特异性DNA片段的PCR扩增 1. PCR扩增出的基因组片段 2. cDNA
化学方法人工合成的DNA片段
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实验原理 关于外源DNA片段与载体 的连接重组
采用由Hind III切割开的pUC19 质粒,以及由Hind III切割PCR
片 段 , 用 T4 噬 菌 体 DNA 连 接 酶 将 PCR 片 段 与 切 割 开 质 粒 DNA 片 段 重 新 连 接 成 一 个 环 状 的 DNA 分 子 , 即 把 目 的 基 因 DNA 插 入 质 粒 DNA , 实 现 质粒重组。
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➢ 限制性内切酶(restriction endonuclease)指能识别碱基构成特异的 一段(4~8 bp)双链核酸序列,并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的 一种蛋白酶。
➢ 每种酶有特异的识别核酸序列,称为酶切位点,一般为回文序列。 ➢ 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团
2. 加入2 μl质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3. 42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分 钟。
4. 向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。
转化用的质粒, 无菌1.5mL的eppendorf管
仪器
恒温摇床, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 电热恒温培养箱, 超净工作台, 微量移液枪
试剂
LB固体和液体培养基, 氨卞青霉素
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操作步骤
1. 从-70℃冰箱中取100μl(或50 μL)感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解 冻后立即置冰上。