动脉粥样硬化性心血管病的遗传学和基因组学研究
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动脉粥样硬化性心血管病的遗传学和基因组学研究
第4章-动脉粥样硬化性心血管病的遗传学和基因组学研究
动脉粥样硬化性心血管病（cardiovascular disease，CVD）是由多个基因及环境因素相互作用所致的常见复杂性疾病。除了传统危险因素如年龄、高血压、血脂异常、吸烟及糖尿病等，疾病易感基因、修饰基因和环境危险因素共同作用影响着动脉粥样硬化的发生发展，不符合孟德尔遗传规律。“常见疾病，多个易感基因，微效作用”理论提出个体的易感基因遗传变异可能大大增加CVD的发病风险。近年来分子生物学的快速发展为CVD的早期诊断和危险分层提供了广阔前景，从基因层面找到疾病发生的关键分子靶点，据此设计（基因）相关药物，逐步实施病因治疗，根据个体遗传变异导致的对危险因素与药物反应的差异，提出个性化的预防、治疗方案，建立个体化医学模式，使困扰人类的心血管疾病能够得到有效的预防、诊断和治疗是后基因组时代生命科学的憧憬。然而遗传学和基因组学研究能否跨越传统的心血管危险因素，成为临床实践中心血管疾病诊断和危险分层的基本临床依据，尚需要跨越多个挑战。本文论述了近年来动脉粥样硬化性心血管疾病，尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary
heart disease, CHD）的遗传学及基因组学研究现状和进展，以期促进遗传学和基因组学转化为临床实践的步伐。
一、动脉粥样硬化性心血管病的遗传学研究
遗传度＞20%的表型具有明显的遗传倾向。CHD的家族聚集性已在大量流行病学和前瞻性队列研究中得到证实[1，2]，动脉粥样硬化的中间表型如颈动脉内中膜厚度（carotid intima-media thickness，IMT）以及冠状动脉和主动脉壁的动脉粥样硬化程度也同样具有遗传性，颈动脉IMT的遗传度约为38%，冠状动脉钙化的遗传度为42%，腹主动脉钙化的遗传度为49%[3]。因此，近20年来遗传学研究致力于寻找CHD等动脉粥样硬化性心血管病的遗传致病/易感基因，确定这些致病/易感基因有利于确定治疗靶点和早期危险分层。传统的遗传学研究主要运用候选基因策略进行遗传连锁分析研究和关联研究。 1.动脉粥样硬化性心血管病的遗传连锁分析 连锁分析研究（genetic linkage analyses）是患病家系的疾病表型是否与遗传标记(如微卫星序列)连锁，在连锁的基因组区域筛查出致病基因。运用连锁分析已经非常成功地筛查出单基因心血管病如肥厚型心肌病等的致病基因，但是对具有复杂性状的多基因疾病进行遗传连锁分析时往往会受到多种因素的影响，如不同位点的基因间相互作用，致使某一遗传性状不能表现出来（称为“上位效应”，epistasis)、不同发病年龄、不完全外显率（指某一基因型个体显示其预期表型的比率；如，某基因突变导致心肌病，而实际100个携带此基因突变者，只有90个发病，此外显率为90%）、遗传异质性：多个致病基因位点导致相同的表型，相同基因突变导致不同的临床表型；修饰基因，遗传与环境相互作用、遗传模式、表现型比率及诊断不明确等，因此，运用连锁分析研究多基因疾病受到一定程度的限制。
迄今为止，研究者已在7个心肌梗死和亚临床动脉粥样硬化的大家系中进行了全基因组遗传连锁分析，与动脉粥样硬化性心血管病紧密连锁的基因座被定位在染色体1、2、3、13、14、16和X染色体，然而尚无任何一个染色体基因座能够在多个不同人群中得以重复验证。近年有研究者利用高度多态性微卫星标记对多个家系进行了全基因组遗传连锁分析，将连锁区域定位在染色体13q12-13，然后通过单核苷酸多态性位点（single nucleotide acid polymorphism，SNP）对该区域进行精细扫描，发现编码5′-脂氧合酶激活蛋白的基因ALOX5AP与心肌梗死和脑卒中显著相关。该蛋白在单核细胞、巨噬细胞等表达，通过刺激白三烯等炎性物质分泌，促进血管壁动脉粥样硬化的发生发展。
尽管ALOX5AP基因变异与心肌梗死和脑卒中的相关性已在多个人群中重复，但在前瞻性研究队列中未得到证实[3]。对颈动脉IMT的全基因组连锁扫描分析发现，染色体12与IMT显著相关，该区域的清道夫受体B1（scavenger receptor class B，member 1，SCARB1）可能是参与动脉粥样硬化发病机制的重要基因，但该结果同样未能在其他研究队列中得到验证[3]。总之，全基因组遗传连锁分析为CHD提供了一些相关遗传易感基因证据，但由于可重复性差，统计效能低，运用微卫星标记不能定位具体的致病基因区域等缺陷，运用该方法研究动脉粥样硬化性心血管病具有很大的局限性。
2.动脉粥样硬化性心血管病的候选基因关联研究 候选基因的关联研究是基于假说为导向，根据疾病已知的病理生理机制，选择生理调控或致病通路上的候选基因，通过比较病例组和对照组（与病例组年龄、性别等匹配）之间的遗传变异频率差异，确定与疾病相关联的遗传变异。与遗传连锁分析方法比较，候选基因关联分析是寻找复杂性疾病遗传危险因素的有效方法，尤其那些设计具有足够检验效能的关联研究很有价值。
在过去的10～15年中，大量研究通过候选基因关联研究策略在寻找CHD相关SNP。目前有大量的心血管病候选基因关联研究，但仅有少数基因多态与CHD的相关性在多个人群中得到一致结果。结果重复性差的原因包括以下几点[3]：
(1）遗传异质性，例如不同的遗传多态导致CVD。
(2）不同研究人群之间的遗传连锁不平衡模式不同。例如致病基因变异在某一人群中与一个常见遗传标记SNP紧密连锁呈共分离，我们将一条染色体上两个或两个以上与致病基因密切连锁的多态性位点状态的组合叫做染色体单体型。由于各位点紧密连锁，所以在遗传时，单体型可作为一个单位传给后代。如果致病基因变异在另一人群中与该标记SNP不连锁，就将导致研究结果不一致。
(3）样本量小，缺乏足够的统计学效力。由于复杂性疾病的遗传危险因子仅发挥微效作用，与疾病的相对危险度（odds ratio，OR）通常为1.20～2.0，需要有足够大的样本量才能发现致病基因变异。以OR为1.3为例，若少见等位基因频率为10%，所需的病例数至少为2000例。
（4）人群分层现象通常会导致关联假阳性，即病例对照人群分别来自遗传背景不同的群体，如果其遗传背景不匹配，基因变异与疾病的阳性相关就可能是由于基因的频率分布在病例和对照组不均衡而导致的假阳性相关。 造成结果重复性差的其他原因还包括环境因素的混杂效应和表型异质性，例如某遗传因子可能仅对某些类型的CVD有作用，而不影响其他CVD表型。
由于基因变异通常与复杂性疾病呈弱相关，单纯的基因型产生的效应很低[4]，只有1.12～1.75。荟萃分析可提供足够的统计学效力。有一些基因变异已经被荟萃分析证实增加CHD危险，如APOE基因，编码3个异构体，其常见的基因多态与血脂水平和CHD危险密切相关[5]。对CHD候选基因关联研究进行的荟萃分析结果得到的基因型效应同样不高，OR值在0.8～1.34之间。已有的荟萃分析报道了ApoE，血浆蛋白激活剂抑制因子-1（PAI-1），血管紧张素转化酶（ACE），和亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR）等。然而荟萃分析也有其局限性，包括发表偏倚、人群分层、基因分型无盲法、对照选择偏倚、基因分型错误等。该方法不能很好地反映各研究设计的差异，如病例对照研究、前瞻性队列研究和临床试验研究；各个关联研究的表型定义不完全一致；以及不同环境危险因素的校正会导致疾病的遗传易感性程度不同。因此，即使荟萃分析总结的OR有统计学意义，解释仍需谨慎[6]。
二、动脉粥样硬化性心血管疾病基因组学研究进展
自2000年6月人类基因组草图绘制完成，人类基因组计划已成为生命科学发展的主线，2002年，旨在研究人类染色体上SNP的人类基因组单体型图谱计划（Hapmap）启动；2003年，旨在鉴定人类基因组功能元件的百科全书（ENCODE）计划启动，旨在绘制人类基因组甲基化可变位点图谱的表观基因组图谱计划启动；2008年，千人基因组计划启动，以对27个不同族群2500人的基因组测序，绘制更为精确的遗传多样性图谱。Hapmap计划成功的确定了数十万个SNP和连锁不平衡（LD）信息，只需确定整个基因组的0.008%的SNP就可以覆盖整个基因组[7]。基因分型技术和基因测序技术也迅速发展，目前高密度基因芯片通常包括≥500K SNPs，可覆盖人类基因组的大部分（95%），且成本大大降低。人类基因组计划10年来的相关研究成果，既带动产生了许多与各种生物大分子或小分子相关的“组学”，如蛋白质组学（proteomics）、转录组学（transcriptomics）、代谢组学（metabolomics）等，也修正了先前对于基因、遗传信息传递法则、基因调控等基本概念的认识。分子生物学时代，基因被定义为具有遗传功能的DNA片段。但近年来研究证实微小RNA（MicroRNA）可以直接影响DNA的转录，拷贝数变异(copy number variations，CNV)也可影响基因的表达水平；表观遗传学研究也证实基因的表达不仅仅依赖于DNA序列，环境因素同样不可忽视。
心血管疾病的基因组学研究也取得了重大进步，全基因组关联研究（whole-genome association studies，GWAS）已成为研究常见复杂疾病遗传易感性的主要手段，成功发现了许多先前从未认识的CHD危险相关基因位点。随着GWAS研究和基因组学技术的发展，后GWAS研究逐渐兴起，除了非编码区基因功能的研究，后GWAS研究领域包含了MicroRNA、拷贝数变异（copy number variations），端粒长度（telomere length）检测等近年来基因组学的研究热点，从不同角度揭示了动脉粥样硬化性心血管病的发病机制和潜在的治疗靶点。
1.全基因组关联研究（GWAS） GWAS同样基于病例对照研究，但不同于候选基因研究策略，是无预设假说研究(hypothesis free)。该技术通过对大规模的群体（病例/对照）DNA样本进行全基因组高密度遗传标记（如SNP）进行分型，从而在全基因组层面上寻找与复杂疾病相关的遗传因素，是目前人类寻找杂疾病易感基因最有效的方法之一。第一个GWAS研究利用100K SNPs芯片发现补体因子（complement factor H，CFH）的常见遗传变异与肌退化病相关，该结果被重复验证[8]。随后成功进行的多个GWAS研究为寻找鉴别CVD的易感基因变异提供了坚实基础。
在过去的几年中GWAS研究确定了许多新的CHD危险基因。2007年，先后有4个独立的研究小组通过GWAS发现染色体9p21.3区域与CHD或心肌梗死相关[9～12]，随后在多个人群包括美国、德国、英国、瑞典等白人以及日本、韩国、中国等亚洲人群中重复验证[13]。其中相关性最高的两个SNP是rs10757274和rs1333049，这两个SNP具有非常强的连锁不平衡，随后的荟萃分析显示这两个SNP都在白人中与CHD强相关[14]，而且病例对照研究和前瞻性研究中危险效应相似[15]。与CHD相关的染色体9p21.3区域长53kb，包括两个细胞周期依赖的激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor）CDKN2A和CDKN2B，编码蛋白p16INK4a、p15INK4b和ARF。这些基因调控细胞周期、细胞衰老和凋亡等，通过转化生长因子-β诱导的抑制作用与动脉粥样硬化的病理机制密切联系。然而关联度最高的rs1333049 SNP距离CDNK2B调控区约30kb，也未发现CDKN2A和CDKN2B的基因调控区和编码区有与CHD相关的遗传变异，迄今为止的研究结果提示该区域这种染色体背景的基因易发生致病突变，但影响心肌梗死和CHD发病风险的分子遗传机制尚待阐明。GWAS研究还确定了其他CHD相关位点（表4-1）[15]，还有一些基因位点似乎并不影响任何传统心血管危险因素。GWAS研究确定的基因位点的危险效应（1.2～1.6）与候选基因策略的荟萃分析得到的效应结果相似[4]。通常GWAS研究确定的基因位点应在候选基因关联研究中重复或应用荟萃分析验证。《自然》（Nature）杂志2010年8月5日刊登了一篇GWAS研究[16]，通过全基因组扫描发现了与血液中胆固醇和甘油三酯的水平有关的95个基因位点，其中59个是先前从未发现过的新位点。其中几个新位点不仅与血脂水平相关，而且与CHD危险相关。该研究根据GWAS结果，利用小鼠模型确定了几个新基因GALNT2、PPP1R3B和TTC39B。该研究体现了GWAS研究的典型优势。
