沙冬青脱水素基因的克隆、重组及对糖料作物的遗传转化

沙冬青AmDREB3基因的克隆及植物表达载体构建张锋;王学峰;董博;王茅雁【期刊名称】《内蒙古农业大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2012(0)Z1【摘要】脱水应答元件结合蛋白(Dehydration-responsive element/DRE binding proteins,DREBs)属于植物AP2/EREBP(APETALA2/Ethylene-responsive element binding protein)转录因子大家族中的一个亚族,在植物对低温、干旱和盐碱等非生物胁迫的适应中起重要作用。

本论文从强耐寒耐旱植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中克隆到AmDREB3基因的编码区cDNA,对其编码蛋白的结构域和系统进化关系进行了分析,并将其成功构建到分别由CaMV35S和拟南芥rd29A启动子驱动的植物表达载体pCAMBIA3301上,为进一步通过转基因植物等方法验证该基因在耐逆性中的功能奠定了基础。

【总页数】5页(P133-137)【关键词】沙冬青;DREB;基因克隆;序列分析;载体构建【作者】张锋;王学峰;董博;王茅雁【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】S793.9【相关文献】1.强旱生植物沙冬青AmERF基因的克隆及生物信息学研究 [J], 李晓东;白晨;郭九峰;于卓;孙国琴;张惠忠2.沙冬青脱水素基因的克隆及表达载体的构建 [J], 乔慧蕾;王瑞刚;郭九峰;孙国琴;李国婧3.蒙古沙冬青AmDREB2.2基因的克隆与植物表达载体构建 [J], 张至玮;李章磊;高飞;曹玉震;夏波林;周宜君4.转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体 [J], 佟友丽;赵飞;冯君伟;李玉花5.蒙古沙冬青AmWRKY53基因表达分析及表达载体构建 [J], 夏波林;邢怡德;高飞;姜承勇;周宜君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

沙冬青抗旱性和抗寒性的研究进展李宏富（宁夏大学生命科学学院，宁夏银川，750021）摘要:系统地评述了沙冬青在我国的分布以及研究的意义,沙冬青的生态特性、生理及抗旱抗寒性等方面的研究成果，总结了研究过程中存在的问题，并提出了今后的研究方向。

关键词:沙冬青；抗旱性；抗寒性；研究进展Research Progress on Drought-resistance and Cold-resistance ofAmmopiptanthus mongolicusLI Hong-fu(College of Life Science, Ningxia University, Yinchuan, Ningxia, 750021) Abstract: The research results on the geographical distribution and research significance，ecological characteristics，physiology，drought-resistance and cold-resistance of Ammopiptanthus mongolicusins in china were reviewed in a systematic way. At the same time，the problems existed in the study were summarized and the further research orientation was suggested.Key words:Ammopiptanthus mongolicus Drought-resistance Cold-resistance Research process1 沙冬青的分布沙冬青成片或断续小片分布于97°—107°E、37°—42°N的辽阔地区，东自内蒙古自治区的狼山，沿巴彦淖尔盟、阿拉善盟、贺兰山西坡山前冲积、洪积准平原到巴丹吉林沙漠的东缘；南自甘肃省古浪、景泰等县，沿昌岭山、一条山，经宁夏回族自治区的中卫、中宁、灵武、陶乐等县的南山区达内蒙古鄂尔多斯高原西缘，黄河东岸的卓资山、石嘴山一带分布较多。

利用基因工程技术改善农作物抗旱性的研究标题：基因工程技术在提高农作物抗旱性方面的研究引言：随着气候变暖和全球水资源短缺的问题越来越严重，干旱已成为影响全球农业生产的主要因素之一。

为了应对干旱对农作物产量的负面影响，科学家们利用基因工程技术，致力于提高农作物的抗旱性。

本文将探讨利用基因工程技术改善农作物抗旱性的最新研究进展。

主体：1. 了解农作物抗旱性的基因调控机制：研究表明，许多基因参与了农作物抗旱性相关的生理过程，如根系发育、蒸腾作用、水分保持能力等。

通过对这些基因的解析和功能验证，可以更好地理解农作物抗旱性的基因调控机制，为基因工程研究提供理论基础。

2. 利用转导因子提高水分利用效率：转导因子在调控植物对旱情的应答过程中起着关键作用。

研究发现，某些转导因子的过度表达可以提高植物的水分利用效率和抗旱能力。

通过基因工程技术，将这些具有促进抗旱调控的基因转移到目标作物中，可以有效提高农作物的抗旱性。

3. 基因编辑技术改良根系结构：根系是植物吸收水分和营养物质的重要器官。

研究表明，通过编辑根系相关的基因，可以改变植物的根系结构，增加有效吸收水分和养分的能力，提高植物的抗旱性。

基因编辑技术如CRISPR/Cas9的出现，为这一目标提供了强有力的工具。

4. 利用抗旱相关基因转基到主要作物中：许多植物具有良好的抗旱性，而这些特性的基因与作物的遗传背景存在着生理学上的差异。

通过基因工程技术，研究人员可以将这些抗旱相关的基因转移到主要作物中，以提高其抗旱性。

这包括转导因子、脱水素合成酶等抗旱基因的转移。

结论：基因工程技术在改善农作物抗旱性方面的研究取得了显著进展，为解决全球干旱问题提供了新的途径。

随着对植物基因调控机制的深入了解和基因编辑技术的不断发展，我们有理由相信，未来将会产生更多有效的基因工程策略，提高农作物的抗旱能力，保障全球粮食安全。

中国农学通报2016,32(22):32-36Chinese Agricultural Science Bulletin珍稀濒危植物沙冬青的组织培养王方琳1,2，柴成武1，尉秋实1，魏小红2，马俊梅1，李爱德1，王昱淇1，张莹花1，张锦春1，丁春发2，赵颖2（1甘肃省治沙研究所/甘肃省荒漠化与风沙灾害防治重点实验室，甘肃武威733000；2甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州730070）摘要：试验以珍稀濒危植物沙冬青无菌苗的子叶、茎段为外植体材料，研究不同激素配比的培养基对不同外植体愈伤组织培养、丛生芽增殖及生根培养的影响，并筛选适宜各阶段培养的最佳培养基配方。

结果表明，子叶是诱导沙冬青愈伤组织的最好外植体，在6-BA0.5mg/L、2,4-D0.5mg/L时，其愈伤组织诱导率达到最大值81.8%；在6-BA2.0mg/L、NAA0.5mg/L时丛生芽增殖率达到最大值90.2%，且丛生芽数量多、茎干健壮、生长旺盛，说明较高浓度的细胞分裂6-BA对丛生芽增殖具有明显的促进作用；在以1/2MS为基本培养基，加入NAA1.0mg/L时，生根率达到最大值70.4%，且生根时间最早，主根明显、粗壮且根毛数量多；适当调节培养基中无机盐的浓度提高生根率是将来沙生植物组织培养中研究的重点和难点。

关键词：沙冬青；组织培养；沙生植物中图分类号：Q94-331文献标志码：A论文编号：casb15110136Tissue Culture of Endangered Psammophyte Ammopiptanthus mongolicusWang Fanglin1,2,Chai Chengwu1,Yu Qiushi1,Wei Xiaohong2,Ma Junmei1,Li Aide1,Wang Yuqi1,Zhang Yinghua1,Zhang Jinchun1,Ding Chunfa2,Zhao Ying2(1The State Key Laboratory of Desertification Combating Prevention and Sandstorm Disaster of Gansu Province/Gansu Desert Control Research Institute,Wuwei Gansu733000;2College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070) Abstract:The paper aims to test effects of medium with different hormone combinations on explants callus culture,buds proliferation and rooting culture of rare and endangered plants Ammopiptanthus with aseptic cotyledons and stem segments as explants materials,and screen the optimum medium formula for each culture stage.The results showed that cotyledon was the best explants to induct callus of Ammopiptanthus.The callus induction rate reached its maximum81.8%at6-BA0.5mg/L,2,4-D0.5mg/L.The clustered buds proliferation rate reached the maximum of90.2%at6-BA2.0mg/L,NAA0.5mg/L.The phenomenon of multiple clustered buds,robust stem and vigorous growth was observed,indicating that higher concentrations of cell division6-BA could significantly promote cluster bud proliferation.The rooting rate reached the maximum of70.4%in1/2MS basic medium added with NAA1.0mg/L,the rooting time was the earliest,with obvious main root,which was stout and hairy.The key point in psammophytes tissue culture research will be adjusting inorganic salt concentration in the medium properly to improve the rooting rate.基金项目：国家自然科学基金项目“固定流沙先锋树种沙生柽柳无性繁殖生根机制研究”(31460069)；国家自然科学基金项目“外源一氧化氮调控紫花苜蓿抗寒性的信号转导机制研究”(31560663)；国家自然科学基金项目“风沙流对民勤荒漠灌木幼苗形态特征的影响及其生理生化响应机制”(31460224)；国家自然科学基金项目“石羊河下游绿洲荒漠过渡带微区集水过程及其植被效应研究”(41161006)；国家自然科学基金项目“石羊河中下游退耕地土壤系统演变规律及其驱动机制研究”(41161049)。

西北植物学报,２０１８,３８(８):１３８２－１３９１A c t aB o t ．B o r e a l ．ＧO c c i d e n t ．S i n．㊀㊀文章编号:１０００Ｇ４０２５(２０１８)０８Ｇ１３８２Ｇ１０㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀d o i :１０．７６０６/j．i s s n ．１０００Ｇ４０２５．２０１８．０８．１３８２收稿日期:２０１８Ｇ０４Ｇ２５;修改稿收到日期:２０１８Ｇ０７Ｇ１９基金项目:内蒙古自然科学基金重大项目(２０１２Z D ０２);内蒙古自治区研究生科研创新项目(B ２０１６１０１２９１５)作者简介:薛㊀敏(１９９０－),女,在读博士研究生,主要从事植物抗逆分子生物学研究.E Ｇm a i l :x u e m i n ＠１２６．c o m∗通信作者:王茅雁,博士,教授,博士生导师,主要从事植物抗逆分子生物学研究.沙冬青A m F A D ７和A m F A D ８基因的克隆与转化及其功能初步分析薛㊀敏,郭㊀婷,任美艳,殷玉梅,王茅雁∗(内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特０１００１８)摘㊀要:对强抗逆植物蒙古沙冬青２个脂肪酸去饱和酶基因A m F A D ７和A m F A D ８的功能进行了初步研究.结果表明:(１)A m F A D ７和A m F A D ８的编码蛋白分别含４５５和４５７个氨基酸残基.(２)半定量R T ＧP C R 分析显示,在野外生长植株的嫩叶中,A m F A D ７表达量在夏季很低㊁冬季较高,春秋两季略低于冬季,而A m F A D ８在春秋两季和初冬时表达量高于其他月份;在低温(４ħ~－６ħ梯度降温)处理２~４８h 的幼苗中,A m F A D ７的表达呈先降低后升高的变化趋势,而A m F A D ８的表达比处理前略有上调;在高温(４２ħ)处理２~４８h 的幼苗中,２个基因的表达均被抑制,尤其对A m F A D ７的抑制较为迅速而且明显;在干燥处理２~４８h 的幼苗中,A m F A D ７的表达量有较明显的升高,而A m F A D ８则略有降低.(３)成功构建了２个基因的植物表达载体(p ３３００Ｇ３５S ＧA m F A D ７和p ３３００Ｇ３５S ＧA m F A D ８)并转化拟南芥,分别获得１８和１６个转基因株系.R T ＧP C R 检测表明,其中F ７Ｇ１和F ７Ｇ２以及F ８Ｇ１~F ８Ｇ４转基因株系中目的基因的表达量均较高.(４)相对电导率分析显示,在正常温度下,A m F A D ７转基因株系(F ７Ｇ１和F ７Ｇ２)的相对电导率与野生型无显著差异;在低温(－１ħ)胁迫２４h 后,F ７Ｇ１和F ７Ｇ２的相对电导率(分别为３２．８％和３６．１％)显著低于野生型(４８．５％),而在高温(３７ħ)胁迫２４h 后,F ７Ｇ１和F ７Ｇ２的相对电导率(分别为４４．７％和４１．９％)显著高于野生型(３３．２％).研究表明,A m F A D ７在转录水平受低温和干燥胁迫的诱导,但被高温胁迫抑制,而A m F A D ８的转录受低温诱导但被干燥和高温胁迫抑制;在拟南芥中组成型表达A m F A D ７增强了转基因植株在低温胁迫下细胞膜的稳定性及其耐冻性,但却增加了其在高温胁迫下的细胞膜损伤程度和热敏感性.关键词:沙冬青;脂肪酸去饱和酶;表达分析;基因克隆;耐冻性;热敏感性中图分类号:Q ７８５;Q ７８９文献标志码:AC l o n i n g ,T r a n s f o r m a t i o na n dP r e l i m i n a r y F u n c t i o nA n a l ys i s o f A m F A D ７a n d A m F A D ８f r o m A m m o p i p t a n t h u sm o n go l i c u s X U E M i n ,G U O T i n g ,R E N M e i y a n ,Y I N Y u m e i ,WA N G M a o ya n ∗(C o l l e g e o fL i f eS c i e n c e s ,I n n e rM o n g o l i aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,H o h h o t ０１００１８,C h i n a )A b s t r a c t :T h e f u n c t i o n s o f t w o f a t t y a c i dd e s a t u r a s e g e n e s ,A m F A D ７a n d A m F A D ８,f r o m A m m o p i pt a n Ｇt h u sm o n go l i c u s w i t h v e r y s t r o n g t o l e r a n c e t o a b i o t i c s t r e s s e sw e r e a n a l y z e d ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t :(１)A m F A D ７a n d A m F A D ８g e n ee n c o d e４５５a n d４５７a m i n oa c i d s ,r e s p e c t i v e l y ．(２)T h es e m i Ｇqu a n t i t a t i v e R T ＧP C Rr e s u l t s s h o w e d t h a t f o r y o u n g l e a v e s o f t h e A ．m o n go l i c u s p l a n t s g r o w i n g i n t h ew i l d ,t h e e x p r e s Ｇs i o n l e v e l o f A m F A D ７w a s v e r y l o wi n s u m m e r a n d q u i t e h i g h i nw i n t e r ,a n d i tw a s s l i g h t l yl o w e r i nb o t hs p r i n g a n da u t u m nt h a nt h a t i n w i n t e r．T h ee x p r e s s i o nl e v e l so f A m F A D８i nt h e l e a v e sw e r eh i g h e r i n s p r i n g,a u t u m n,a n d e a r l y w i n t e r t h a n t h o s e i no t h e rm o n t h s．T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f A m F A D７r e d u c e d f i r s t l y a n d t h e n i n c r e a s e do b v i o u s l y,w h i l e t h ee x p r e s s i o no f A m F A D８i n c r e a s e ds l i g h t l y c o m p a r e dw i t h t h a t b e f o r e t h e t r e a t m e n t i n t h e A．m o n g o l i c u s s e e d l i n g s u n d e r c o l d(４ħt o－６ħg r a d i e n t c o o l i n g)t r e a tＧm e n t f o r２t o４８h．U n d e r h e a t(４２ħ)t r e a t m e n t f o r２t o４８h,t h e e x p r e s s i o no f b o t h g e n e sw a s i n h i b iＧt e d,a n dt h es u p p r e s s i o no f A m F A D７w a s p a r t i c u l a r l y r a p i da n d m a r k e d．D u r i n g d e h y d r a t i o n(２５ħ) t r e a t m e n t f o r２t o４８h,t h e e x p r e s s i o no f A m F A D７s h o w e da no b v i o u s i n c r e a s e,w h i l e t h a t o f A m F A D８h a d a s l i g h t d e c r e a s e．(３)T h e c o n s t r u c t i o n so f p l a n t e x p r e s s i o nv e c t o r s p３３００Ｇ３５SＧA m F A D７a n d p３３００Ｇ３５SＧA m F A D８o f A m F A D７a n d A m F A D８g e n e sw e r e i n t r o d u c e d i n t o A r a b i d o p s i s t oo b t a i ne i g h t e e na n d s i x t e e n i n d e p e n d e n t t r a n s g e n i c l i n e s,r e s p e c t i v e l y．A f t e rb e i n g e x a m i n e db y s e m iＧq u a n t i t a t i v eR TＧP C R, t w o(F７Ｇ１a n dF７Ｇ２)a n d f o u r(F８Ｇ１t oF８Ｇ４)t r a n s g e n i c l i n e s s h o w e dh i g h t r a n s c r i p t i o n l e v e l o f A m F A D７a n d A m F A D８,r e s p e c t i v e l y．(４)T h e r e l a t i v ee l e c t r o l y t i c l e a k a g e(R E L)a n a l y s i s s h o w e dt h a t a tn o r m a l c o n d i t i o n(２２ħ),t h eR E Lo f A m F A D７t r a n s g e n i c l i n e s a n dw i l d t y p e h a d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e．A f t e r t r e a t m e n t a t－１ħf o r２４h,t h eR E Ll e v e l s i nF７Ｇ１a n dF７Ｇ２(３２．８％a n d３６．１％,r e s p e c t i v e l y)w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o fw i l d t y p e(４８．５％)．A n d a f t e rh e a t t r e a t m e n t a t３７ħf o r２４h,t h eR E L l e v e l s i nF７Ｇ１a n dF７Ｇ２(４４．７％a n d４１．７％,r e s p e c t i v e l y)w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h ew i l d t y p e(３３．２％)．I nc o n c l u s i o n,t h ee x p r e s s i o no f A m F A D７w a s i n d u c e db y c o l da n dd e h y d r a t i o ns t r e s s e s b u t i n h i b i t e d b y h e a t s t r e s s．T h e e x p r e s s i o n o f A m F A D８w a s i n d u c e d b y c o l d s t r e s s b u t i n h i b i t e d b y d e h yＧd r a t i o na n d h e a t s t r e s s e s．C o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o n o f A m F A D７i n A r a b i d o p s i s i n c r e a s e d t h em e m b r a n e s t aＧb i l i t y a n d f r e e z i n g t o l e r a n c e u n d e r l o wt e m p e r a t u r e s t r e s s．H o w e v e r,i t a l s o i n c r e a s e d t h em e m b r a n e d a mＧa g e a n dh e a t s e n s i t i v i t y u n d e r h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s．K e y w o r d s:A m m o p i p t a n t h u sm o n g l o i c u s;F A D;e x p r e s s i o na n a l y s i s;g e n ec l o n i n g;f r e e z i n g r e s i s t a n c e;h e a t s e n s i t i v i t y㊀㊀低温㊁高温和干旱等逆境是影响植物生长发育的主要环境因素.研究表明,细胞膜系统是植物感受低温甚至高温胁迫的原初部位[１Ｇ２].低温胁迫分为冷害(０ħ以上)和冻害(０ħ以下)两种.当冷害发生时,细胞膜脂的流动性会趋于降低甚至会损伤膜系统,细胞内蛋白质的合成和酶系统的活性以及基因表达等均会发生改变,从而影响细胞代谢等生命活动过程[３].冻害来袭时会导致植物细胞严重脱水,甚至会造成细胞内外结冰而使膜系统受到机械损伤,直接导致细胞死亡[４Ｇ５].通常,抗寒性强的植物在低温胁迫下膜脂中多不饱和脂肪酸(p o l y u nＧs a t u r a t e d f a t t y a c i d s,P U F A s)的含量会升高,从而可降低膜脂的相变温度,利于维持膜的流动性和完整性[６Ｇ７].相反,高温胁迫会引起膜系统由液晶态向液态转变,从而引起膜结构损伤或者解体[８].此时膜脂中P U F A含量的降低或者脂肪酸饱和度的升高常利于维持膜结构的稳定和增强耐热性.此外,膜脂中P U F A的含量与植物抵抗干旱和盐胁迫等逆境也有密切关系[９].植物细胞膜脂中P U F A的组成主要包括二烯酸(C１６ʒ２和C１８ʒ２)和三烯酸(C１６ʒ３和C１８ʒ３),其中C１８ʒ３和C１８ʒ２在大多数植物的膜脂中含量最为丰富,而且其含量㊁尤其是C１８ʒ３的相对含量与植物抵抗低温和高温等逆境胁迫关系最为密切[９Ｇ１０].C１８ʒ３由一类膜结合型脂肪酸去饱和酶(f a t t y a c i dd e s a t u r a s e,F A D)在C１８ʒ２的ωＧ３(ΔＧ１５)位置引入一个双键而生成,这类F A D被称为ωＧ３F A D.在模式植物拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中共有３个ωＧ３F A D编码基因,即A t F A D３㊁A tＧF A D７和A t F A D８.其中前者编码产物分布于内质网膜上,而后两者编码产物均定位于质体/叶绿体被膜中[１１Ｇ１３].这些基因以及它们在水稻(O r y z a s a t iＧv a)㊁番茄(S o l a n u ml y c o p e r s i c u m)和大豆(G l y c i n e m a x)等植物中的同源基因已被克隆,其中F A D７和F A D８型基因在抵抗低温和干旱等非生物胁迫中的作用已基本得到证实[１４Ｇ１６].将拟南芥A t F A D７和A t F A D８在烟草中超表达,可以增加转基因株系中三烯酸的含量并能分别提高其耐冷性和抗旱性,但却降低了其耐热性[１７Ｇ１９].番茄L e F A D７和水稻O s F A D８也具有类似的功能[１４Ｇ１５].在有些植物中F A D７和F A D８的编码基因成对存在甚至数目更多,这些基因在响应逆境胁迫上存在差异.例如,马齿苋(P o r t u l a c ao l e r a c e a)P o l e F A D７和陆地棉(G o s s y p i u mh i r s u t u m)G h i F A D７/８Ｇ１均受低温胁３８３１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀薛㊀敏,等:沙冬青A m F A D７和A m F A D８基因的克隆与转化及其功能初步分析迫的诱导,而这些植物的P o l e F A D８以及G h iＧF A D７/８Ｇ２和G h i F A D７/８Ｇ３却对低温胁迫无响应[２０].这些研究结果表明F A D７和F A D８在植物抗逆性中起重要作用,而且来自不同植物或同一种植物的同源基因在功能上可能存在分化[２１].蒙古沙冬青(A m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s)为古老的珍稀濒危常绿阔叶灌木,为豆科沙冬青属仅有的两个种之一.由于长期生存于冬寒夏热㊁常年干燥缺水和土壤沙化贫瘠的蒙古高原寒旱荒漠区,该物种形成了极强的抗寒㊁抗旱和耐热㊁耐盐碱等抗逆特性,成为不可多得的研究植物抗逆性和挖掘抗逆基因的好材料[２２].前期通过对该物种进行转录组分析,获得了A m F A D７和A m F A D８的c D N A序列以及二者的寒旱胁迫R N AＧS e q表达谱[２３].本研究利用半定量R TＧP C R方法分析了这２个基因在低温㊁高温和干燥胁迫处理２~４８h以及它们在野外不同季节复合逆境下的表达变化.此外,克隆到２个基因并转化拟南芥,测定了A m F A D７转基因株系在低温和高温胁迫处理后细胞膜透性的变化,为深入研究其功能奠定了基础.１㊀材料和方法１．１㊀沙冬青胁迫处理与取样采用沙培法将蒙古沙冬青幼苗培养１月,进行下述胁迫处理.(１)低温处理.将幼苗放入低温光照培养箱(P e r c i v a lL TＧ３６V L,P e r c i v a l,U S A)中进行梯度降温处理,即４ħ２１h,－２ħ８h,－６ħ１９h,共４８h;分别在处理前(０h)和处理后２㊁６㊁１２㊁２４和４８h 取幼苗并用预冷的自来水漂洗干净㊁冻存.(２)高温处理.将幼苗放入４２ħ电热干燥箱中,期间补充水分,取样时间点同低温处理,将幼苗用预热的自来水漂洗干净㊁冻存.(３)干燥处理.将幼苗从沙土盆中取出并用自来水漂洗干净,放在滤纸上于２５ħ㊁弱光照下进行自然干燥,取样时间点同低温处理.不同季节野外取样于２０１５年７月至２０１６年５月进行,于每个月初上午从野外生长植株(呼和浩特市南郊蒙草抗旱公司野生植物园区)上剪取嫩叶作为样品,液氮中速冻后保存于－７６ħ.１．２㊀方㊀法１．２．１㊀半定量R TＧP C R分析㊀利用改进的T r i z o l 法从冻存样品中提取总R N A[２４],再用R N a s eＧF r e e D N a s eⅠ(P r o m e g a公司)进行纯化,然后用MＧM L V逆转录酶(T a k a r a公司)将其反转录合成c DＧN A第一链.以蒙古沙冬青A m A c t i n作为内参基因,对不同样品的c D N A模板量进行均一化,分别用A m F A D７和A m F A D８表达引物(表１)进行半定量R TＧP C R分析.１５μL反应体系中含:１０ˑP C R 缓冲液１．５μL,d N T P(２．５m m o l/L)１．２μL,上下游引物各０．３μL(１０μm o l/L),c D N A模板XμL, r T a q酶(５U/μL)０．１５μL,剩余体积用d d H２O补足.P C R程序为:９４ħ３m i n;９４ħ３０s,６０ħ３０s,７２ħ４５s,３２个循环;７２ħ１０m i n;４ħ保存.将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳.每个样品至少进行３次独立P C R实验.１．２．２㊀３ᶄＧR A C E与基因克隆㊀利用T a k a r a公司的３ᶄＧR A C E试剂盒扩增A m F A D７c D N A序列的３ᶄ端,所用引物见表１.将所得３ᶄ端序列与原序列进行拼接获得全长c D N A序列.然后在A m F A D７和A m F A D８编码区两侧设计引物(表１),以上述c DＧN A做模板,用F a s tP f uD N A聚合酶(T r a n s公司)进行P C R扩增.将P C R产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带,然后与p E A S YＧS i m p l eＧB l u n t克隆载体(T r a n s公司)连接.将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E．c o l i)T O P１０感受态细胞,单菌落经P C R检测为阳性者送北京华大基因公司测序.１．２．３㊀蛋白序列分析与进化树构建㊀用P r o P a r a m 软件分析蛋白质疏水性;用T MHMM S e r v e r v２．０软件预测蛋白跨膜区;用T a r g e t P１．１S e r v e r和C h l o r o P１．１S e r v e r软件预测叶绿体导肽;用C l u s tＧa lX和G e n e D o c程序进行蛋白多序列比对,均采用默认参数;用M E G A７．０软件通过邻接法(N e i g hＧb o rＧJ o i n i n g,N J)构建进化树,采用１０００次B o o tＧs t r a p进行分析.１．２．４㊀植物表达载体构建㊀从含有A m F A D７和A m F A D８克隆载体以及植物表达空载体p C AMＧB I A３３００Ｇ３５S T(p３３００Ｇ３５S T)的E．c o l i菌液中提取质粒D N A(天根公司质粒D N A提取试剂盒),分别用B a m HⅠ/S m aⅠ和X b aⅠ/S m aⅠ进行双酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳及目的基因片段与载体片段的回收.再用T４D N A连接酶将二者连接并转化E．c o l i T O P１０感受态细胞,将单克隆进行菌落PC R检测和质粒D N A酶切鉴定.将构建好的重组表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌G V３１０１感受态细胞,经菌落P C R检测获得阳性克隆,冻存.１．２．５㊀转基因拟南芥的获得和电导率测定㊀用常规方法培养野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)至４周４８３１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷表１㊀实验所用引物T a b l e１㊀P r i m e r su s e d i n t h e s t u d y基因名称G e n e n a m e用途A p p l i c a t i o n序列S e q u e n c e(５ᶄң３ᶄ)酶切位点R e s t r i c t i o ns i t e A m F A D７３ᶄＧR A C E A m F A D７Ｇ３ O u t e r:G A T A A T C A A T G A G G C T A A T G G G GA m F A D７Ｇ３ I n n e r:A G A A T C C T T G G A A G T C C A T G A G C编码区扩增A m F A D７ＧF１:T G G A T C C T G G G T T T C A A T G G C A A G T B a m HⅠA p p l i f i c a t i o n f o r c o d i n g r e g i o n A m F A D７ＧR１:A C C C G G G C T T A T T T C T T A A T C T G A T G S m aⅠ表达分析A m F A D７ＧF２:A A T A G G G A A C A C C A T A A A G C A T A A A CE x p r e s s i o na n a l y s i s A mF A D７ＧR２:TG A C A C T G G G G A T G T T G T G T A C T A TA m F A D８编码区扩增A m F A D８ＧF１:C T C T A G A A C T G T G A C T T T A C C T T T C T A T C X b aⅠA p p l i f i c a t i o n f o r c o d i n g r e g i o n A m F A D８ＧR１:T C C C G G G T A A T T C C G T G G C A T C T G T S m aⅠ表达分析A m F A D８ＧF２:A A G C T A C T G A G G C A G C T A A G C C AE x p r e s s i o na n a l y s i s A mF A D８ＧR２:C C A T A T A A T T C CG T G G C A T C T G TA m A c t i n表达分析A m A c t i nＧF:T G T T T C C G G G T A T T G C T G A CE x p r e s s i o na n a l y s i s A m A c t i nＧR:A C C C A G A G C C A T C A A A T A A GA t A c t i n表达分析A t A c t i nＧF:T G T T C C A G C C C T C G T T T G T GE x p r e s s i o na n a l y s i s A t A c t i nＧR:T G G A C C T G C C T C A T C A T A C T C G注:∗下划线部分为酶切位点N o t e:∗U n d e r l i n e d s e q u e n c e s a r e r e c o g n i z e d s i t e s o f t h e r e s t r i c t i o ne n z y m e s龄,同时将冻存的农杆菌激活培养并通过沾花法转化拟南芥.收取转化植株的种子(T１代)播种于营养钵中,培养３周后用０．５ɢ草丁膦(p h o s p h i n o t h r iＧc i n,P P T)溶液每天喷雾１次,连续喷雾３d.取存活植株叶片用S D S法提取基因组D N A做模板,用基因编码区特异性引物(表１)进行P C R检测.将阳性植株单株收种获得T２代种子,然后点种于含６．５m g/LP P T１/２M S固体培养基上培养,筛选白苗与绿苗接近１:３的株系用半定量R TＧP C R方法分析目的基因表达量(以拟南芥A t A c t i n作为内参基因,引物见表１).选择A m F A D７和A m F A D８表达量较高的株系繁殖T３代,然后在含P P T的筛选培养基(同T２代)上筛选全部为绿苗的纯合体用于抗逆性鉴定实验.电导率测定是将野生型(WT)和转基因拟南芥在正常条件下培养至４周龄,然后分别置于－１ħ和３７ħ下处理２４h,期间给予１６h弱光照和８h黑暗的光照条件.称取待测样品叶片各０．２g,按照赵世杰[２５]的方法测定相对电导率并计算膜的伤害度.相对电导率(％)＝(L１－L０)/(L２－L０)ˑ１００％其中L０为空白(去离子水)对照,L１和L２分别为初始电导率和最终电导率.伤害度＝(处理相对电导率－对照相对电导率)/(１００％－对照相对电导率).２㊀结果与分析２．１㊀A m F A D７和A m F A D８的表达分析２．１．１㊀２个基因的R N AＧS e q表达谱㊀在前期通过对蒙古沙冬青进行转录组测序和表达谱分析,获得了２个受低温和干燥胁迫诱导的质体型ωＧ３F A D c D N A序列[２３].根据基因注释信息,它们分别与拟南芥和大豆的质体型F A D７和F A D８有较高相似性,故此暂将其命名为A m F A D７和A m F A D８.二者的R N AＧS e q表达谱数据为:在正常生长条件下(C K,对照),A m F A D７在蒙古沙冬青幼苗中表达量很低,其R P KM(r e a d s p e r k i l o b a s e p e r m i l l i o n r e a d s)值为０．８,而A m F A D８表达量较高,其R P K M 值为７３．８;在低温处理２㊁８和２４h后,A m F A D７的表达量分别增加到对照的６．５㊁１２．１和７．４倍,而A m F A D８则呈现先降低后升高的变化趋势,其表达变化幅度仅为对照的０．８~２．１倍;在干燥胁迫２㊁８和２４h后,A m F A D７的表达量分别为对照的１５５．２㊁２５．１和２．４倍,而A m F A D８一直呈降低趋势(图１).这些数据表明A m F A D７在转录水平受低温和干燥胁迫的显著诱导,而A m F A D８的转录受低温胁迫轻微诱导但被干燥失水明显抑制.２．１．２㊀不同胁迫处理下２个基因的半定量R TＧP C R分析㊀为了深入了解A m F A D７和A m F A D８５８３１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀薛㊀敏,等:沙冬青A m F A D７和A m F A D８基因的克隆与转化及其功能初步分析对低温㊁高温和干燥胁迫的响应,利用半定量R T ＧP C R 方法分析了它们在胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的表达变化.结果如图２所示.在胁迫处理前正常条件下(０h ,对照),２个基因均有较高水平的基础表达,其中A m F A D ８表达量略高于A m ＧF A D ７.在低温处理２h 后,A m F A D ７的表达量略有降低,但在处理６~４８h 期间逐渐升高;A m F A D ８的表达量在此期间也比处理前略有增加.在高温处理２~４８h 期间,２个基因的表达量均趋于降低,尤其A m F A D ７降低较为迅速.在干燥胁迫２~４８h期间,A m F A D ７的表达量有较明显的升高,而A m ＧF A D ８在处理２和６h 后略有降低,在处理１２~４８h 期间略有回升(图２).这一结果表明A m F A D ７和C K 为正常生长条件;C ２㊁C ８㊁C ２４和D ２㊁D ８㊁D ２４分别为低温和干燥处理２㊁８和２４h图１㊀A m F A D ７和A m F A D ８在低温和干燥胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的R N A ＧS e q 表达谱C K．N o r m a l g r o w t h c o n d i t i o n s ;C ２,C ８,C ２４a n dD ２,D ８,D ２４．２,８a n d２４ha f t e r c o l d a n dd e h y d r a t i o n t r e a t m e n t s ,r e s p e c t i v e l yF i g ．１㊀T h eR N A ＧS e q e x p r e s s i o n p r o f i l e s o f A m F A D ７a n d A m F A D ８i n t h e c o l d Ｇo r d e h yd r a t i o n Ｇs t re s s e d A ．m o n go l i c u s s e e d l i n gs 图２㊀A m F A D ７和A m F A D ８在不同胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的表达变化F i g ．２㊀E x p r e s s i o n c h a n ge s of A m F A D ７a n d A m F A D ８i n t h e A ．m o n go l i c u s s e e d l i n g s u n d e r d i f f e r e n t s t r e s s t r e a t m e n t sA m F A D ８对低温㊁高温和干燥胁迫的响应存在差异.总体而言,A m F A D ７对这３种胁迫的响应较为明显,而A m F A D ８的响应则相对较弱.２．１．３㊀不同季节野外自然条件下２个基因的表达变化㊀基因在野外条件下的表达变化更能反映其响应复杂自然环境的真实情况,为此本研究利用半定量R T ＧP C R 方法对A m F A D ７和A m F A D ８在不同季节野外生长的蒙古沙冬青嫩叶中的表达变化进行了分析.结果表明,在夏季(７月)天气较炎热时,A m F A D ７有少量表达,而A m F A D ８表达水平较高;在进入秋季后(９~１１月),随着天气变得冷凉,２个基因的表达量均明显升高,尤其A m F A D ７在１１月初升高更为明显;在进入初冬,即１２月初时,２个基因的表达量均无明显变化,但在进入翌年１月份更寒冷时期,A m F A D ７的表达量进一步升高,而A m F A D ８的表达量则明显降低;随着春季到来(３~５月),A m F A D ７的表达量呈现先降低后回升的变化趋势,但均低于其在１月份的表达水平,而A m ＧF A D ８的变化趋势正好相反(图３).总体来看,A m ＧF A D ７的转录水平与一年四季温度的变化基本呈负相关,而A m F A D ８的转录水平在秋季和春季总体上高于夏季和冬季(图３).２．２㊀A m F A D ７和A m F A D ８c D N A 的克隆及其蛋白基本特征分析２．２．１㊀２个基因编码区c D N A 的克隆㊀在转录组测序中获得的A m F A D ７和A m F A D ８c D N A 序列长分别为９００和１８７２b p .通过O m i g a 软件分析并在G e n B a n k 中进行同源比对,发现A m F A D ７序列的编码区在３ᶄ端不完整,而A m F A D ８为编码区完整的全长序列.为此首先对A m F A D ７进行了３ᶄＧR A C E ,获得一条１３４６b p 序列(图４,A ).将该序列与原序列进行拼接,获得全长为２１８７b p 的序列,它含有１３６８b p 完整编码区和４７４b p 的５ᶄＧU T R 与３４５b p 的３ᶄＧU T R .A m F A D ８全长c D N A 序列中含有一个１３７４b p 完整编码区和３９９b p ５ᶄＧ图３㊀A m F A D ７和A m F A D ８在不同季节野外生长的蒙古沙冬青嫩叶中的表达变化F i g ．３㊀E x p r e s s i o n c h a n ge s of A m F A D ７a n d A m F A D ８i n y o u ng l e a v e s o f th e A ．m o n g o li c u s p l a n t s g r o w i n gi n t h ew i l d i nd i f f e r e n t s e a s o n s ６８３１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷U T R与９９b p３ᶄU T R序列.分别在２个基因的U T R区设计引物,以蒙古沙冬青叶片的c D N A作模板进行P C R扩增,均获得预期大小的扩增片段(图４,B㊁C).将这些片段分别与克隆载体连接后转化E．c o l i,然后进行菌落P C R检测并将阳性克隆进行测序,证明获得了正确的编码区片段.２．２．２㊀２个基因蛋白基本特征分析㊀A m F A D７编码蛋白含４５５个氨基酸残基,相对分子质量为５１．７６k D,等电点为７．８４.A m F A D８编码蛋白含４５７个氨基酸残基,相对分子质量为５２．３２k D,等电点为９．２９.它们彼此间的相似性为８４％.此外,A mＧF A D７和A m F A D８均有３个跨膜结构域,分别位于A m F A D７的１３９~１６１㊁２８８~３１０和３１７~３３９位以及A m F A D８的１３７~１５９㊁２８６~３０５和３１２~３３４位;在其N末端还分别具有由７６和２７个氨基酸残基组成的叶绿体导肽序列.将A m F A D７和A mＧF A D８与拟南芥和大豆的F A D７与F A D８蛋白进行序列比对,发现在A m F A D７的１７４~１７８㊁２１０~２１４和３７７~３８１位分别存在３个F A D家族酶活性所必须的保守组氨酸簇H X X X H㊁H X X HH和H X XＧHH.在A m F A D８的相应位置也存在这些保守序列(图５).这些序列特征表明A m F A D７和A mＧF A D８编码蛋白具备拟南芥和大豆F A D７和F A D８的共有特征,属于这些物种F A D７和F A D８在蒙古沙冬青中的同源基因.将A m F A D７和A m F A D８与拟南芥㊁大豆㊁油菜和播娘蒿的ωＧ３F A D蛋白序列构建进化树,结果表明A m F A D７和A m F A D８与这些植物的质体型F A D７和F A D８聚在一类,而所有内质网型ωＧ３F A D,即F A D３聚在另一类.在质体型ωＧ３F A D中,A．A m F A D７３ᶄR A C E图谱;B和C．A m F A D７和A m F A D８编码区扩增图谱;１．扩增产物;M．T r a n s２KP l u sD N A M a r k e r图４㊀A m F A D７和A m F A D８编码区P C R扩增图谱A．A m F A D７３ᶄR A C E p a t t e r n;Ba n dC．A m p l i f i c a t i o n p a t t e r n s o f A m F A D７a n d A m F A D８c o d i n g r e g i o n s,r e s p e c t i v e l y．１．P C R p r o d u c t s;M．T r a n s２KP l u sD N A M a r k e rF i g．４㊀A m p l i f i c a t i o n p a t t e r n s o f t h e A m F A D７a n d A m F A D８c o d i n g r e g i o n sb y P CRA t F A D７和A t F A D８．拟南芥(N P_１８７７２７和N P_１９６１７７);G m F A D７Ｇ１和G m F A D８Ｇ１．大豆(A C S１５３８１和N P_００１２３８６０９);һ代表组氨酸簇图５㊀A m F A D７和A m F A D８与拟南芥和大豆F A D７与F A D８的序列比对A t F A D７a n dA t F A D８．A r a b i d o p s i s t h a l i a n a(N P_１８７７２７a n dN P_１９６１７７);G m F A D７Ｇ１a n dG m F A D８Ｇ１．G l y c i n em a x(A C S１５３８１a n dN P_００１２３８６０９);һr e p r e s e n t s t h eh i s t i d i n e c l u s t e r sF i g．５㊀S e q u e n c e a l i g n m e n t s o fA m F A D７a n dA m F A D８w i t h t h eF A D７s a n dF A D８s f r o m A r a b i d o p s i s a n d s o y b e a n７８３１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀薛㊀敏,等:沙冬青A m F A D７和A m F A D８基因的克隆与转化及其功能初步分析图６㊀A m F A D ７和A m F A D ８与其他植物ωＧ３F A D 蛋白的进化树F i g ．６㊀P h y l o ge n e t i c t r e e o fA m F A D ７a n dA m F A D ８w i t h t h eωＧ３F A D sf r o mo t h e r p l a n ts A 和B ．A m F A D ７和A m F A D ８菌落P C R ;C 和D ．A m F A D ７和A m F A D ８质粒酶切鉴定;１~４．产物;M １．T r a n s ２KP l u s ;M ２．D １５０００＋２０００图７㊀A m F A D ７和A m F A D ８植物表达载体构建鉴定图谱Aa n dB ．C o l o n y P C Ro f A m F A D ７a n d A m F A D ８,r e s p e c t i v e l y ;Ca n dD ．R e s t r i c t i o na n a l ys i s p a t t e r no f A m F A D ７a n d A m F A D ８,r e s p e c t i v e l y;１－４．P r o d u c t ;M １．T r a n s ２KP l u s ;M ２．D １５０００＋２０００F i g ．７㊀C o n f i r m a t i o no f A m F A D ７a n d A m F A D ８p l a n t e x pr e s s i o nv e c t o r c o n s t r u c t i o n s b y c o l o n y P C Ra n d r e s t r i c t i o na n a l ys i s A m F A D ７和A m F A D ８分别与大豆G m F A D ７Ｇ１/Ｇ２和G m F A D ８Ｇ１/Ｇ２距离更近,而与拟南芥㊁油菜和播娘蒿的F A D ７和F A D ８距离较远(图６).这与蒙古沙冬青与大豆在转录组水平上亲缘关系最近的结果相一致.２．３㊀A m F A D ７和A m F A D ８植物表达载体构建利用定向克隆的方法将A m F A D ７和A m ＧF A D ８编码区c D N A 片段分别连接到植物表达载体p３３００Ｇ３５S T 的３５S 启动子下游,然后转化E ．c o l i .对转化后产生的E ．c o l i 单克隆进行菌落P C R 检测和质粒酶切鉴定,均获得预期大小的目的片段(图７),表明载体构建成功.将它们分别命名为p ３３００Ｇ３５S ＧA m F A D ７和p ３３００Ｇ３５S ＧA m F A D ８.２．４㊀A m F A D ７和A m F A D ８转基因拟南芥的获得与电导率测定㊀㊀用上述构建好的表达载体分别转化农杆菌并进行菌落P C R 检测获得阳性克隆.然后用农杆菌介导法分别转化拟南芥WT ,获得了T １代种子.将T １代幼苗用除草剂PP T 进行筛选,２个基因分别得到１８株(A m F A D ７)和１６株(A m F A D ８)抗性植株.从抗性植株和WT 中提取基因组D N A 进行P C R 检测,结果在抗性植株中均检测到A m F A D ７或A m F A D ８的扩增条带,而对照WT 中未检测到任何条带(图８),表明２个基因已分别整合到抗性植株基因组中.在T ２代用半定量RT ＧP C R 方法分别对这２个基因的５个转基因株系(P P T 抗性绿苗与白苗比例接近３ʒ１)进行表达分析,结果表明在F ７Ｇ１和F ７Ｇ２以及F ８Ｇ１~F ８Ｇ４株系中目的基因的表达量均高于其余株系(图９).从这些高表达株系的T ３代中进一步筛选纯合体(全部为P P T 抗性绿苗)用于抗逆性鉴定.相对电导率是衡量逆境胁迫下植物细胞膜稳定８８３１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷A 和B ．A m F A D ７和A m F A D ８的PC R 检测;M １．T r a n s ２KP l u s;F ．P P T 抗性植株;WT．野生型图８㊀A m F A D ７和A m F A D ８在部分T １代转化植株中的P C R 检测图谱Aa n dB ．D e t e c t i o no f A m F A D ７a n d A m F A D ８b y PC R ;M．T r a n s ２KP l u sD N A M a r k e r ;F ．T h eP P T Ｇr e s i s t a n t p l a n t s;WT．W i l d t y pe F i g．８㊀D e t e c t i o no f A m F A D ７a n d A m F A D ８i n s o m e t r a n s f o r m e dT １A r a b i d o ps i s p l a n t sb y P CR A 和B ．A m F A D ７和A m F A D ８的R T ＧP C R 检测;１~５．转基因株系;WT．野生型图９㊀A m F A D ７和A m F A D ８转录本在T ２代转基因株系中的R T ＧP C R 检测图谱Aa n dB ．D e t e c t i o no f t h e A m F A D ７a n d A m F A D ８t r a n s c r i p t s b y R T ＧP C R ;１~５．t h e t r a n s g e n i c l i n e s ;WT．w i l d t y pe F i g．９㊀D e t e c t i o no f t h e A m F A D ７a n d A m F A D ８t r a n s c r i p t s i n t h eT ２tr a n s g e n i c l i n e sb y R T ＧP C R 性及其伤害程度的重要指标,为此对A m F A D ７转基因株系(F ７Ｇ１和F ７Ｇ２)和WT 在低温(－１ħ)与高温(３７ħ)胁迫处理前后的相对电导率进行了测定.结果表明,在处理前正常生长条件(２２ħ)下,转基因株系与WT 此值间无明显差异(２１．１％~２２．１％),但在温度胁迫处理２４h 后,其相对电导率的变化却与WT 明显不同.在低温处理后,F ７Ｇ１和F ７Ｇ２的相对电导率分别为３２．８％和３６．１％,均显著低于WT 的４８．５％;在高温处理后,F ７Ｇ１和F ７Ｇ２的相对电导率分别为４４．７％和４１．９％,均显著高于WT 的３３．２％(图１０,A ).进一步计算膜的伤害度,在低温胁迫下F ７Ｇ１和F ７Ｇ２株系分别为１４．８％和１７．９％,均显著低于WT (３４．３％),而在高温胁迫下,二者的伤害度分别为２９．９％和２５．４％,均显∗和∗∗分别表示在０．０５和０．０１水平上转基因株系与WT 的差异显著性图１０㊀温度胁迫对转A m F A D ７基因拟南芥叶片相对电导率(A )和伤害度(B )的影响∗a n d ∗∗r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t l y di f f e r e n t f r o mt h e c o n t r o l WTa t ０．０５a n d ０．０１l e v e l s ,r e s p e c t i v e l yF i g ．１０㊀E f f e c t o f t e m pe r a t u r e o n r e l a t i v e e l e c t r o n i c c o n d u c t a n c e (A )a n de x t e n t of i n j u r y (B )i n A m F A D ７t r a n sg e n i c A r a b i d o ps i s 著高于WT (１４．７％;图１０,B ).结果表明,转基因植株的细胞膜在低温胁迫下受到较低伤害,其耐冻性增加;而在高温胁迫下细胞膜损伤程度比野生型严重,其耐热性降低.３㊀讨㊀论膜脂是构成细胞膜系统的基本骨架,因此其组成直接影响膜的流动性与稳定性.P U F A ,尤其C １８ʒ３和C １８ʒ２是大多数植物细胞膜脂中含量最多的组分,因此其含量被认为与膜系统的流动性等物理性状关系最为密切,从而影响植物对低温和高温等非生物胁迫的抗性[８].由于类囊体膜中的C １８ʒ３在植物耐低温胁迫中起重要作用,而其中绝大多数是由叶绿体被膜上的F A D ７和F A D ８催化形成,故此对于F A D ７和F A D ８的研究备受关注.这类F A D 由核基因编码且在不同植物中高度保守.其典型特征是含有３个非常保守的组氨酸簇,它们为F A D 家族酶活性所必须.此外在其N 末端还具有一个导肽序列,负责引导这些蛋白分子向叶绿体９８３１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀薛㊀敏,等:沙冬青A m F A D ７和A m F A D ８基因的克隆与转化及其功能初步分析转运并插入叶绿体被膜中[２６Ｇ２７].本研究克隆的２个F A D基因的编码蛋白均含有这些保守序列,表明它们具备质体型ωＧ３F A D行使功能的基本结构基础.虽然从不同植物克隆的F A D７和F A D８在序列上高度保守,但它们在响应和抵抗低温与高温等非生物胁迫中的表现与作用存在差异.拟南芥A tＧF A D７的表达被低温抑制,而其A t F A D８的表达则受低温诱导;在二者的双突变体(f a d７f a d８)中三烯酸含量比野生型明显降低,伴随着出现其耐热性比野生型增强[１０,２８].最近发现这２个基因的编码产物在不同温度条件下以非冗余协同作用的方式参与三烯酸的合成,它们在底物选择的偏好性上也存在差异[２９].大豆的２对质体型F A D基因也表现出不同的胁迫响应模式:G m F A D７Ｇ１和G m F A D８Ｇ１/８Ｇ２对低温胁迫无响应,而G m F A D７Ｇ２却受低温胁迫的显著诱导[１６].低温胁迫下红花(C a r t h a m u s t i n cＧt o r i u s)叶片中C t F A D７的转录水平略有升高,而其C t F A D８则明显降低[３０].与之相反,低温胁迫下播娘蒿D s F A D７的转录水平趋于降低,而其D s F A D８的转录水平则趋于升高[３１].基于R N AＧS e q表达谱数据和对室内幼苗的半定量R TＧP C R分析结果,可见A m F A D７和A m F A D８在响应低温㊁高温和干燥胁迫中起重要作用,尤其A m F A D７受这３种胁迫的诱导幅度要比A m F A D８明显.在野外高温低温和干旱缺水等复合逆境条件下,二者的表达变化趋势也明显不同,反映出A m F A D７和A m F A D８虽然均为质体型同工酶,但它们在响应逆境中可能起着不同的作用.研究表明,植物细胞膜脂中脂肪酸的不饱和程度是决定膜相变温度的关键因素,通常脂肪酸不饱和度的增加可降低膜的相变温度,有利于提高膜在低温下的稳定性并维持其正常功能,从而避免因膜脂固化造成的膜系统损伤.将拟南芥的A t F A D７和A t F A D８分别导入烟草和水稻中,转基因植株三稀酸含量增加并表现出较强的低温抗性[１４,１７].在番茄中过表达L e F A D３,可增加低温下转基因番茄中C１８ʒ３的含量,而其相对电导率和呼吸速率的增加值却小于对照植株,表明其低温抗性提高[３２].本研究发现,低温胁迫下A m F A D７转基因植株相对电导率增幅较小,膜受到损伤的程度较轻,表明组成型表达A m F A D７增强了转基因植株在低温胁迫下细胞膜的稳定性及其耐冻性.另一方面,膜脂脂肪酸不饱和度的增加不利于维持细胞膜系统在高温胁迫下的稳定性,从而降低植物的耐热性[３３].如在烟草中过表达F A D３和F A D８可增加三稀酸含量,但转基因幼苗的耐热性明显下降;拟南芥f a d７f a d８突变体中三稀酸含量下降,伴随出现植株耐热性的提高[１０,１９].本研究也发现,组成型表达A m F A D７加重了转基因拟南芥在高温胁迫下细胞膜的损伤程度,降低了其耐热性.可见,F A D基因在调节细胞膜脂组成和植物抵抗低温高温以及其他逆境胁迫中的作用较为复杂,可能具有双效甚至多效性.本研究所克隆的A m F A D７和A m F A D８在抵抗温度胁迫以及其他逆境中的确切功能以及作用机理还需进一步深入研究.参考文献:[１]㊀MA R T I N E A UJR,S P E C H TJE,W I L L I AM SJH,e t a l．T e m p e r a t u r e t o l e r a n c e i ns o y b e a n s．I．E v a l u a t i o no fat e c hＧn i q u e f o ra s s e s s i n g c e l l u l a r m e m b r a n et h e r m o ss t a b i l i t y[J]．C r o p S c i e n c e,１９７９,１９(１):７５Ｇ７８．[２]㊀K R A T S C H H A,W I S E R R．T h eu l t r a s t r u c t u r eo f c h i l l i n g s t r e s s[J]．P l a n t,C e l l&E n v i r o n m e n t,２０００,２３(４):３３７Ｇ３５０．[３]㊀G A OJ,WA L L I S JG,B R OW S E J．M u t a t i o n s i n t h e p r o k a r yＧo t i c p a t h w a y r e s c u e t h e f a t t y a c i db i o s y n t h 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wo f P l a n tB i o l o g y,１９９６,４７(１):５４１Ｇ５６８．[８]㊀H A Z E LJR．T h e r m a l a d a p t a t i o n i nb i o l o g i c a lm e m b r a n e s:i sh o m e o v i s c o u s a d a p t a t i o n t h ee x p l a n a t i o n[J]．A n n u a lR e v i e wo f P h y s i o l o g y,１９９５,５７(１):１９Ｇ４２．[９]㊀U P C HU R C H RG．F a t t y a c i d u n s a t u r a t i o n,m o b i l i z a t i o n,a n d r e g u l a t i o n i n t h e r e s p o n s e o f p l a n t s t o s t r e s s[J]．B i o t e c h n o l oＧg y L e t t e r s,２００８,３０(６):９６７Ｇ９７７．[１０]㊀MU R A K AM IY,T S U Y AMA M,K O B A Y A S H IY,e t a l．T r i e n o i c f a t t y a c i d sa n d p l a n t t o l e r a n c eo fh i g ht e m p e r a t u r e０９３１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷[J]．S c i e n c e,２０００,２８７(５４５２):４７６Ｇ４７９．[１１]㊀I B A K．A c c l i m a t i v e r e s p o n s e t o t e m p e r a t u r e s t r e s s i nh i g h e r p l a n t s:a p p r o a c h e s o f g e n e e n g i n e e r i n g f o r t e m p e r a t u r e t o l e rＧa n c e[J]．A n n u a lR e v i e w o f P l a n tB i o l o g y,２００２,５３(１):２２５Ｇ２４５．[１２]㊀O H L R O G G EJ,B R OW S EJ．L i p i db i o s y n t h e s i s[J]．T h e P l a n tC e l l,１９９５,７(７):９５７．[１３]㊀WA L L I SJG,B R OW S EJ．M u t a n t so f A r a b i d o p s i s r e v e a l m a n y r o l e s f o rm e m b r a n e l i p i d s[J]．P r o g r e s s i nL i p i d R eＧs e a r c h,２００２,４１(３):２５４Ｇ２７８．[１４]㊀WA N GJ,M I N GF,P I T TMA NJ,e t a l．C h a r a c t e r i z a t i o n o fa r i c e(O r y z as a t i v a L．)g e n ee n c o d i n g at e m p e r a t u r eＧd eＧp e n d e n t c h l o r o p l a s tωＧ３f a t t y a c i dd e s a t u r a s e[J]．B i o c h e m iＧc a la nd B i o p h y s i c a l Re s e a r c h C o m m u n i c a t i o n s,２００６,３４０(４):１２０９Ｇ１２１６．[１５]㊀L I U X Y,T E N G Y B,L IB,e t a l．E n h a n c e m e n to f l o wＧt e m p e r a t u r et o l e r a n c ei nt r a n s g e n i ct o m a t o p l a n t s o v e r e xＧp r e s s i n g L e f a d７t h r o u g hr e g u l a t i o n o ft r i e n o i cf a t t y a c i d s[J]．P h o t o s y n t h e t i c a,２０１３,５１(２):２３８Ｇ２４４．[１６]㊀R OMÁNÁ,A N D R E U V,H E R NÁN D E Z M L,e t a l．C o nＧt r i b u t i o no f t h e d i f f e r e n t o m e g aＧ３f a t t y a c i dd e s a t u r a s e g e n e st o t h e c o l d r e s p o n s e i ns o y b e a n[J]．J o u r n a l o f E x p e r i m e nＧt a lB o t a n y,２０１２,６３(１３):４９７３Ｇ４９８２．[１７]㊀K O D AMA H,HAMA D AT,H O R I G U C H IG,e t a l．G e n e tＧi c e n h a n c e m e n t o f c o l d t o l e r a n c eb y e x p r e s s i o no f a g e n e f o rc h l o r o p l a s t[o m e g a]Ｇ３f a t t y a c i dde s a t u r a s e i nt r a n s g e n i c t oＧb ac c o[J]．P l a n t P h y s i o l o g y,１９９４,１０５(２):６０１Ｇ６０５．[１８]㊀I M YJ,H A NO,C HU N GGC,e t a l．A n t i s e n s e e x p r e s s i o n o f a n A r a b id o p s i s o me g aＧ３f a t t y a c i d d e s a t u r a s eg e n e r e d u c e ss a l t/d r o u g h t t o l e r a n c e i n t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s[J]．M o lＧe c u l e s a n dC e l l s,２００２,１３(２):２６４Ｇ２７１．[１９]㊀Z HA N G M,B A R G R,Y I N M,e t a l．M o d u l a t e d f a t t y a c i dd e s a t u r a t i o nv i a o v e r e x p r e s s i o n o f t w o d i s t i n c tωＧ３d e s a t u r a sＧe s d if f e r e n t i a l l y a l t e r s t o l e r a n c e t ov a r i o u s a b i o t i c s t r e s s e s i nt r a n s g e n i c t o b a c c oc e l l sa n d p l a n t s[J]．T h eP l a n tJ o u r n a l,２００５,４４(３):３６１Ｇ３７１．[２０]㊀T E I X E I R A M C,C A R V A L H OIS,B R O D E L I U S M．ωＧ３f a t t y a c i dd e s a t u r a s eg e n e s i s o l a t e d f r o m p u r s l a n e(P o r t u l a c ao l e r a c e a L．):e x p r e s s i o n i nd i f f e r e n t t i s s u e s a n dr e s p o n s e t oc o l da nd w o u n ds t re s s[J]．J o u r n a lof Ag r i c u l t u r a la n dF o o dC h e m i s t r y,２０１０,５８(３):１８７０Ｇ１８７７．[２１]㊀Y U R C H E N K O OP,P A R KS,I L U T DC,e t a l．G e n o m eＧw i d e a n a l y s i s o f t h e o m e g aＧ３f a t t y a c i d d e s a t u r a s e g e n e f a m i l yi n G o s s y p i u m[J]．B M CP l a n tB i o l o g y,２０１４,１４(１):３１２．[２２]㊀G A OF,WA N GN,L IH,e t a l．I d e n t i f i c a t i o n o f d r o u g h tＧr eＧs p o n s i v e m i c r o R N A sa n dt h e i rt a r g e t si n A m m o p i p t a n t h u sm o n g o l i c u s b y u s i n g h i g hＧt h r o u g h p u t s e q u e n c i n g[J]．S c i e nＧt i f i c R e p o r t s,２０１６,６:３４６０１Ｇ３４６１６．[２３]㊀WU Y,W E IW,P A N GX,e t a l．C o m p a r a t i v e t r a n s c r i p t o m e p r o f i l i n g o f a d e s e r t e v e r g r e e n s h r u b,A m m o p i p t a n t h u s m o nＧg o l i c u s,i nr e s p o n s e t od r o u g h t a n dc o l ds t r e s s e s[J]．B M CG e n o m i c s,２０１４,１５(１):６７１．[２４]㊀林清芳,王茅雁,刘佳杰,等．沙冬青细胞与分子生物学研究进展[J]．植物遗传资源学报[J]．２０１０,１１(６):７９３Ｇ７９７．L I N QF,WA N G M Y,L I UJ J,e t a l．R e s e a r c h p r o g r e s s o fc e l l a nd m o le c u l a rb i o l o g y of A m m o p i p t a n t h u s[J]．J o u r n a lo f P l a n tG e n e t i cR e s o u r c e s,２０１０,１１(６):７９３Ｇ７９７．[２５]㊀赵世杰,苍㊀晶．植物生理学实验指导[M]．北京:中国农业出版社,１９９８:１６１Ｇ１６５．[２６]㊀L O SD A,MU R A T A N．S t r u c t u r ea n de x p r e s s i o no f f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s[J]．B i o c h i m i c a e tB i o p h y s i c aA c t a(B B A)ＧL i p i d s a n dL i p i d M e t a b o l i s m,１９９８,１３９４(１):３Ｇ１５．[２７]㊀Y A D A V NS,W I E R Z B I C K IA,A E G E R T E R M,e t a l．C l oＧn i n g o fh i g h e r p l a n t[o m e g a]Ｇ３f a t t y a c i dd e s a t u r a s e s[J]．P l a n t P h y s i o l o g y,１９９３,１０３(２):４６７Ｇ４７６．[２８]㊀I B A K,G I B S O NS,N I S H I U C H I T,e t a l．A g e n e e n c o d i n g ac h l o r o p l a s t o m e g aＧ３f a t t y a c i dde s a t u r a s e c o m p l e m e n t s a l t e rＧa t i o n s i n f a t t y a c i dd e s a t u r a t i o na n d c h l o r o p l a s t c o p y n u mb e ro f t h e f a d７m u t a n to f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J]．J o u r n a l o fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,１９９３,２６８(３２):２４０９９Ｇ２４１０５．[２９]㊀R OMÁNÁ,H E R NÁNDE Z M L,S O R I AＧG A R CÍAÁe t a l．N o nＧr e d u n d a n t c o n t r i b u t i o no f t h e p l a s t i d i a lF A D８ωＧ３d e s a tＧu r a s e t o g l y c e r o l i p i du n s a t u r a t i o n a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s i nA r a b i d o p s i s[J]．M o l e c u l a r P l a n t,２０１５,８(１１):１５９９Ｇ１６１１．[３０]㊀G U A NL,WU W,HUB,e t a l．D e v o l o p m e n t a l a n d g r o w t h t e m p e r a t u r e r e g u l a t i o n o f o m e g aＧ３f a t t y a c i d d e s a t u r a s e g e n e si n s a f f l o w e r(c a r t h a m u s t i n c t o r i u s L．)[J]．G e n e tM o lR e s．,２０１４,１３(３):６６２３Ｇ６６３７．[３１]㊀T A N GS,G U A NR,Z H A N G H,e t a l．C l o n i n g a n d e x p r e sＧs i o na n a l y s i s o f t h r e e c D N A s e n c o d i n g o m e g aＧ３f a t t y a c i dd eＧs a t u r a s e s f r o m D e s c u r a i n i as o p h i a[J]．B i o t e c h n o l o g y L e tＧt e r s,２００７,２９(９):１４１７Ｇ１４２４．[３２]㊀Y U C,WA N G HS,Y A N GS,e t a l．O v e r e x p r e s s i o no f e nＧd o p l a s m i cre t i c u l u m o m e g aＧ３f a t t y a c i dd e s a t u r a s eg e n e i mＧp r o v e s c h i l l i n g t o l e r a n c ei nt o m a t o[J]．P l a n tP h y s i o l o g ya n dB i o c h e m i s t r y,２００９,４７(１１Ｇ１２):１１０２Ｇ１１１２．[３３]㊀V I J A Y A NP,B R OW S E J．P h o t o i n h ib i t i o n i nm u t a n t s o f A rＧa b i d o p s i s d e f i c i e n t i n t h y l a k o i d u n s a t u r a t i o n[J]．P l a n t P h y sＧi o l o g y,２００２,１２９(２):８７６Ｇ８８５．(编辑:宋亚珍)㊀㊀１９３１８期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀薛㊀敏,等:沙冬青A m F A D７和A m F A D８基因的克隆与转化及其功能初步分析。

沙冬青耐寒基因AmGolS的克隆和遗传转化研究的开题报告一、选题背景与意义沙冬青（Hippophae rhamnoides L.）是一种耐盐耐寒的草本植物，广泛分布于我国北方的沙漠和临海沙滩地区，具有重要的生态与经济价值。

在北方干旱或半干旱地区，沙冬青常常是当地最主要的植被覆盖，有保护土地、改善环境、固碳减排、开发药食品等多方面用途，具有广阔的发展前景。

沙冬青能够在极寒的自然环境下生长，其机制与耐寒基因密切相关。

在过去的研究中，人们已经通过克隆、功能分析等手段鉴定出了一些沙冬青的耐寒基因，如Raf-L和Hrrubisco，然而，探究沙冬青耐寒基因的物理和调控机制，以及对其进行遗传转化的研究还较为欠缺。

因此，本研究拟克隆沙冬青耐寒基因AmGolS，并对其进行功能鉴定和遗传转化研究，以期在深入探究沙冬青适应极端环境机制的基础上，为其良种育种和遗传改良提供理论支持。

二、研究内容与方法（一）克隆沙冬青AmGolS基因的方法1、提取沙冬青基因组DNA，并构建基因组文库。

2、设计一对AmGolS基因的引物，并进行PCR扩增。

3、将扩增的AmGolS基因序列克隆到pUC19载体中，经过序列分析和验证。

（二）对AmGolS基因的功能鉴定1、对AmGolS基因进行表达谱分析和时空分布分析。

2、利用冻胁迫等条件诱导沙冬青，观测AmGolS基因在逆境条件下的表达情况。

3、将AmGolS基因转化到拟南芥中，观测拟南芥的耐寒性变化。

（三）遗传转化沙冬青的方法1、设计转化载体pCambia3300-AmGolS并构建出载体。

2、将载体转化到沙冬青愈伤组织中，筛选出含已转化的AmGolS基因的植株。

3、对AmGolS转基因沙冬青的表型和代谢特征进行分析和比较。

三、预期研究结果与意义本研究拟通过克隆和功能鉴定的方法揭示沙冬青耐寒机制中的一个重要基因AmGolS，并构建该基因的遗传转化系统，为深入探究沙冬青的适应机制提供实验依据和理论基础。

2003年7月重庆大学学报Jul.2003 第26卷第7期Journal of Chongqing University Vol.26 No.7文章编号:1000-582X(2003)07-0081-05植物抗寒基因工程研究最新进展王凭青,吴明生,王远亮,朱久进(重庆大学生物工程学院,重庆 400044)摘 要:低温是限制农作物分布和产量的一种非生物胁迫因素,因此提高植物的抗寒性对农业具有十分重要的意义。

许多植物在经过一段时间的非冻低温作用后其抗寒性获得增强,这种现象被称为植物的低温驯化。

最近10年来,随着对植物低温驯化的分子机制研究的不断深入,植物抗寒基因工程研究获得了长足的进展。

目前应用于植物抗寒基因工程的基因包括两大类:保护基因与调控基因,两者都表现出良好的应用前景。

然而,植物抗寒基因工程研究领域也存在着大量的问题急需解决。

关键词:低温驯化;分子机制;基因工程中图分类号:Q945.7文献标识码:A低温伤害不仅会限制农作物的栽种范围,也会造成农作物减产。

所以有关植物抗寒性的研究一直以来都是植物学研究领域的热点之一。

以前由于对植物的抗寒性分子机理认识不够,提高植物的抗寒性主要是依靠传统的育种方法,虽然也取得过一定的成绩,但是由于其周期长,效果差,而且工作繁琐,已不适应现代农业的发展需求[1]。

最近10年来,随着对抗寒分子机理的认识不断加深,人们不断尝试着采用基因工程手段培育抗寒新品种[1],并且颇有成效。

笔者将综合近几年来植物抗寒基因工程研究方面的最新进展并进行讨论。

1 植物的抗寒分子机理植物的抗寒性是一种潜在的遗传特性,只有经过一定时间的非冻低温(2~6 )驯化才具有较强的抗寒性。

自从1985年Guy[2]首次提出植物低温驯化过程中基因表达发生变化的观点后,有关抗寒分子机理的研究日新月异。

植物细胞膜在感受外界低温信号时,细胞膜的流动性发生改变,同时伴随着细胞骨架的重排。

它们通过流向胞质的钙流将体外的低温物理信号转化为体内的生化信号[3-4]。

沙冬青逆境胁迫分子生物学研究进展孙朋卫;顾立江;程红梅【摘要】逆境胁迫是影响植物生长发育的重要因素,植物的抗逆机理是分子生物学研究的重要领域。

随着分子生物学技术的发展,有关植物抗逆方面的研究已取得了很大的进展,初步揭示了植物应对逆境胁迫适应性的分子机理。

沙冬青是我国温带荒漠地区惟一的常绿灌木,具有很强的抗逆性,是开展植物逆境胁迫研究和抗逆基因筛选的理想材料。

本文综合论述了抗逆植物沙冬青的抗逆机理及逆境胁迫相关基因的分子生物学研究进展,为植物抗逆基因工程发掘更多的基因资源和抗旱植物的抗逆性研究提供思路。

%Abiotic stress is the most important factor that affect plant growth and development, plant stress resistance mechanism is a main area of plant molecular biology. With the development of molecular biology techniques, the research on plant abiotic stress has made great progress, and the molecular mechanism of plant response to stress has been revealed initially. This review discusses the abiotic stress related mechanism and molecular biology of Ammopiptanthus mongolicus under the drought, cold and salty stress, in order to identify more resources and new stress tolerance genes for plant genetic engineering and to provide ideas of plant stress resistance research.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2011(001)006【总页数】6页(P403-408)【关键词】逆境胁迫;抗逆机理;分子生物学;沙冬青【作者】孙朋卫;顾立江;程红梅【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】Q78逆境胁迫是指包括高温、低温、干旱、盐胁迫等在内对植物正常的生长发育产生不利影响的环境因子。

专利名称：沙冬青低温胁迫相关基因及其表达载体和应用专利类型：发明专利
发明人：程红梅,顾立江,郭惠明
申请号：CN201310254613.3
申请日：20130625
公开号：CN103509804A
公开日：
20140115
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了沙冬青低温胁迫相关基因及其表达载体和应用，属于植物抗逆相关基因的分离及其应用领域。

本发明提供了从沙冬青中分离的与低温胁迫相关的基因，其cDNA序列为SEQ ID No.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含有该基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

本发明进一步提供了一种提高或改善植物抗低温胁迫的方法，包括：构建含有所述基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化到受体植物或植物细胞中，培育筛选得到转基因植物品种。

本发明所分离的沙冬青温度相关基因在提高植物对环境胁迫抗性或培育抗低温胁迫植物品种等方面具有重要的应用潜力。

申请人：中国农业科学院生物技术研究所
地址：100081 北京市海淀区中关村南大街12号
国籍：CN
代理机构：北京康思博达知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：余光军
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