳ，而不加ＤＴＴ还原剂，此时二硫键不能断裂，所以蛋白没有完全去折叠。
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
>垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=—，下层胶pH＝；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。
在时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
~如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一.实验目的学习SDS-聚丙烯跌胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pl)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点吋，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少.蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺礙胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验釆用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表現出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子董大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，釆用两种缓冲体系；上层胶pH二一，下层胶pH=; Tris—HCI缓冲液中的Tris 用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子：Cl-是前导离子。
在时，缓冲液中的Gly为尾随离子，而在卩日=吋，Gly的解离度增加：这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子拜效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
A B如果在聚丙烯酰胺;疑胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大董的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如疏基乙醇存在下，蛋白质分子內的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物：此时，蛋白质分子上所带的负电荷董远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
SDS-PAGE电泳标准操作规程1、目的建立SDS-PAGE电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。
2.范围与职责适用SDS-PAGE电泳操作岗位。
配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA检查员、生产主管负责监督。
3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。
放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。
3.1.2 分离胶的配置3.1.2.1 10%分离胶配方如下表：3.1.2.2 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。
3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。
静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。
3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。
约30分钟，聚合完全。
3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。
两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。
将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。
倒入1X tris-gly电泳缓冲液。
3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。
对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。
3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质之樊仲川亿创作一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操纵技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质自己带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其自己所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
分歧蛋白质具有分歧的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷分歧，而有分歧的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使分歧的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子概况活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超出蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了分歧蛋白质间所带电荷上的差别。
蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。
蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：M r=K(10-b·m) logM r=LogK—b·R m，式中 M r——蛋白质的分子量；logK——截距；b——斜率；R m——相对迁移率。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
1. 目的：规范蛋白电泳检测操作2. 范围：适用于蛋白电泳检测3. 职责：实验室人员对本操作规程的实施负责。
4. 内容：4.1 稀释取900ul超纯水放入离心管中，再加入100ul样品混合均匀制成稀释液。
另取呈梯度的BSA10ul加入到90ul超纯水中稀释十倍。
4.2 酶解取稀释液20ul置于另外一组离心管中,加入5ul Loading Buffer混合均匀，盖紧离心管盖，沸水浴10min。
4.3 离心完成沸水浴后，置于离心机中13000rpm离心3-5min，离心待用。
4.4 准备电泳取出预制凝胶，撕去底部封条，黑色条朝外放入电泳槽中，加入缓冲液检测是否渗漏，如渗漏则重新安装凝胶。
4.5 加样电泳按照顺序，使用移液枪以及加样枪头将待用样品和BSA依次加10ul到凝胶点样孔中，盖上电泳槽，开启电泳仪，调节电压至80V，开始电泳；半小时后调节电压至120V，继续电泳过程直至电泳条带至凝胶底部。
4.6 后处理取出凝胶，清水冲洗后置于容器中加入染色液，在摇床中50rpm染色1.5h。
染色完成后，倒出染色液，清水冲洗干净后，加入脱色液，在摇床中50rpm脱色30min，然后倾去脱色液，换用新的脱色液重复脱色30min，脱色过程重复三次。
置于观察灯上拍照，利用image处理图片（具体操作见image使用流程）5. 注意事项5.1 预制凝胶底部封条一定要撕去。
5.2 BSA的配制必须精确，必须使用中性缓冲液配制。
5.3 凝胶加样过程必须使用配套加样枪头，使样品下沉。
5.4 电泳缓冲液可重复利用，但建议重复次数不超过三次；染色液也可重复使用，建议重复次数不超过三次。
6．附录6.1 染色液（1L）配制方法考马斯亮蓝R250 2.5g、乙醇400ml、乙酸100ml、水500ml。
6.2 脱色液（500ml）配制方法乙醇50ml、乙酸100ml、水350ml。
6.3 缓冲液配制方法缓冲液制剂一袋溶入1L水中混合均匀。
SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。
放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。
3.1.2 分离胶的配置梳齿下缘约1cm)。
3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。
静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。
3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。
约30分钟，聚合完全。
3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。
两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。
将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。
倒入1X tris-gly电泳缓冲液。
3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。
对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。
3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。
3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。
电压调至约150v保持恒压。
待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。
3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。
3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术------蛋白质分子量测定方法一、不连续体系SDS-PAGE有关试剂1．10%（W/V）SDS溶液：称5g SDS,加蒸馏水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。
SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。
2．1%TEMED(V/V)四甲基乙二胺：取1mlTEMED,加蒸馏水至100ml，置棕色瓶4℃保存。
3．10%AP(W/V):称AP1g,加蒸馏水至10ml，最好临用前配制。
4．样品溶解液：内含2%SDS,5%巯基乙醇，40%蔗糖或10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01 mol/L pH8.0 Tris-HCI缓冲液。
(1) 先配制0.05mol/L pH8.0 Tris-HCI缓冲液：称Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再加入3ml 1 mol/L HCI, 调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。
（2）样品溶解液见下表：5．凝胶贮液：（1）30%分离胶贮液：称Acr 30g, Bis 0.8g 溶入重蒸水中，定容至100ml，过滤后置棕色瓶，4℃保存。
（2）10% 浓缩胶贮液：称Acr 10g, Bis 0.5g 溶入重蒸水中，定容至100ml，过滤后置棕色瓶，4℃保存。
6．凝胶缓冲液：（1）分离胶缓冲液（3.0mol/L pH8.9 Tris-HCI缓冲液）：Tris 36.3 g,用小许重蒸水溶解（或HCI溶解），加1mol/L HCI 48ml，调pH至8.9，加重蒸水定容至100ml, 4℃保存。
(2)浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH6.7 Tris-HCI缓冲液）：Tris 6.0g,用小许重蒸水溶解（或HCI溶解），加1mol/L HCI 48ml，调pH至6.7，加重蒸水定容至100ml, 4℃保存。
7．电极缓冲液（含0.1%SDS,0.05mol/L Tris,0.384mol/L甘氨酸，pH8.3）:Tris 6.0g,甘氨酸28.8g，加入10%SDS 10ml,加蒸馏水溶解定容止1000ml。
SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。
放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。
3.1.2 分离胶的配置梳齿下缘约1cm)。
3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。
静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。
3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。
约30分钟，聚合完全。
3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。
两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。
将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。
倒入1X tris-gly电泳缓冲液。
3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。
对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。
3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。
3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。
电压调至约150v保持恒压。
待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。
3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。
3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0批准：年月日生效日期：年月日文件分发部门：GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测一目的保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。
二范围用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。
三责任质量控制部人员。
四内容1试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
2 溶液的配制2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。
贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。
2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。
贴上标贴，室温储存。
2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。
贴上标贴，避光4℃保存。
2.4D液:1%SDS称取2gSDS(分析纯),用超纯水溶解至200 ml.贴上标贴，4℃保存。
2.5E液:10%过硫酸铵GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：称取10g过硫酸铵(分析纯)，用超纯水溶解至100 ml，以1ml/支分装，贴上标贴，－20℃保存。
2.6 4%碳酸钠溶液：称取20g无水碳酸钠, 加水450ml, 搅拌，使完全溶解，并定容至500ml。
贴上标贴，室温储存。
此溶液有效期为三个月。
2.7F液:TEMED(市售)2.8电泳缓冲液(5X)称取75g Tris碱(分析纯)，360g甘氨酸(分析纯)，25gSDS(分析纯)，加超纯水溶解，调pH至8.3，定容至5L，贴上标贴，室温储存。
临用前加超纯水稀释5倍使用。
2.9、样品缓冲液2.9.1 4X样品缓冲液（还原性）称Tris3.03g，溴酚蓝20mg，SDS 8g，盐酸1.89ml，甘油40ml，加超纯水溶解定容至100ml，再加20ml巯基乙醇（分析纯）贴上标贴，室温储存。
2.9.2 4X样品缓冲液（非还原性）称Tris3.03g，溴酚蓝20mg，SDS 8g，盐酸1.89ml，甘油40ml，加超纯水溶解定容至100ml，贴上标贴，室温储存。
2.10 银染试剂（注：银染试剂配制所使用的超纯水均为两次过滤的无热源水）2.10.1 固定液：量取500ml甲醇(分析纯)，120ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水至1000 ml, 贴上标贴，室温储存。
2.10.2 漂洗液：量取乙醇100ml（分析纯），500ml冰醋酸（分析纯），加超纯水至1000ml，室温储存。
2.10.3 辅染液：称取重铬酸钾10g，量取硝酸2ml，加适量水溶解并稀释至200 ml，用前40倍稀释。
贴上标贴，室温储存。
2.10.4 银染液：现配现用。
称取2.04g硝酸银，加超纯水溶解定容至1000ml。
2.10.5 显影液：称取30g碳酸钠(分析纯)，加超纯水溶解定容至1000ml, 贴上标贴，室温储存。
2.10.6 终止液：10ml冰醋酸，加水稀释至1000ml。
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：2.11 考马氏亮蓝染色试剂2.11.1 考马氏亮蓝染色液：称取1g考马氏亮蓝R-250(分析纯)，200ml甲醇(分析纯)，50ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水溶解定容至500ml，搅拌4h，滤纸过滤，贴上标贴，室温储存。
（见溶液配制记录）染色液需回收利用，使用周期依染色效果定。
2.11.2 考马氏亮蓝脱色液：量取400ml的甲醇，100ml冰醋酸(分析纯)，加超纯水溶解至1L，贴上标贴，室温储存。
脱色液使用后回收至装有活性炭的瓶中，滤过后可重复利用，使用周期依脱色效果定。
3 器皿与耗品：所有玻璃器皿为清洁级；tube、tip一次性使用；微波炉盒。
4 仪器设备：电泳仪电源（200--600V）；电泳槽；灌胶模具；染色具；脱色摇床；微波炉；凝胶成像仪。
5 环境要求：相对洁净环境，室温。
6 标准品（or 对照品）：标准品：市售分子量标准蛋白，按说明书分装后-20℃保存。
《标准品分装与使用记录》6.1 标准品验证6.1.1 标准品按说明书分装，储存，对标准品进行SDS-PAGE电泳；分装要填写分装记录《电泳标准品制备及检定》。
6.1.2 相对迁移率Rf =蛋白带迁移距离/溴酚兰迁移距离；6.1.3 用每个蛋白标准分子量的对数(纵坐标)对它的相对迁移率(横坐标)作图,得一条直线,两者线性关系>0.98,方可用作电泳分子量测定。
7操作步骤：7.1制胶GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：7.1.1制备分离胶：（15ml二块凝胶的量）凝胶种类分离胶浓缩胶凝胶浓度7.5% 10% 12.5 % 15% 17.5％ 4.5％试液/ml 超纯水 6.09 4.97 3.39 2.37 0.97 4.393 30%丙烯酰胺 4 5.4 6.7 8 9.4 1.35 1.5MTris·HCl pH8.8 4 4 4 4 4 ――0.5MTris·HCl pH6.8 ―― 2.25 1%SDS 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 0.9 10%过硫酸胺0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.07 TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.0077.1.2制备浓缩胶：待分离胶聚合（约半小时）后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，避免气泡出现。
7.2样品：7.2.1样品处理：7.2.1.1原液、半成品、成品：以H2O/PBS/生理盐水稀释样品至适当浓度，还原电泳2～3μg/孔上样，非还原电泳10μg/孔上样。
7.2.1.2发酵样品：若是上清，取上清30μl+30μl加样缓冲液，混匀，15μl上样；若是菌体，以H2O/PBS/生理盐水混匀菌体，使其OD在15之间，取菌液30μl+30μl加样缓冲液，混匀，15μl上样。
7.2.1.3纯化样品：取样品30μl+30μl加样缓冲液，混匀，15μl上样。
注：还原电泳，样品上样前需100℃煮5分钟。
7.2.2 Marker ：考染10μl上样，银染5μl上样。
7.3加样：将浓缩胶聚合后拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加入处理好的样品5μg（银染）或10μg以上（考马氏亮蓝染色）。
7.4电泳：接通电源，先恒压100V开始电泳，至待检样品进入分离胶后将电压调至150V，直至溴酚兰至胶底部，电泳结束。
注：恒流或者恒压均参考仪器说明书。
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：7.5染色脱色：(根据具体需要，选择9.5.1或9.5.2)7.5.1考马氏亮蓝法7.5.1.1染色：将电泳后的凝胶取下，浸入染色液中，微波炉加热1min避免沸腾，在摇床上染色45min左右；时间可根据染液配制的时间稍加长短；7.5.1.2、脱色：将凝胶自染色液中取出，浸入脱色液中，微波炉加热1min避免沸腾，直至凝胶底色近于无色为止，并将凝胶保存在凝胶保存液中进行胶扫描、拍照再做干胶。
用过脱色液需回收。
7.5.2、银染法（超纯水为两次过滤的无热源水）除另有规定外，银染法一般不用于定量实验，做定性实验时，上样量可以适当增加。
7.5.2.1固定：将电泳后的凝胶取下，浸入固定液中过夜；7.5.2.2漂洗：用漂洗液漂洗3次（温度应不低于25度），每次10分钟；7.5.2.3辅染：将胶浸泡在辅染液中7~10分钟；7.5.2.4清洗：倒去辅染液，用超纯水，清洗3次，每次2min（在清洗之前胶被固定液和辅染液泡过后有大量有机溶剂残留，与水不能很好的溶合在一起，要用超纯水漂洗去多余的有几溶剂让胶看上去能和水的溶合在一起）；7.5.2.5银染：倒去超纯水，将浸洗后的胶浸于银染液中，置较强日光或类似光源下照射30分钟，再于室内光线下放置20分钟；7.5.2.6清洗：用超纯水清洗2次，每次1分钟；7.5.2.7显色：倒去超纯水，将胶浸入显色液中，每隔2分钟换液一次，直到条带显色完全；7.5.2.8终止：将胶浸于终止液中10分钟；7.5.2.9保存：将终止好的凝胶保存在超纯水中。
8拍照与存档8.1拍照并制备干胶：对湿胶进行拍照，每次照片尺寸一致，照片与胶的点样面一致，拍好后制备干胶，剪两块比配胶板稍大的玻璃纸，把一块放在配胶板上，在清水冲洗下赶去汽包，把湿胶放在上面，盖上另一块玻璃纸，赶去气泡，夹好框架，晾干即可，做GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：干胶24小时内完成。
8.2存档：电子版的胶图按项目归档，并对干胶进行编号，按拍照日期编号，如2008年2月3号拍的第一张胶，则编号为：20080203-01，照片与干胶编号一致，保证两者号码同一，编号后放入胶册并登记。
9分析：9.1非还原电泳凝胶经扫描进行纯度分析；还原电泳凝胶中分子量标准，经扫描获得分子量标准曲线，计算样品的分子量。
9.2分子量标准蛋白（MARKER）条带不清，样品过浓或过淡需重做。
9.3分子量标准蛋白（MARKER）条带不清，样品过浓或过淡需重做。
9.4照片若是不规范，则重拍。
9.5遇到问题及处理9.6.1拖尾，纹理现象：需离心或降低胶浓度；9.6.2蛋白带过宽：加样过多或泄漏。
10注意事项10.1丙烯酰胺有毒性，配胶时需戴手套，处理废液时加一定量SDS，等丙烯酰胺溶液凝聚后才能扔弃，不能直接把丙烯酰胺溶液倒入下水道；10.2蛋白质与SDS(浓度>1mmol/L)结合重量比1:1.4,为充分结合重量比为1:4或1:3，B-ME终浓度为4-5%；。
