常用的组织固定液及配制

1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。

幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。

若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。

若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。

久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。

此液又可作保存液。

固定时间最多10h。

如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 50%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定24h，可长久保存。

3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方Ⅰ：纯酒精3份+ 冰醋酸1份配方Ⅱ：纯酒精6份+ 冰醋酸1份+ 氯仿3份适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。

固定时间不宜过久。

4. 酒精-福尔马林固定液福尔马林2~6（6~10）ml + 70%酒精100ml固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。

通常固定24h，亦可长久保存。

5. 酒精-福尔马林-甘油固定液95%酒精150ml + 5%福尔马林100ml + 甘油50ml此液也可长期储存材料。

6. 铬酸-醋酸固定液根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方：（1）弱液配方：10%铬酸2.5ml + 10%醋酸5ml + 蒸馏水92.5ml（2）中液配方：10%铬酸7ml + 10%醋酸10ml + 蒸馏水83ml（3）强液配方：10%铬酸10ml + 10%醋酸30ml + 蒸馏水60ml弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。

固定时间较短，一般为数小时，最长可固定12~24h，但藻类和蕨类的原叶体可缩短到几分钟至1h。

常用固定液的配制常用固定液的配制1. 福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%~40%甲醛)5ml可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。

幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材料收缩。

若材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林。

若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。

久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。

此液又可作保存液。

固定时间最多10h。

如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml + 冰醋酸6ml + 福尔马林5ml2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 70%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定8~24h，可长久保存。

3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方Ⅰ：纯酒精3份+ 乙酸1份配方Ⅱ：纯酒精6份+乙酸1份+ 氯仿3份配方Ⅲ：甲醇6份+乙酸1份+ 氯仿3份适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。

固定时间不宜过久。

4. 酒精-福尔马林固定液福尔马林2~6（6~10）ml + 70%酒精100ml固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。

通常固定24h，亦可长久保存。

5. 酒精-福尔马林-甘油固定液95%酒精150ml + 5%福尔马林100ml + 甘油50ml此液也可长期储存材料。

6. 铬酸-醋酸固定液根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方：（1）弱液配方：10%铬酸2.5ml + 10%醋酸5ml + 蒸馏水92.5ml（2）中液配方：10%铬酸7ml + 10%醋酸10ml + 蒸馏水83ml（3）强液配方：10%铬酸10ml + 10%醋酸30ml + 蒸馏水60ml弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。

固定时间较短，一般为数小时，最长可固定12~24h，但藻类和蕨类的原叶体可缩短到几分钟至1h。

病理组织常用固定液的配制（免疫组化）一、常规固定液的配制（1）10%甲醛液浓甲醛 10ml蒸馏水 90ml(2 ) 缓冲中性甲醛液浓甲醛10mlPBS缓冲液（Ph7.2）90ml(3 ) 10%中性甲醛液浓甲醛10ml蒸馏水90ml碳酸钙加至饱和(4 ) Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液75 ml甲醛2 ml冰醋酸5 ml该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用，而甲醛对组织有收缩作用，两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用，使组织固定达到优良的固定水平。

（5）醛糖钙固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸钙20g蒸镏水90ml先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。

该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。

当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。

从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对lgA ，lgM，J链，K 链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。

但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭抗原。

固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。

（6）Zenker氏固定液：重铬酸钾25g升汞50g蒸馏水1000ml冰醋酸50ml先将重铬酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铬酸钾，应用热水或加温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中，如暴露于空气中，该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深，导致失效。

临用时，取贮存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。

应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h，取出组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。

应用该固定液的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。

石蜡切片组织固定与包埋
1. 配制或准备组织固定液。

固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。

固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。

我们一般在10ml 试管中盛放8ml 固定液。

10% Neutral Buffered Formalin (最常用的)
固定液种类
Bouins fixative （picric acid ：formalin ：Acetic Acid =15：5：1）
2. 剪取小鼠组织或器官，务必要保证其完整性，然后放入对应固定液中固定24h （4操作要迅速，防止组织收缩变形，并发生自溶现象）。

3. 蒸馏水冲洗3次。

4. 脱水
可4℃过夜或更长
) 80%EtOH 90%EtOH 5.
透明
Xylene ：
6.
浸蜡
Xylene ：
7. 包埋
8. 石蜡切片。

常用固定液的性质、用途和配置1．单一固定液的性质和用途（1）乙醇（C2H5OH）（ethylalcohol）：又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后者易溶于水，所以经酒精固定的标本对细胞核染色不良。

酒精可溶解脂肪、类脂体，所以不能用酒精固定脂肪。

酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖经酒精固定后不能在低于70％酒精中保存。

单独固定使用酒精的浓度应为95—100％。

无水酒精渗透力较差，并且能使组织收缩，在与醋酸、氯仿混合使用时，可增强它们的穿透力。

酒精除固定作用外，还具有硬化和脱水的作用，固定后的组织可保存于70％酒精中，所以酒精在制片过程中用途很大。

无水乙醇容易挥发，又容易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧，为了吸去其中水分，最好在无水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。

酒精是一种还原剂，不能与重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合使用。

（2）甲醛（HCHO）（formeldehyde）：是一种气体，溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林，一般使用浓度为10％福尔马林（formalin）液，其配法是取市售的甲醛液10ml 与90ml 蒸馏水混合即可，实际上其含量只有4％甲醛。

这样的配法已成为一般实验室常用的惯例。

甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。

它是一种应用广泛，使用简单的固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定及保存。

尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。

更适于病理组织的制片及大体积标本的保存，一般组织需固定24 小时以上，固定后的组织可移入50％酒精中逐步脱水。

甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合，因极易被氧化为甲酸。

在配混合固定液时，如海利氏液等需临用前再加入，24 小时后失效。

甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀，在高温下又成为甲醛。

不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。

所以在备用的福尔马林中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。

附录一显微鉴定及显微化学反应常用试液的配制方法1．水合氯醛试液：取水合氯醛50 g，加蒸馏水l 5m1与甘油10m1使溶解，即得。

此为常用的透化剂，能使细胞组织透明清晰，能溶解淀粉粒，蛋白质。

挥发油、树脂、叶绿素等，但不溶解草酸钙或碳酸钙晶体等．它亦有使皱缩的细胞膨胀而恢复原状的作用。

2．稀甘油试液：取甘油33ml，加蒸馏水10ml，再加樟脑少许或液化苯酚1滴，即得。

本品为临时切片的常用封藏液之一。

经水合氯醛透化的显微标本滴加稀甘油封藏，可防止水合氯醛结晶析出而避免干扰观察。

3．甘油醋酸试液(斯氏溶液)：取甘油、50％醋酸、蒸馏水各等分，混合，即得。

此为常用的一种封藏剂，能在较长时间内保持淀粉粒的形状、大小，防止淀粉粒崩解，以便于显微观察和测量大小．4．间苯三酚试液：取间苯三酚1g，加95％乙解100ml使溶解，即得。

置棕色瓶内，在暗处保存。

样品加本试液2—3分钟后，再加浓盐酸或浓硫酸1滴，木质化细胞壁显红色，红色的深度与木质化的程度有关。

5.苏丹Ⅲ试液：取苏丹Ⅲ0.01g加90％乙醇5m1，溶解后，加甘油5m1，摇匀，即得。

应置棕色瓶中保存，在2个月内应用。

此液能使木栓化或角质化的细胞壁及脂肪油树脂等染成红色或桔红色。

6．氯化锌碘试液：取碘化钾8g，加水8.5ml使溶解，再加无水氯化锌2.5g溶解后，加适量碘使达饱和状态，即得。

本试液置棕色玻璃瓶内保存。

用于鉴别纤维素细胞壁和木化细胞壁，前者显蓝色或蓝紫色，后者呈黄色或棕色。

7．铜氨试液：取硫酸铜0.5g，加蒸馏水适量，置乳钵中研磨，再加浓氨水10ml 使溶解，即得。

本试液在使用时配制，贮存时间一般不得超过2个月。

能使纤维素细胞壁染成浅蓝色，并逐渐膨胀而溶解：半纤维素细胞壁与纤维素细胞壁反应同，但前者遇水强烈膨胀。

8．稀碘液：取碘化钾0.5g溶少量蒸馏水中，加碘lg，溶解后加水至100ml，即得，使用时，通常还要稀释至谈棕色或淡棕黄色。

置棕色玻璃瓶内保存。

缓冲液及组织固定液的配制1、磷酸盐缓冲液的配制关于缓冲溶液PB的配制，好多参考书如生物技术实验的后面均附有缓冲溶液的配制配方，可以根据需要配制pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲。

磷酸盐缓冲液称简PB，加NaCl（氯化钠）的称PBS，加KCl（氯化钾）、NaCl（氯化钠）的称KPBS。

S就是指氯化钠的含量，一般为0.85％，即是100ml里面加0.85克，这个时候的PBS的浓度是0.1M的。

一般在免疫组化洗涤中采用0.01M的PBS，pH7.0～7.4。

我们在实验中直接将0.1M的稀释十倍，即可。

最好能现配现用。

母液4℃可以保持1～2周，影响不大。

成份分子量（MW）浓度（g/1000mL）0.01M PBS①0.1M PBS0.1M PBNa2HPO4·12H2O 358.14 2.684 29.009 29.009NaH2PO4·2H2O 156.01 0.39 2.964 2.964NaCl 58.44 8.5 8.5~9 /pH值/ 7.4 7.4 7.4注：①配方来自网上。

2、组织固定液的配制2.1、4%多聚甲醛-0.1M磷酸缓冲液[1]（pH=7.3）：多聚甲醛40g，置于三角烧瓶中，加入500~800mL 0.1M的磷酸缓冲液（PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至粉末完全溶解，通常需要滴加少许1N NaOH才能使溶液澄清，最后补足0.1M PB至1000mL，充分混匀。

该固定试剂适用于光镜免疫细胞化学研究，因较温和，适用于组织标本的较长期保存。

2.2、10%中性缓冲福尔马林固定液[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，蒸馏水900mL，NaH2PO4（磷酸二氢钠）4g，Na2HPO4（磷酸氢二钠）6.5g，混合摇匀后调pH至7.2~7.4。

2.3、10%福尔马林固定液配制[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，自来水900mL，混合后在溶液中加入碳酸钙使溶液呈中性或偏碱性。

一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。

在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。

1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。

该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。

另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。

2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4•2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。

注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。

B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。

该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。

该固定剂较温和，适于组织的长期保存。

组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。

3．Bouin's液及改良Bouin's液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。

细胞固定及常用的固定液•取材后的组织需立刻投于固定剂中–固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；–对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

•常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。

其固定原理不同，各有优缺点。

–醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）–醇类（常用乙醇）–其它（丙酮）(1) 醛类•甲醛(福尔马林)应用最广–原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

–优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。

–缺点：•甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；•醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；•分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果。

–注意事项：• C)，为此组织块不宜过厚。

缩短固定时间，降低固定温度•改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

•固定后充分水洗以减少分子间交联。

•切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

•戊二醛：–穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

•多聚甲醛(常用4%)：–可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。

•主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

(2) 醇类•最常用的醇类固定剂是乙醇。

–其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

–优点：穿透性强、抗原性保存好。

–缺点：•脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

•乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

(3) 其它固定剂•丙酮：–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。