一株抗马传染性贫血病毒p26蛋白单克隆抗体识别差异表位鉴定

中国农业科学院博士学位论文马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变作用姓名：***申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：孔宪刚;童光志20050601摘要马传染性贫血病毒（ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＥＩＡＶ）属反转录病毒科馒病毒属，是马传染性贫血（ＥＩＡ．简称马传贫）的病原体。

我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为Ｉｔ世界上唯一投入麻用的慢病毒疫苗。

该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。

反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（ＬＴＲ）对病毒复制有重要的调控作用，影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。

反转录病毒的囊膜蛋白，由于其基冈的高度变异性，受到病毒学研究的普遍关注，通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒Ｌ株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析，发现二者的ＬＴＲ和＂ｖ基冈（尤其是ｇｐ９０编码区）筹异较大。

为了研究ｅｎｖ基囡ｇｐ９０在我国ＥＩＡＶ－ＤＬＡ致弱过程中的作用．我们以ＥＩＡＶ强毒辽‘ｊ啉（Ｌ株）接种健康马，从不同时期发热期马血清中以ＲＴ＿ＰｃＲ扩增包含完整ｓ２基醐ｑｇｐ９０基因片段；同时以ＥＩＡＶ－ＤＬＡ接种健康驴白细胞并用ＲＴ－ＰＣＲ扩增相同的基因片段，将所得的强弱毒共３０个ｅｎｖ基冈ｇｐ９０进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现，强弱毒ｇｐｇＯ序列存在着多个位点高度的一致性变异．所推导的氨基酸也存在１９个位点极其一致性变异．这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失，其中，氨基酸在极性与非极性之间的变换及氮基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。

在对其它慢病毒（如Ｈ１Ｖ、ＳＩＶ）研究过程中发现，糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。

经过序列及氨基酸的比较历发现．ｇｐ９０基囡Ｖ３到ｖ５Ｖ在强毒和弱毒之间差异显著，而在各自内部相对保守，变异较小。

马传染性贫血病毒受体选择性剪接异构体的鉴定与分析杨非;张淑琴;杜承;林跃智;周建华【摘要】Alternative splicing is an important mechanism of post-transcriptional regulation, which increases transcriptome and proteome diversifications by generating multiple mRNA products from a specific gene. The equine lentivirus receptor 1 (ELR1) was found as the only receptor for equine infectious anemia virus (EIAV) and identified as a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily. To investigate the alternative splicing of ELR1, cDNA clones of the receptor were constructed from the total RNA extracted from cultured primary equine macrophages. Sequence analysis of these clones revealed two major types of alternative splicing variants of ELR1, i.e., one type with an insertion (ELR1-IN) and the other with a deletion (ELR1-DE) in the coding region. ELR1-IN contained an insert of 153 bp between the 786 nt to 787 nt of the published ELR1 cDNA sequence, and ELR1-DE had a deletion of 64 bp between the sites of 415 nt to 478 nt. Both of these changes of sequence shifted the open reading frame of ELR1. Especially, the insertion resulted in the termination of translation at the site upstream of the transmembrane domain of the receptor, and encoded a soluble ELR1. This work provides a new insight for the interaction between EIAV and host.%马慢病毒受体1 (ELR1)是马传染性贫血病毒(ELAV)唯一受体,属于肿瘤坏死因子受体超家族.为研究ELR1 mRNA选择性剪接的状况,本研究从EIAV靶细胞的巨噬细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增并克隆测序.结果显示,ELR1 mRNA具有不同形式的选择性剪接异构体,主要表现为插入和缺失形式.插入片段为153bp,位于序列的786nt～787nt之间,而缺失型异构体丢失了ELR1序列的415nt～478nt.不论序列的插入或缺失,均导致该基因编码框移位.特别是插入型异构体,编码框在跨膜区之前遇到终止密码子,造成翻译的提前终止,推测产生截短的可溶性ELR1.这些剪接异构体的鉴定为研究EIAV与机体的相互作用提供了新的研究方向.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2012(034)006【总页数】4页(P428-431)【关键词】选择性剪接;马传染性贫血病毒;受体;RT-PCR【作者】杨非;张淑琴;杜承;林跃智;周建华【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院特产研究所人兽共患病实验室,吉林长春130112;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65真核生物mRNA的选择性剪接现象是指由单个基因产生多种转录本的一种重要基因表达现象[1]。

马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达研究的开题报告研究背景及意义：马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus，EIAV）是一种引起马类动物传染性贫血病的病原体，属于反转录病毒。

传统的马传染性贫血病毒疫苗基于病毒灭活或化学物质处理，但这些方法存在诸多缺陷，例如易失去免疫原性、安全性不高等。

因此，开发新型疫苗成为了研究的热点。

病毒的膜蛋白（Membrane protein，M）是病毒入侵宿主细胞并制造新的病毒颗粒的重要分子。

通过对M基因进行改造，可以提高疫苗的免疫原性和安全性。

研究内容：1. 对EIAV M基因进行改造，利用PCR技术构建M基因突变，包括去除膜外区域、加入CD40L作为增强响应元素等。

2. 将构建好的M基因重组到真核表达载体中，利用高效转染技术将其转染至HEK 293T细胞表达，检测表达效果。

3. 对表达的M膜蛋白进行Western blot检测以及免疫荧光检测，验证M基因改造后蛋白的表达及功能。

预期结果：成功构建改造后的EIAV M基因，并成功将其表达于HEK 293T细胞中。

通过Western blot检测和免疫荧光检测，证明表达的M膜蛋白是正确的，并能发挥其功能。

这将为开发新型马传染性贫血病毒疫苗提供理论和实验依据。

研究方案：1. 通过PCR技术得到改造后的M基因片段；2. 将M基因重组到真核表达载体pmcherryC1中；3. 利用高效转染技术将载体转染至HEK 293T细胞中，培养24-48小时；4. 提取细胞蛋白，Western blot检测M膜蛋白的表达；5. 进行免疫荧光检测，验证其在细胞膜上的表现；6. 对结果进行统计分析。

时间安排：第一周：准备工作，获取M基因DNA及pmcherryC1载体；第二周：改造M基因，克隆到pmcherryC1中；第三-五周：将载体转染至HEK 293T细胞，培养细胞；第六周：Western blot检测和免疫荧光检测；第七周：统计分析结果，并撰写开题报告。

马传染性贫血病毒弱毒疫株S2基因在体内变异分析的开题报告尊敬的评委和领导：本人拟开展的课题为“马传染性贫血病毒弱毒疫株S2基因在体内变异分析”，现就该课题进行开题报告，诚挚希望能够得到评委和领导的支持和指导。

一、研究背景马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus，EIAV）属于逆转录病毒，可引起马的传染性贫血，导致多种器官功能障碍，严重时可导致死亡。

长期以来，马传染性贫血病毒给马产业的发展造成巨大的损失。

目前，针对马传染性贫血病毒发展的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗两种，而弱毒疫苗的安全性和有效性是当前的研究方向之一。

S2基因是马传染性贫血病毒的一种特定结构蛋白基因，具有重要的免疫学意义。

已有研究发现弱毒疫苗中S2基因具有一定的变异性，但目前对S2基因在体内的变异情况研究不够充分。

因此，本研究将对马传染性贫血病毒弱毒疫株S2基因在体内的变异进行分析，为疫苗研制提供理论依据。

二、研究方法本研究将选取马传染性贫血病毒弱毒疫株，通过体内感染马的方式进行病毒复制，采集体内病毒负荷高的组织样本（如脾脏、淋巴结等），从中提取RNA并进行S2基因的PCR扩增。

随后，将扩增出的S2基因进行克隆测序，获取S2基因在体内变异的信息。

三、研究预期结果本研究将通过体内实验获取马传染性贫血病毒弱毒疫株S2基因的变异情况，并对其变异特征进行分析。

预计能够发现S2基因在体内的变异特征，为弱毒疫苗的研发提供理论基础和实验支持。

四、研究意义本研究将对马传染性贫血病毒弱毒疫苗的研制提供重要的实验依据，进一步扩大我国农业科技发展的领域，并在理论和实践上推动马产业的可持续性发展。

同时，本研究工作也将为其他相关逆转录病毒的变异研究提供借鉴和参考。

五、研究计划1.实验选材：选择适合实验的马种与数量，选取马传染性贫血病毒弱毒疫株。

2.实验流程：通过体内感染马的方式进行病毒复制，采集体内病毒负荷高的组织样本，从中提取RNA并进行S2基因的PCR扩增。

马传染性贫血病病毒核心蛋白基因的克隆和表达
孔宪刚;孙荣芳
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】1999(021)006
【摘要】根据美国马传染性贫血病病毒（ＥＩＡＶ）Ｗｙｏｍｉｎｇ株基因序列，设计扩增ＥＩＡＶｇａｇ和ｐ２６基因的引物，用ＰＣＲ法能忠实的分别扩增出全长ｇａｇ的ｐ２６基因。

经用杆状病毒表达和地的获ｇａｇ和ｐ２６基因进行克隆和重组，获得了高效稳定表达Ｇａｇ和ｐ２６蛋白的重组杆状病毒。

含有ｇａｇ和ｐ２６基因的重组杆状病毒感染昆虫Ｓｆ２１细胞，经无血清昆虫细胞培养基增殖和纯化，每升培养物能获得２ｍｇＧａｇ或１２ｍ
【总页数】4页(P419-422)
【作者】孔宪刚;孙荣芳
【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;中国农业科学院哈尔滨兽医研究
所
【正文语种】中文
【中图分类】S858.215.3
【相关文献】
1.扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白基因的克隆和表达 [J], 张振清;张爽;黄弋;张波;胡晓敏;袁志明
2.马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达 [J], 陈新江;孟庆
来;毛洁;张晓燕;张耀洲
3.鸟传染性支气管炎病毒RNA结合蛋白基因的克隆和表达 [J], 袁宁;王汉屏;王艳
4.重组马传染性贫血病病毒核心蛋白抗原在AGID和ELISA中应？… [J], 孔宪刚;陶伟英
5.犬瘟热病毒R/20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达 [J], 王琛;袁宝;任文陟;张嘉保;赵志辉
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马传染性贫血病毒拮抗马属动物天然免疫限制因子SAMHD1的分子机制研究SAMHD1因被发现可以限制人免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）的复制而引起人们的广泛关注。

SAM-HD1是一种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs ）水解酶（dNTPase ），通过水解细胞内的dNTPs ，将其维持在病毒反转录所需的浓度以下，从而限制逆转录病毒的复制。

在巨噬细胞中，SAMHD1这一生物学功能使得HIV-1不能在其中有效复制。

与HIV-1不同，HIV-2和一些猴免疫缺陷病毒（SIV ）编码的Vpx 蛋白可招募宿主的E3泛素连接酶CRL4DCAF1，特异性泛素化SAMHD1，使之通过蛋白酶体途径降解进而拮抗SAMHD1的限制作用。

马传染性贫血病毒（EIA V ）与HIV-1同属于逆转录病毒科慢病毒属，EIA V 主要感染马巨噬细胞并可在其中活跃复制。

EIA V 并不编码与具有降解人SAMHD1功能的Vpx 同源的蛋白，EIA V 是如何在SAMHD1存在的巨噬细胞中建立感染的机制此前尚不清楚。

近期，《Autophagy 》在线发表了“Equine lentivi-rus counteracts SAMHD1restriction by Rev-mediated degradation of SAMHD1via the BECN1-dependent ly-sosomal pathway ”的研究论文。

该研究显示，马SAMHD1（EfSAMHD1）可以限制EIA V 的复制，但其抗病毒活性可以被EIA V 编码的附属蛋白Rev 所拮抗，EIA V Rev 通过依赖于Beclin1（BECN1）和PIK3C3，但不依赖于经典自噬的溶酶体途径降解EfSAMHD1来拮抗SAMHD1的限制作用。

该研究通过过表达和敲低EfSAMHD1的表达等试验证实EfSAMHD1通过抑制EIA V 的反转录阶段来限制病毒的复制，EfSAMHD1的dNTPase 活性对其抗病毒功能是必需的。

一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定李敏华1;王倩2;田志军2*;金涛1*【摘要】为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSVMAb的杂交瘤细胞株(1H4).鉴定结果显示,1H4 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链.1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1:40,腹水的IFA效价是1:3 200.阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断.Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107～aa 123.该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础.%In order to prepare the monoclonal antibody (MAb) against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), the splenic cells of immunized mice with PRRSV were fused with SP2/0 myeloma cells, and a hybridoma cell line (1H4) stably secreting the MAb against PRRSV was screened. The identification results indicated the 1H4 MAb was IgG1 subclass with κ light chain. The MAb titer in cell culture medium and ascites were ：40 and 1：3, 200,respectively. The blocking ELISA detection showed that the binding of the MAb to the virus was blocked by PRRSV positive serum. The MAb was able to specifically recognize the N protein of PRRSV detected by western blot. The antigen sequence of the epitope recognized by the MAb was identified within aa107-aa123 of N protein (107PTQHTVRLIRATASPSA123) by pepscan technique, which is the highlyconservative epitope sequences among the N protein of American (Type2) PRRSV strains. The preparation of MAb provided foundation for further development of detecting technique of blocking ELISA against PRRSV with high specificity and sensitivity.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2019(041)003【总页数】5页(P279-283)【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒;单克隆抗体;细胞融合;N蛋白;表位鉴定【作者】李敏华1;王倩2;田志军2*;金涛1*【作者单位】黑龙江大学生命科学学院/ 微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150080;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150069;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150069;黑龙江大学生命科学学院/ 微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150080【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的影响世界养猪业健康发展的重要传染病之一。

马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达陈新江;孟庆来;毛洁;张晓燕;张耀洲【期刊名称】《浙江理工大学学报》【年(卷),期】2008(025)005【摘要】以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关.为解决这些问题,合成了EIAV gp120基因(Syn-env),使其密码子偏嗜性符合高水平表达的哺乳动物基因.EIAV弱毒疫苗的制备过程中,出现了几个重要而稳定的N-糖基突变住点,以Syn-env为基础,运用重叠延伸PCR定点突变策略获得了6个具有不同N-糖基缺失组合的gp120基因.将突变后的基因克隆到真核表达载体pVRCSV1.0,然后转染Hela细胞,发现这些重组质粒均获得了表达.进而为比较6种质粒诱导机体免疫保护效果,阐明EIAV弱毒疫苗减毒机理奠定了基础.【总页数】7页(P547-553)【作者】陈新江;孟庆来;毛洁;张晓燕;张耀洲【作者单位】浙江理工大学生物化学研究所,杭州,310018;中国疾病预防控制中心性病艾滋痛预防与控制中心,北京,100050;浙江理工大学生物化学研究所,杭州,310018;中国疾病预防控制中心性病艾滋痛预防与控制中心,北京,100050;浙江理工大学生物化学研究所,杭州,310018【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达[J], 程林;卢春;陈秀英;曾怡;姚水洪;秦娣2.猕猴B病毒囊膜蛋白gD基因真核细胞表达载体的构建及表达 [J], 王新;易思萌;刘慧芳;马凯;范君文;马雨楠;游颖;孙兆增3.兔病毒性出血症病毒VP60基因真核表达载体的构建以及在真核细胞中表达 [J], 张夏兰4.血清I型马立克氏病病毒被膜蛋白UL11在真核细胞内的表达 [J], 贾雪波;范建华;苗晋锋5.逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验初报[J], 许信刚;胡建和;张彦明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

抗马传贫病毒单克隆抗体试剂在鉴别诊断上的应用
郑兆基;孔令德
【期刊名称】《动物检疫》
【年(卷),期】1989(000)003
【摘要】马传染性贫血(简称马传贫)是对马匹危害较大,无法治疗的慢性传染病。

近十几年来,我省采取以注射马传染贫驴白细胞弱毒疫苗为主要预防手段,收到了较好的成效。

但是,患本病的马匹和注射本疫苗的马匹,均出现血清学阳性反应,只依现行的免疫扩散试验(ID)等法检查,对二者无法区别。

这是注疫苗以来。

【总页数】2页(P13-14)
【作者】郑兆基;孔令德
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S858.210.4
【相关文献】
1.抗猪细小病毒单克隆抗体在猪细小病毒病诊断上的应用 [J], 谢琴;王东
2.免疫酶斑点法在马传贫田间检疫上的应用 [J], 严宝英;田润
3.抗小鹅瘟病毒单克隆抗体及其在防治上的初步应用 [J], 朱少璇;董国雄
4.抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体试剂盒的研制及应用 [J], 唐恩华;庄俊英;王立言;刘名英;王宪焘;谢天宏;文喻玲;阮永良;秦红星;郭仁
5.抗家蚕浓核症病毒单克隆抗体的制备及其在诊断上的应用 [J], 陈建国;滕俊琳;胡萃;马可
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马传染性贫血病毒美洲流行株与我国弱毒疫苗株鉴别诊断方法的研究耿庆华;王晓钧;赵立平;吕晓玲;沈荣显;相文华【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2006(021)001【摘要】马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）是反转录病毒科慢病毒属的成员，是马传染性贫血病的病原。

二十世纪七十年代我国就研制出马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗，成为世界第一个成功地应用该疫苗控制了我国的马传贫的发生。

而且我国的马传贫弱毒疫苗对异源的美国、古巴和阿根廷等毒株也有很高的保护率。

【总页数】3页(P81-83)【作者】耿庆华;王晓钧;赵立平;吕晓玲;沈荣显;相文华【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用 [J], 秦毅斌;卢冰霞;段群棚;何颖;李斌;梁家幸;苏乾莲;周英宁;蒋冬福2.马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株致弱过程中不同代次病毒LTR的进化分析 [J], 王雪峰;杨彬;韩秀娥;林跃智;姜成刚;吕晓玲;赵利平;周建华;王凤龙3.马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株囊膜基因的优化及其DNA疫苗体外瞬时表达研究 [J], 侯绍华;彭金美;周涛;袁秀芳;汪明;童光志4.马传染性贫血病病毒驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组核苷酸序列分析 [J], 杨志彪;王柳;童光志;孔宪刚;仇华吉5.马传染性贫血病毒白细胞弱毒疫苗株及其亲本毒驴强毒株前病毒基因组比较分析[J], 王雪峰;姜成刚;郭巍;项伟;吕晓玲;赵立平;王凤龙;孔宪刚;张晓燕;邵一鸣;周建华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建王柳;杨志彪;刘红全;智海东;仇华吉;童光志【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2000(000)0S1【摘要】采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ，这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组，ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接，获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒，将其命名为ｐ８．０。

将此８．０ＫｂＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整ＥＩＡＶＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中，获得一含有ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为ｐ８．２，经核苷酸序列分析，证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。

用ｐ８．２转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶，说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。

驴白细胞经该克隆毒感染后，第４天出现病变，经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，进一步证明ｐ８．２具有感染性，我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆，为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。

【总页数】1页(P)【作者】王柳;杨志彪;刘红全;智海东;仇华吉;童光志【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所【正文语种】中文【中图分类】S85【相关文献】1.鸡传染性法氏囊病病毒Gt株感染性分子克隆的构建 [J], 祁小乐;高宏雷;高玉龙;邓小芸;步志高;王晓燕;王笑梅2.中国马传染性贫血病毒驴强毒株感染性分子克隆的构建 [J], 王晓钧;魏丽丽;相文华;张晓燕;吕晓玲;赵立平;朱远茂;邵一鸣;沈荣显3.马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建 [J], 王柳;童光志;仇华吉;谷守林;涂亚斌;杨志彪4.带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建 [J], 温建新;仇华吉;涂亚斌;王柳;彭金美;童光志5.马传染性贫血病病毒驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组核苷酸序列分析 [J], 杨志彪;王柳;童光志;孔宪刚;仇华吉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

马传染性贫血病毒受体选择剪接变异体的鉴定及功能性研究的开题报告一、研究背景马传染性贫血病毒（EIAV）是一种会引起马的传染性贫血的病毒。

近年来，研究发现EIAV主要通过选择剪接方式产生不同的病毒蛋白，包括外膜蛋白（Env）和反转录酶（RT）。

目前，已发现EIAV能够利用多种糖蛋白作为其受体或辅助因子，但具体机制仍不明确。

因此，本研究拟从EIAV受体选择剪接变异体入手，探究其在病毒侵染和感染过程中的作用机制和调控方式，为病毒疫苗研究和防治提供科学依据。

二、研究目的本研究旨在鉴定EIAV在马体内选择剪接后的受体变异体，探讨其在EIAV感染和病毒复制中的作用机理和调节途径，为深入理解EIAV的诱发机制和疫苗设计提供基础支撑。

三、研究方法1.获取参考序列：检索NCBI、UCSC、ENSEMBL等公共数据库，获取马基因组序列，筛选EIAV感染马细胞时所表达的受体及辅助因子相关基因的引物设计。

2.克隆PCR产物：按照引物设计，从马组织和细胞中克隆病毒入侵所需的受体及辅助因子相关基因的PCR产物，纯化并检验其准确性。

3.基因改造：对PCR产物进行修饰，使其能够转录成EIAV的AntiTR/RevTR引物所需的RNA序列。

4.表达及生化分析：将修饰后的基因克隆至真核表达载体，转染至CHO细胞或马免疫细胞系，稳定表达后，通过免疫组化、Western blot、流式细胞术等方法，对所表达的蛋白进行鉴定和生化分析。

5.功能性分析：根据所表达蛋白的生化特征，在CHO细胞或马免疫细胞系中进行传染性实验，反转录酶实验等，探究其在EIAV感染和病毒复制过程中的功能性作用和相关调控途径。

四、拟解决的问题和意义1. 通过鉴定EIAV在马体内选择剪接后的受体变异体，揭示EIAV感染和病毒复制过程中的作用机理和调节途径，为深入理解病毒致病机制提供科学依据。

2. 针对EIAV的受体变异体，可为病毒疫苗研究和防治提供新的思路和科学依据，有利于研制更加针对性的病毒抗原和防治药物。