实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。

在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。

由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。

该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。

[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。

(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。

(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。

(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。

H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。

之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。

冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。

待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。

使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。

因此在使用前应进行标定。

蛋白质含量的测定方法蛋白质是生物体内重要的营养成分，对于人体的生长发育和健康维护起着重要的作用。

因此，准确测定食品、药物、生物样品中的蛋白质含量，对于保障食品安全和科学研究具有重要意义。

本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，供大家参考。

首先，常用的蛋白质含量测定方法之一是比色法。

比色法是通过蛋白质与某种试剂发生化学反应，产生有色产物，再利用光度计测定产物的吸光度来间接测定蛋白质含量。

其中，最常用的试剂是布拉德福试剂和伯尼斯试剂。

这种方法操作简便，测定结果准确，因此被广泛应用于食品、生物样品的蛋白质含量测定。

其次，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是比浊法。

比浊法是通过蛋白质与某种试剂发生沉淀反应，根据沉淀的浑浊度来测定蛋白质含量。

常用的试剂有硫酸铵和三氯乙醛。

比浊法操作简便，成本低廉，适用于大批量样品的测定。

另外，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是氨基酸分析法。

氨基酸分析法是通过水解蛋白质，然后利用色谱仪或氨基酸分析仪测定水解产物中各种氨基酸的含量，从而计算出蛋白质的含量。

这种方法对于蛋白质的成分分析非常准确，但操作复杂，需要专业设备和技术支持。

最后，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是生物素标记法。

生物素标记法是将生物素标记在蛋白质分子上，然后利用生物素与酶的特异性结合来测定蛋白质含量。

这种方法对于高灵敏度的蛋白质测定非常有效，但需要专门的标记试剂和设备支持。

总之，蛋白质含量的测定方法有很多种，每种方法都有其适用的场合和特点。

在实际应用中，需要根据样品的特点和实验条件选择合适的测定方法，以确保测定结果的准确性和可靠性。

希望本文介绍的几种常用方法能够为大家在蛋白质含量测定方面提供一些帮助。

植物生理学实验考试试题一、名词解释：1、标准曲线：用标准溶液制成的曲线。

先配制一系列不同浓度的标准溶液, 在溶液吸收最大波长下, 逐一测定吸光度,然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标作图, 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律, 必然得到一条通过原点的直线, 即标准曲线。

4、氮素代谢：氮素及含氮的活体物质的同化异化和排泄，总称为氮素代谢。

5、淀粉酶：是水解淀粉和糖原的酶类总称。

6、真空渗入：指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。

7、离心技术：是根据物质颗粒在一个离心场中的沉降行为而发展起来的。

它是分离细胞器和生物分子大分子物质必备的手段之一，也是测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。

8、电泳：各种生物大分子在一定pH 条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳。

9、同工酶：凡能催化同一种化学反应但其分子结构和带电性质不同的一组酶称为同工酶10、迁移率：指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。

11、聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。

20、超氧化物歧化酶（SOD）：普遍存在动植物体内的一种清除超氧阴离子自由基Ｏ2 的酶。

21、硝酸还原还原酶：是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸。

22、诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，但在特定外来物质的诱导下诱导生成的酶。

如硝酸还原酶可为NO3-所诱导生成。

二、填空：1、测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是标准蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标。

2、常用的测定植物可溶性蛋白质含量的方法有：Folin-酚试剂法(Lowry 法) 、双缩脲法、考马斯亮蓝法和紫外吸收法。

植物生理学实验教案实验指导书：候书林主编. 植物生理学实验指导.科学出版社，2004 实验一、植物组织渗透势测定-质壁分离法实验二、植物组织水势测定-小液流法实验三、叶绿体色素的提取与分离及理化性质鉴定实验四、叶绿素a,b 含量测定实验五、植物体内几种呼吸酶的测定实验六、植物叶面积测定实验七、植物根系对离子的选择性吸收实验八、叶片光合速率的测定及光合仪的使用实验九、种子活力的快速测定实验十、植物组织可溶性糖含量的测定实验十一、低温对植物的伤害实验十二、丙二醛含量的测定实验一、植物组织渗透势测定-质壁分离法[原理]将植物组织置于对其无毒害的一系列不同浓度的溶液里处理一定时间，然后镜检发生质壁分离的细胞数，通常视野中有50％的细胞发生质壁分离时定为初始质壁分离，细胞初始质壁分离时压力势为零，因而可把引起细胞初始质壁分离的外界溶液称之为等渗溶液，其溶液具有的渗透势即为细胞的渗透势。

由于很难正好找到引起50％细胞发生质壁分离的浓度。

因此通常用插值法求得等渗溶液浓度，代入公式即可计算渗透势。

[器材与试剂]器材：显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，刀片，培养皿(或具塞试管)，记号笔，滴管。

试剂：蔗糖。

[方法与步骤]1. 配制0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol蔗糖/L水的质量摩尔浓度，贮6个试剂瓶中，必要时配制溶液浓度的相差可≤0.05mol蔗糖/L水。

2. 取6套干净清洁的小培养皿，用记号笔编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。

3. 将带有色素的植物组织或叶片(可选用有色素的洋葱鳞片的外表皮，紫鸭跖草，蚕豆，小麦，玉米等叶的表皮)撕取表皮迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，浸泡20-40分钟。

4. 到时后，取出表皮，放在载玻片上，滴一滴相同浓度的蔗糖，盖上盖玻片，在显微镜下观察质壁分离的细胞数和细胞总数，直接或间接(插值法)地找出引起50％细胞发生质壁分离的外界溶液浓度，即为细胞渗透浓度值。

设计性实验报告题目植物可溶性蛋白质和糖含量的测定课程名称：基础生物化学实验实验学期：2011至2012学年第一学期植物组织中可溶性蛋白质和糖含量的测定摘要本文以生菜、苹果为材料，采用考马斯亮蓝法（蛋白质）、蒽酮法（糖）、分光光度计法进行了可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定。

结果表明：生菜的蛋白质含量为5.88（mg/g），糖含量为0.0739g/100g；苹果中蛋白质含量为0.2926（mg/g），糖含量为0.2126g/100g。

即说明：生菜中蛋白质含量高于苹果，但苹果中的糖含量更高。

关键词可溶性蛋白、可溶性糖，考马斯亮蓝G-250染色法，蒽酮法，含量测定1、材料与方法1.1 蛋白质含量测定标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝试剂、生菜、苹果分光光度计、离心机、研钵、烧杯、电子秤、移液管、试管等1.2 糖含量测定200ug/ml标准葡萄糖、蒽酮试剂、浓硫酸、生菜、苹果试管、水浴锅、分光光度计、研钵、电子秤、移液管、量筒、试管架2、实验步骤蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝G-250染色法）2.1标准曲线的绘制取六只试管，按下表加入试剂，摇匀，向个管加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.2样品测定2.2.1样品提取分别秤取生菜、苹果鲜样 0.25～0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。

2.2.2 吸取样品提取液1.0ml（蛋白质含量适当稀释），放入试管中，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

糖含量测定2.3.葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。

在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。

实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法[原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。

在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。

由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。

该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。

[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。

(二)仪器设备722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。

(三)试剂(1)0．5mol／L Na0H。

(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。

H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。

之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。

冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。

待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。

使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。

因此在使用前应进行标定。

标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。

实验四植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。

二、原理（一）分离提取原理在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。

（二）测定原理1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。

蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。

此法灵敏度高，糖含量达30 μg即可测定。

2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。

在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。

3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 μg /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。

此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。

三、实验用品（一）实验材料：植物样品。

（二）器皿：1. 25 mL刻度试管⨯8 ，15 mL试管⨯20；2. 10 mL离心管⨯2；3. 容量瓶：50 mL⨯1 ，25 mL⨯1；4. 移液管：5 mL⨯2，2 mL⨯4，1 mL⨯2，0.1 mL⨯2；5. 恒温水浴锅；6. 离心机；7. 电子天平；8. 分光光度计。

实验七植物组织中可溶性蛋白质、可溶性糖含量的测定I、植物组织中可溶性蛋白质的测定一、原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料植物叶片（二）仪器设备紫外分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、研钵、移液管等（三）试剂 0.1 mol/L pH7.0 磷酸液三、实验步骤1．样品中蛋白质的提取称取植物叶片0.5~1.0 g放入研钵中，加入2mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，转移至15mL 离心管中，再用6mL磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20~25℃）下放置05~1.0h,以充分提取，然后在4000 r/min离心10 min，将上清液转入25 mL容量瓶中，并以磷酸缓冲液定容至刻度，即得待测样品提取液。

2．样品中蛋白质含量的测定取适量稀释后的蛋白质提取液，在紫外分光光度计上，分别于280 nm和260 nm波长条件下（以磷酸缓冲液为空白对照），测定提取液的吸收值，代入公式即可计算出样品中蛋白质的含量。

四、结果计算样品中蛋白质的浓度（mg/mL）=（1.45A280—0.74A260）×稀释倍数式中： 1.45 和 0.74 ——校正值。

A 280 ——蛋白质溶液在 280 nm 处的吸光度。

A 260 ——蛋白质溶液在 260 nm 处的吸光度Ⅱ、植物组织中可溶性糖的测定--蒽酮法一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

标准管法测定蛋白质含量
首先，准备样品。

样品的选择要代表性，需根据具体要求进行研磨或溶解处理，以保证后续测定的准确性。

接着，按照标准管法的要求，将样品进行酸水解或酶解处理，将蛋白质转化为氨基酸。

然后，利用氨基酸分析仪或其他适当的仪器，对氨基酸进行定量分析，得出样品中蛋白质的含量。

在进行标准管法测定蛋白质含量时，需要注意以下几点。

首先，操作人员需严
格按照操作规程进行操作，避免外界因素对实验结果的影响。

其次，仪器的选择和使用要符合标准要求，保证测定结果的准确性和可靠性。

此外，样品的处理和分析过程中，需注意实验条件的控制，避免温度、湿度等因素对实验结果造成影响。

最后，实验数据的处理和统计要准确可靠，确保结果的科学性和可信度。

总的来说，标准管法测定蛋白质含量是一种可靠、准确的方法，对于食品加工、医药研发等领域具有重要意义。

在实际操作中，操作人员需要严格按照标准要求进行操作，注意实验条件的控制，保证实验结果的准确性和可靠性。

希望本文的介绍能够对相关领域的研究人员有所帮助，促进相关工作的开展和发展。

《植物生理生化实验》习题一、名词解释：1、标准曲线2、斐林（Folin）－酚试剂法3、茚三酮显色法4、氮素代谢5、淀粉酶6、真空渗入7、离心技术8、电泳9、同工酶10、迁移率11、聚丙烯酰胺凝胶12、浓缩胶13、分离胶14、酶活力、比活力15、种子生活力16、抗逆性17、呼吸速率18、光合速率19、无土培养20、超氧化物歧化酶（SOD）21、硝酸还原还原酶22、诱导酶二、填空：1、测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是 ______为横坐标，以______为纵坐标。

2、用滴定法测Vc含量时，若样品本身带有颜色，则需先将样品用_________ 处理。

3、在测定淀粉酶的活性时：α－淀粉酶不耐________，β－淀粉酶不耐________ 。

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验中，电泳存在三大效应，分别是___________，_______________ ，_____________________。

5、叶绿素吸收光谱有___________和 __________________ 区两个最强吸收区。

6、类胡萝卜素吸收光谱最强吸收区在蓝紫光区，它不仅可以吸收传递光能，还具有 _____________的作用。

7、叶绿素溶液在透射光下呈 __________色，在反射光下呈 _________色。

8. 在植物生理研究中常用的完整植物培养方法有____________、________________ 、________________和_____________________。

9、水培时要选用黑色容器装营养，这是为了防止 _____________。

10、常用 _________法确定植物生长的必需元素。

11、缺钙症首先会表现于植物的 ________ 叶上。

三、选择：1、某蛋白质pI为7.5，在pH6.0 的缓冲液中进行自由界面电泳，其泳动方向为（）A、向负极移动B、向正极移动C、不运动D、同时向正极和负极移动2、进行酶活力测定时：（）A、底物浓度必须极大于酶浓度B、酶浓度必须极大于底物浓度，D、酶能提高反应的平衡点C、与底物浓度无关3、蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。

实验方案一、实验目的通过实验，掌握测定萝卜品质的方法（一）萝卜外部形态的测定1、实验材料取鲜样3个∕小区直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸2、实验方法．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、实验目的了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。

不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。

因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。

蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。

蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。

当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。

上述特定的糖类物质，反应较稳定。

该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。

三、材料、仪器及试剂1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵3.试剂（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。

（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1.葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。

在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡2.称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。

实验一、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量【实验目的】学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。

染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质－染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。

本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。

【实验材料、仪器及试剂】1．材料：新鲜的植物材料2．仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml（2）考马斯亮蓝G-250溶液：【实验步骤】1．样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。

在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。

2．标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。

表1-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。

【结果计算】C × VT样品中蛋白质含量（ug/g.FW）＝V S ×WF×1000式中：C为查标准曲线值（ug）；V T为提取液总体积（ml）；V S 为测定时加样量（ml）；W F为样品鲜重（g）。

实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定【实验目的】学习掌握鲜材料中游离氨基酸含量测定的原理和方法。

【实验原理】当氨基酸与水合茚三酮共热时，能定量地生成酮茚胺。

该产物显示蓝紫色，称为Ruhemans紫。

其最大吸收值在570nm ，并在一定范围内与氨基酸含量成正比。

氨基酸与茚三酮的反应分为两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成Ruhemans紫。

实验8 植物可溶性糖含量的测定可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖，是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的果树作物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的重要因素。

对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡，品质差。

因此，可溶性糖的定量研究对果树的品质育种具有重要意义。

一、试材及用具1．试材新鲜或冷冻的植物材料2．仪器及试剂高速组织捣碎机、电热恒温水浴锅、1000W调温电炉以及200mL、250mL 容量瓶、250mL锥形瓶及50mL碱式滴定管等玻璃仪器；试剂主要包括费林试剂及亚甲基蓝溶液等。

二、原理本实验的主要原理：在加热条件下，用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时，将费林试剂中的二价铜还原为一价铜，以亚甲基蓝为指示剂，稍过量的还原糖立即使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝。

通过实验，学习并掌握用费林试剂滴定法测定可溶性糖的原理和方法。

三、方法步骤（一）试剂配制1．费林试剂甲：称取硫酸铜（CuSO4•5H2O，分析纯）34.6g溶于水中，稀释至500mL，过滤，贮于棕色瓶内。

2．费林试剂乙：称取氢氧化钠50g和酒石酸钾钠（KNaC4O6H4•4H2O，分析纯）138g 溶于水中，稀释至500mL，用石棉垫漏斗抽滤。

3．转化糖标准溶液：称取9.5g蔗糖（分析纯）用水溶解后转入1000mL容量瓶中，加入6mol/L HCl（分析纯）10mL，加水至100mL。

在20～25℃下放置三天或在25℃保温24h，然后用水定容（此为酸化的1%转化糖液，可保存3～4个月）。

测定时，取1%转化糖液25.00mL 放入250mL容量瓶中，加入甲基红指示剂一滴，用1mol/L NaOH溶液中和后用水定容，即为1mg/mL转化糖标准溶液。

4．亚甲基蓝溶液：称取0.5g亚甲基蓝（分析纯）溶于10mL水中。

5．乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌[Zn(OAC)2•2H2O，分析纯]溶于水中，加冰乙酸3mL 稀释至100mL。

实验八植物组织中丙二醛含量的测定植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（mda）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。

mda的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛（mda）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（tba）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中mda时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与tba显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中mda—tba反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能够显著增加tba与蔗糖或mda显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、mda与tba显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100～300μg/gdw，根据植物样品量和提取液的体积，加入fe3＋的终浓度为0.5μmol/l。

a.直线重回法mda与tba显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。

不同浓度的蔗糖（0～25mmol/l）与tba显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与tba显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。

uv-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：y532＝﹣0.00198＋0.088d450①b．双组分分光光度计法据朗伯-比尔定律：d＝kcl，当液层厚度为1cm时，k=d/c，k称作该物质的比吸收系数。

当某一溶液中存有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等同于此混合液在该波长下各呈色物质的消光度之和。

已知蔗糖与tba显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40，7.40。

植物生理实验讲解内容实验一植物组织水势的测定（小液流法）1、原理（1）水分移动的总原则：从高水势到低水势。

当把植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，水势越大，越易失水；水势越小，越易得水；因此，会出现三种情况：植物组织的水势v外液的水势，组织吸水，外液（a）浓度变大植物组织的水势〉外液的水势，组织失水，外液（b）浓度变小植物组织的水势=外液的水势，组织既吸水又失水，外液（c）水分保持动态平衡（2 ）据比重大小判断小液流的移动方向：为判断以上三种情况，把侵有组织的溶液进行着色，当把着色的a、b、c三种外液用针管以小液流法放回对应的原溶液中，也出现三种情况：当浓度变大的外液（a）放入原溶液中说明植物组织的水势v外液的水势当浓度变小的外液（b）放入原溶液中f,说明植物组织的水势〉外液的水势当水分保持动态平衡的外液（c）放入原溶液中~ （不动），说明植物组织的水势=外液的水势2、材料：毛果含笑叶；梧桐树叶；丁香花或牵牛花4、方法（选用CaCb溶液为外液）思考题1、试述小液流法测定植物组织水势的原理。

测定中应注意什么？（1）遵照两个原理：①水分移动的总原则一从高水势到低水势。

②根据比重大小判断小液流的移动方向。

（2）测定中应注意：①取材时尽量避开叶脉和伤口、部位要一致、要迅速（以免失水），材料要混匀；②母液要均匀，不能颠倒顺序；③放小液流时不能用力过大；④观察液流方向要细心等］。

2、某组实验出现了小液流法J f f J f的情况，请分析出现错误的可能原因。

最有可能出错的应是第四支试管。

出错的原因有以下可能：（1）在配制甲组试管溶液时，试管没有充分的摇匀；（2）在配制甲组浓度梯度溶液时，第四支试管溶液不准确，浓度过低；（3）用注射器在甲组试管中挤出小液滴时，用力过猛。

3、测定水势的方法有：小液流法；电导仪法；折射仪法。

实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定——茚三酮显色法（1■原理氨基酸（蛋白质）的游离-NH3可与水合茚三酮反应，生成蓝紫色的化合物；在一定范围内，颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，因此，可用分光光度法测定其含量。

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可溶性蛋白质质谱分析
可溶性蛋白质质谱分析，指的是利用质谱技术对特定条件下的生物细胞或组织中的可溶性蛋白质进行分析。

百泰派克生物科技提供质谱分析可溶性蛋白质的服务。

可溶性蛋白质
蛋白溶解度是指样品中溶解到溶液中的蛋白质含量。

蛋白质的溶解度通常是蛋白质新成分开发和测试过程中首先要确定的功能性质。

在一定的溶液中，根据溶解性，可以把蛋白质分为可溶性的和非可溶性的。

对于可溶性蛋白质，没有一定的标准，因为蛋白质的生化特性非常不同，在一定条件下溶于特定溶剂中的蛋白质都可以叫可溶性蛋白质。

可溶性蛋白质质谱分析
可溶性蛋白质质谱分析，指的是利用质谱技术对特定条件下的生物细胞或组织中的可溶性蛋白质进行分析。

在提取时，注意将可溶性蛋白与非可溶性蛋白分开即可。

分析可溶性蛋白质主要是对其种类、含量和功能等进行分析。

质谱可以测定蛋白质的含量，并通过测定蛋白质的一级结构来实现蛋白质种类和功能的分析。

不同细胞中的可溶性蛋白有所不同，例如衰老细胞分泌的可溶性蛋白包括炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和基质修饰酶，分析它们有助于了解衰老相关的分泌表型。