第9章重组人红细胞生成素生产工艺

由于结构和性质的差异，胰岛素和生长激素的分离纯化过程有所不同，
涉及的步骤和技术也有所区别。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
要点一
酵母表达系统
要点二
低成本、高产出
酵母作为宿主细胞具有高表达、易培养、易发酵等优点， 有助于提高胰岛素的生产效率。
通过大规模发酵和分离纯化，可以实现低成本、高产出， 降低治疗费用。
使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，能够实现更接近人体 生理状态的糖基化过程，提高生长激素的生物活性。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
更接近人体天然结构
哺乳动物细胞表达的生长激素更接近 人体天然结构，降低了免疫排斥的风 险。
临床效果更佳
由于结构和性质的优化，重组人生长 激素在治疗某些疾病方面具有更好的 临床效果。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的异同点
01 02
原料与培养基
胰岛素生产主要使用酵母作为宿主细胞，而生长激素则更倾向于使用哺 乳动物细胞作为宿主。此外，培养基的成分也有所不同，以满足不同细 胞的需求。
蛋白质修饰
胰岛素和生长激素在蛋白质修饰方面存在差异，以适应其特定的生理功 能和药理作用。
03
分离纯化过程
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
生产成本高
哺乳动物细胞培养成本较高，导致生长激素的生产成本增加。
生产周期长
哺乳动物细胞生长缓慢，培养周期长，影响了生产效率。
潜在的病毒污染风险
虽然采用了各种病毒消除技术，但仍存在病毒污染的风险。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的发展趋势与展望
基因编辑技术应用
通过控制培养条件，如温度、pH、营养物 质等，优化细胞代谢，提高目标蛋白质的产 量。

rhEPO
rhEPO的技术来源
概述
• 20世纪70年代，对人EPO氨基酸序列测定。 • 基于蛋白质序列，设计寡核苷酸探针，从人基因组中克隆
到hEPO基因。 • 1983：Amgen提交了hEPO基因序列与重组hEPO物质组成的
专利
• 分离纯化技术专利：基于天然人红细胞生成素的分离纯化 方法。
• 分析方法：形成质量控制技术
制药工艺学
Pharmaceutical Technology
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第二篇 生物技术制药工艺
第十八章 重组人红细胞生成素的生产工艺
18.1 概述 18.2 工程CHO细胞系的构建 18.3 CHO细胞培养过程与工艺控制 18.4 分离纯化工艺与质量控制
‹#1 红细胞生成素种类 18.1.2 红细胞生成素临床应用 18.1.3 红细胞生成素理化性质 18.1.4重组红细胞生成素的工艺研究
‹# ›
rhEPO
概述
18.1.3 hEPO的理化性质
大 小 ： 165aa;MW34-36ku(SDS-PAGE) 、 30.4ku(超滤) 。 糖链占分子量的39%。 糖基化程度与准确性对活性影响很大 pI4.2 ～ 4.6 ， 对 热 56℃ 和 pH 变 化 （ 3 －10）相对稳定。 较耐有机溶剂，对蛋白酶敏感。
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rhEPO
概述
18.1.1 红细胞生成素的种类
1、红细胞生成素的生成与作用机理
1890：现象，低氧压下红细胞增多 1948 ： Bonsdorff 和 Jalavisto ， 提 出 红 细 胞 生 成 素 （erythropoietin，EPO）。
‹# ›
rhEPO
2、天然红细胞的种类

。
体制 等诸 多 因素 的限制
,
在
15 0 一
,
万肾衰患者 中
7 万
,
能进行 透 析 治疗 的仅
10000
并创 造了 巨大 的经济效益
%
多人
,
但若有
人能用 万
。
我 国慢 性 肾炎 的 年 发病 率 为 其 中约 2 0 发病 例
,
2 5编
.
,
h E R 〕 一 年 的市 场 销 售 量 即 可 达 10 0
口
表明我 们研 制的 有效 年 1 0
, 。
每人 每年 约需 8 0 计
,
支
,
平均
一 50
10 0
支
,
h E R 〕用 于 治 疗 肾性 贫血 是 安全
以 全 国 肾性 贫 血 患 者 四 十 分 之 一 用 此 药
同类 药 品 相 当
。
1996
则 每 年 的 需求 量 达
r
37 5
万支
,
,
月首先 获得新药 证书 得 国家 卫 生 部 批 准 产
19 9 7
年 院校科技进 步奖
重组 人
红
细 胞 生成 素
、
(
r
hEP O
) 注射
2
液
的
研
史
制
江,
临 床 应 用 及 产 业化 生 产
君
,
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胡云龙
,
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勇
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吴
钢
周 国华
古掉 良 ,
陶 开 华’
张 广仁 “
郑 法 雷3
,
重 组人 红细 胞 生 成素 (

・
１ 成素 的制备 方法及鉴定
白 字 王 维 东寰睿 赵 钰 （ 哈 药集团生物 工程有 限公 司， 黑龙 江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ２ ５ ）
摘 要： 氨 甲酰化促红细胞生成素（ ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｍ ｙ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｒ ｙ ｔ ｈ ｒ ｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｎ ，ｃ Ｅ Ｐ ０ ） 具有组织保护作用 ， 又不具有促 红细胞 生成作 用。本研 究以促 红 细胞 生成素 为材料 ， 用氰酸钾使之 甲基化 ， 获得 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ， 并通过 Ｓ Ｄ Ｓ 一 聚丙烯胺凝胶 电泳胶 （ ｓ ０ ｄ ｉ ｕ ｍ ｄ ｏ ｄ ｅ ｃ ｌ ｙ ｓ ｕ ｌ ｆ ａ ｔ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ ａ ｃ ｒ ｙ ｌ ａ ｍｉ ｉ ｄ ｅ ｇ ｅ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ，Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ） 鉴定 ， 证 实促红素 已被氨 甲酰化为氨 甲酰基促红素 ， 并且 纯度较 高。 关键词 ： 促 红细胞 生成素 ； 氨 甲酰化促红细胞生成素 ； 制备方法 ； 鉴 定； 不连续凝胶 电泳分 离
人促红 细胞生 成素 （ ｅ ｒ ｙ ｔ ｈ ｒ ｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｎ ，Ｅ Ｐ Ｏ） 是可 以促进 红细胞生 测定 Ｅ Ｐ Ｏ氨 甲 酰 化 后 反 应 液 的 总 蛋 白 浓 度 为 ０ ， ４ ６ ｍ ｇ 。 成 的体液性因子 ， 临床上常用于治疗 肾性贫血等多种原 因导致 的贫 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ不连续凝 胶电泳结果表 明蛋 白内切酶酶切后 Ｅ Ｐ Ｏ发 生 血， 此外 ， Ｅ Ｐ Ｏ也 可用 于机体 内多种组织和细胞的保护 ， 但 过量使用 降解 ， Ｅ Ｐ Ｏ原液 中的相对分子质量 １ ． ６×１ ０ ４ 的蛋 白谱 带消失 ，出现 会带来红细胞增多 、 血压升高或血栓形成等不 良反应『 ｌ ＿ 。 氨 甲酰化促 相对分 子质 量约为 ３ ． ４×１ ０ ４ 的单一谱 带 ，并且酶切后 的 Ｅ Ｐ Ｏ氨 甲 红细胞生成素 （ ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｍ ｙ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｒ ｙ ｔ ｈ ｒ ｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｎ ， Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ） 是Ｅ Ｐ Ｏ的一种衍 酰化 的流 出液未 出现降解 产物 ，证 明氨 甲酰化 Ｅ Ｐ Ｏ反应完全 ， Ｅ Ｐ Ｏ 生物 ， 其可 以表现 Ｅ Ｐ Ｏ类似 的组织保护作用 ， 又不具备促进红 细胞 转 化 为 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ 。 生成 的作用日 ， 是近年来临床药品研究 的新 宠。为进一步研究 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ ３ 讨 论 的药用功能 ， 本研究对 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ的制备工艺进行研究。 除重组人 促红细胞生成素 （ ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ） 外， 临床上用 的 Ｅ Ｐ Ｏ多是氨 １ 材 料 与方 法 甲酰衍生物 ， 其具 有 Ｅ Ｐ Ｏ相似 的药 代动力学特 点 ， 此外 ， 还具 有心 １ ． １ 试 验 材 料 肌保护 等作用 ， 对其深入研究 ， 明确其 细胞保护 的作 用机制对临床 试验用 Ｅ Ｐ Ｏ购 自上海克 隆生物高技术公 司。硼酸钠 、 氰酸钾 、 药 物的广泛应用 具有 重要 作用 ， 而高纯度 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ的有 效制备方法研 考 马斯 亮 蓝 、蛋 白酶 等化 学 试剂 购 自大 连 宝生 物公 司 （ Ｔ ａ Ｋ ａ Ｋ ａ ， 究是其机能研究 的前提 。 Ｊ ａ ｐ ａ ｎ ） Ｓ Ｄ Ｓ 一聚丙 烯胺凝胶 电泳胶 （ ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｄ ｏ ｄ ｅ ｃ ｌ ｙ ｓ ｕ ｌ ｆ ａ ｔ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ ａ ｃ ｒ ｙ ～ 本研 究 结 合 刁 增 艳 和 丁 晶 的方 法 制 备 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ， 并 利 用 ｌ ａ ｍ ｉ ｉ ｄ ｅ ｇ ｅ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ， Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ）制备试剂盒 购 自北京 赛驰 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ不连续凝胶 电泳法对酶切前后 的 Ｅ Ｐ Ｏ和 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ进 行 了 生物科技有 限公 司其它试剂为分析纯。 纯度鉴定 。Ｅ Ｐ Ｏ肽链 上的赖氨 酸残基 ， 在Ｌ ｙ ｓ — Ｃ内切酶的作用下可 １ ． ２ 试 验方 法 以酶解 为相对分 子质量小 的肽段 ， 而 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ的肽链上的赖氨酸被氨 １ ． ２ ． １ Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ 的制 备 方 法 建 立 甲酰 ， 不 受蛋 白内切酶 的作 用［ ３ １ 。因此 ， 在 蛋 白内切酶 的作 用下 ， 若 Ｐ Ｏ被 甲酰化完全 ， 酶切产物中 ， 只可 以有相对分子质量约 约 ３ ． ４× 参 照刁增艳等１ ３ ， ４ １ 的方法制 备氨 甲酰基促 红细胞 生成素 。先 将 Ｅ Ｅ Ｐ Ｏ粉 末 ０ ． ５ ３ ｍ ｇ （ 浓度 １ ｍ ｇ ・ ｍ Ｌ ） 与０ ． ５ ｍＬ硼 酸 钠 （ １ ｔ ｏ ｏ ｌ ・ Ｌ － ， １ ０ 单一 的条带 。本研究 的电泳 结果 表明 ， 试验 中的 Ｅ Ｐ Ｏ甲酰化彻 Ｐ Ｈ ８ ． ８ ） 和８ １ ． １ １ ｍ ｇ氰酸钾混 合均匀 ， 加水定 容至 １ ｍＬ ， ３ ７ ℃温 底 ， 获得的 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ纯度高 ， 可为其生理功能的进一步研究 提供材料 。 参 考 文 献 育２ ３ ｈ 后于 ５ ０ ０ ｍ Ｌ超纯水 中透析 ６ ｈ ，再更换超纯水 ， ４ ℃透析 过夜 ， 再于 １ ０ ０ ０ ｍＬ柠 檬酸 钠 （ ０ ． ０ ２ ｏ ｔ ｏ ｌ ・ Ｌ － ） 和Ｎ ａ Ｃ １ （ ０ ． １ ｍ ｏ ｌ ・ Ｌ ， 【 １ １ 马宝新， 李花， 昊绥生． 促 红细胞 生成素衍 生物抗糖尿病 大 鼠心肌 Ｐ Ｈ ６ ） 中 ４ ℃透析过夜 。 获得 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ后 ， 采用考马斯亮蓝 Ｇ ２ ５ ０方法 细 胞 凋 亡 的 作 用及 其 机 制 中华 临床 医师 杂 志 ： 电子版， ２ ０ １ ５ （ １ ） ： ７ ６ — ８． 测 定其蛋 白浓度 ， 在５ ９ ５ ｎ ｍ处测 定标准蛋 白吸光值 ， 制定标 准 曲 ７ 线。 【 ２ ］贺宏英．氨 甲酰促红细胞 生成素对糖尿病 大鼠心脏的保护作 用 Ｄ １ ． 长春 ： 吉 林 大 学， ２ ０ １ ３ ． 取 上述方法 制得 的 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ样 品 ４ ０ ｇ 溶于 ４ ０ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ 溶液 『 （ ０ ． ２ ５ ｍｏ ｌ ・ Ｌ － ， ｐ Ｈ ９ ． ５ ， 含有 ６ ｍ ｏ ｌ ・ Ｌ 盐酸胍 ） 中， 再取 Ｅ Ｐ Ｏ标准 『 ３ １ － － ７ 增艳． 氨 甲 酰基 促 红 素 的 制备 及 其 对过 氧化 氢损 伤 的 Ｓ Ｈ— Ｓ Ｙ ５ Ｙ 品４ Ｏ ｇ 溶 于 相 同浓度 的 Ｔ ｒ ｉ ｓ 溶 液 中 ，再 分别 加入 ５ Ｌ （ ０ ． １ 细胞保护作用的观 察［ Ｊ ］ ． 山东大学学报 ： 医学版， ２ ０ １ ｌ ， ４ ９ （ ９ ） ： ６ — １ ２ ． ｍ ｏ ｌ ・ Ｌ － ） 二硫 赤藓糖醇 混合 均匀 。３ ７ ℃避 光温育 ３ ０ ｍｉ ｎ后 ， 加入 【 ４ 】 丁 晶， 任 惠 民， 肖保 国等 ． 氨 甲酰 化促 红 细胞 生成素 的制备及鉴 定 ０ ． ６ ｍｏ ｌ ・ Ｌ 的碘化 乙酰胺 ５ Ｌ ， 再室温温育 ６ ０ ａ ｒ ｉ ｎ 。反应液加至 ｆ Ｊ １ ． 中国临床神 经科 学， ２ ０ ０ ８ ， １ ６ （ ３ ） ． 经０ ． ０ ５ ｍｍ ｏ ｌ ・ Ｌ 碳酸氢胺和 ０ ． ４ ｍ ｏ ｌ ・ Ｌ － 尿素溶液平衡 的 Ｈ ｉ Ｔ ｒ ａ ｐ ［ ５ ］ 马 宝新， 刘现 亮． 促 红细胞生成 素衍 生物研 究进展『 Ｊ ］ ． 心 血管病 学 Ｇ ２ ５柱 ， 流速为 ０ ． ８ ｏｏ ｔ ｌ ・ ｍ ｉ ｎ ， 进样后 ， 收集首柱 １ １ ３ — １ ／ ２体积 的洗脱 进 展 ． ２ ０ １ １ ， ３ ２ （ ２ ） ： ２ ８ ８ — ２ ９ １ ． 液。 【 ６ 】 郭 良伟． 重组人促 红细胞生成素的制备与临床应用『 Ｊ １ ． 黑龙 江科技 制定不同浓度 的标准蛋 白液 ，再采用考马斯亮 蓝 Ｇ ２ ５ ０方法测 信 息， ２ ０ １ ４ （ ３ ） ： １ ４ — １ ４ ． 定其在 ５ ９ ５ ｎ ｍ处的吸光值 ， 制定标准 曲线 ， 再测定 收集洗 脱液 中 【 ７ ］ 林 长裕， 何伟珊， 李伟健 ． 重组人 促红 细胞 生成素 治疗肿瘤相 关性 的蛋 白浓度 ， 根据标准曲线计算其 蛋白浓度 。 贫血 的临床研 究『 Ｊ ］ ＿ 中国医学创新， ２ ０ １ ５ ， １ ２ （ １ ４ ） ： ２ ５ — ２ ７ ． 分 别取 Ｅ Ｐ Ｏ和上柱后 的流 出液各 １ ０ ｇ ，再分别加 入 Ｌ ｙ ｓ — ｃ ［ ８ 】 赵天， 杨橙 ， 胡林 昆等． 促 红细胞 生成素衍 生肽的制备 和鉴定及 对 蛋 白内切酶 ０ ． ４ ｇ ， ３ ７ ｃ Ｃ 孵育 ２ ０ ｈ 。 大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用ｆ Ｊ ］ ． 中国临床 医学， ２ ０ １ １ ， １ ８ ０） ： ２ ５ — ２８． １ ． ２ ． ２ Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ 的鉴 定 采用 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ ＡＧ Ｅ方法对获得的 Ｃ Ｅ Ｐ Ｏ进行鉴定 ， 加样为 ： （ １ ） 蛋 白 Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ ５ Ｌ； （ ２ ） 未经 蛋 白 酶切 的 Ｅ Ｐ Ｏ 原液 ５ Ｌ ； （ ３ ） Ｅ Ｐ Ｏ酶 切产 物 １ ５ Ｌ ； （ ４ ） Ｅ Ｐ Ｏ氨 甲酰 化蛋 白产 物原 液 ５ Ｌ ； （ ５ ） Ｅ Ｐ Ｏ 氨 甲酰化蛋 白酶切产 物 １ ５ Ｌ 。上述蛋 白与等体积 的上样缓 冲液 混匀 ，１ ０ ０℃ 水浴 ５ ａ ｒ ｉ ｎ 后上 样 ， １ ０ ％ Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ不 连 续 凝 胶 电泳分 离 （ �

应用：重组人 促红细胞生成 素在临床上用 于治疗贫血等
疾病
基因工程：通过基因工程技术将人促红细胞生成素基因导入到表达系统中 细胞培养：将表达系统培养在特定的细胞中，如大肠杆菌、酵母菌等 诱导表达：通过添加诱导剂等方式诱导表达系统表达人促红细胞生成素 纯化：通过离心、层析等方法将表达系统表达的人促红细胞生成素纯化出来
技术将人促红 主细胞，如大
细胞生成素基 因导入到宿主
细胞中
肠杆菌、酵母 菌等
基因表达：通 过宿主细胞表 达人促红细胞 生成素基因， 产生重组人促 红细胞生成素
纯化：通过离 心、层析等方 法纯化重组人 促红细胞生成
素
质量、纯度等 指标，确保产
品质量
血等
肿瘤治疗：用 于肿瘤患者的 辅助治疗，提 高患者的血红 蛋白水平，改
善贫血症状
肾病治疗：用 于治疗肾病患 者的贫血，提 高血红蛋白水 平，改善贫血
症状
手术后治疗： 用于手术后患 者的辅助治疗， 提高血红蛋白 水平，改善贫
血症状
PART THREE
基因工程技术： 宿主细胞选择：
利用基因工程 选择合适的宿
细胞培养技术： 优化细胞培养 技术，提高重 组人促红细胞 生成素的产量
和质量
生物信息学技 术：利用生物 信息学技术分 析重组人促红 细胞生成素的 结构、功能和
作用机制
临床研究：开 展大规模临床 研究，验证重 组人促红细胞 生成素的疗效
和安全性
产业化发展： 推动重组人促 红细胞生成素 的产业化发展， 降低生产成本， 提高市场占有
未来展望：未来，重组人促红细胞生成素 的研究将继续深入，有望在血液疾病治疗 领域取得更大的突破。
研究进展：目前重组人促红细胞生成素在 临床上已经取得了显著的疗效，未来有望 进一步扩大应用范围。

Biblioteka 重组人促红细胞生成素的纯化
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非

AmpR NeoR
hEPO dhfr
• CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是 neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影 响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增 的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因 （dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（gs）。
• 研究工作中发现，GS 系统表达水平高，但细胞长 期连续培养时，生长状况不佳，而DHFR 系统表达 水平较GS 系统低，但细胞生长状况良好。
rhEPO的大规模生产方式
• （1）板瓶 • （2）转瓶，Amgen • （3）反应器
9.3 工程CHO细胞系培养工艺
• 种子细胞制备 • 反应器培养工艺 • 培养过程控制
1、种子细胞制备
• （1）液氮中冻存的细胞系37℃水浴，无菌理性。 • （2）弃上清，加适量DMEM（含10%小牛血清）。 • （3）37℃，CO2培养箱培养，连续传3代。 • （4）用胰酶消化后，制成细胞浓度约为2.5×106个/ml。用于接种。
与天然红细胞生成素相似。
• 现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模 生产。
9.2 工程CHO细胞系的构建
• 表达载体构建 • 转染 • 稳定性筛选
1、表达载体的构建
• 人红细胞生成素基因的克隆策略：
从基因组中克隆编码区片段，拼接成全长；或 从基因组中克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA， RT-PCR克隆全长序列。
2、连续培养工艺过程
• （1）反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS，高压灭菌。 • （2）接种：排出PBS，加DMEM培养基（含10%小牛血清），接入
种子细胞。 • （3）贴壁培养：pH7.0 ，<50rpm，37℃，DO控制在50~80%。 • （4）扩增培养：80~100rpm，pH7.0，37℃

由于亲和分离的选择性强，因此在产物纯化中 具有较大的潜力；疏水作用层析和反相作用层析是 利用蛋白质疏水性的差异来分离纯化蛋白质。 二者的不同在于疏水作用层析通常在水溶液中 进行，蛋白在分离过程中仍保持其天然构象，而反 相作用层析是在有机相中进行，蛋白经过反相流动 相与固定相的作用有时会发生部分变性；凝胶排阻 层析根据蛋白质的相对分子质量以及蛋白质分子的 动力学体积的大小来进行分离的，它可应用于蛋白 质脱盐和蛋白质分子的分级分离。
4．分离纯化工艺的要求
在重组药物分离纯化过程中，通常需要综合 使用多种分离纯化技术。另外，作为药品，其生 产必须保证安全、无菌、无热源、无污染。 1、分离纯化工艺要求有良好的稳定性和重复性， 减小原料及设备对产品的影响。 2、工艺的步骤尽可能少，时间要尽可能短，以 减少生物活性物质的破坏失活。 2、组成工艺的各技术、步骤之间及设备间要能 相互适应和协调，且高效，收率高，易操作，对 设备条件要求低，能耗低，并尽可能少用试剂， 以免增加分离纯化步骤或干扰产品质量。
如果表达产物前没有信号肽序列，它可以可溶 形式或不可溶形式（包涵体）存在于细胞中。对于 胞内产物，首先要通过离心或过滤的方式收集细胞， 并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠杆 菌作为宿主菌来生产目的蛋白，在大肠杆菌中当外 源蛋白的表达量达到20%以上时，它们一般就会以 包涵体（inclusion body）的形式存在。
26.1重组药物概述
应用DNA重组技术可大量生 产过去难以获得的生理活性蛋白 和多肽，提供足够数量的生理活 性物质，以便对其生理生化及结 构等进行深入的研究和开发应用， 还可以对已有的药物进行改造， 克服其不足，创造自然界不存在 的全新物质。目前，采用DNA重 组技术生产的药物主要有干扰素、 生长素、胰岛素、重组疫苗等。

生物制药工艺学——多重肽组与人蛋红白细质胞类生药成物素生产工艺
1、种类
红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对红细胞生成的特异性刺激作用的细胞因 子。红细胞生成素是一种糖蛋白，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内 主要由肾脏产生。红细胞生成素与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞的特 定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓 向循环血中释放红细胞。
天然红细胞生成素是以人或动物的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到。 目前已知人红细胞生成素有两种存在形式，即人EPO-α及人EPO-β，二者差别在 于二者的糖型组成不同，EPO-α含有较多的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸 ，总的含糖量也较EPO-β高。
重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素 的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞 生成素。重组人红细胞生成素与天然具有相同的体内、体外活性。
2020/5/25
1
生物制药工重艺组学—人—红多细肽胞与生蛋成白质素类生药产物工艺
2、临床应用
重组红细胞生成素(EPO)是目前临床上治疗慢性肾衰性贫血疗效最显著的 生物技术药物，如肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。
3、理化性质
成熟的红细胞生成素是由165个氨基酸残基组成的糖蛋白，糖基化位点为Asn24、 Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33) ，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳）。红细胞 生成素前体带有27个氨基酸的信号肽。红细胞生成素基因存在于7q11-q22区的一 个5.4 kb HindⅢ-BamHⅠ性内切酶切片段中。 糖基化红细胞生成素对热和pH变化稳定，等电点为4.2～4.6，未经糖基化肽链等 电点pH为9.2。

1970s----单峰胰岛素和 单组分胰岛素
70年代末----半合成胰岛素
1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。
90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效 和长效人胰岛素类似物。
动物来源的胰岛素（28种）
药品名称
生产企业
药品名称
生产企业
ILETIN I ILETIN II
NOVO NORDISK INC
HUMULIN 70/30 PEN HUMULIN BR HUMULIN L
LILLY LILLY LILLY
NOVOLOG NOVOLOG MIX 70/30
VELOSULIN BR
NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC
LENTARD LENTE
NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC
PROTAMINE ZINC AND ILETIN II
LILLY
PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK)
HUMULIN N HUMULIN R HUMULIN R PEN
LILLY LILLY LILLY
VELOSULIN BR HUMAN HUMULIN U
NOVO NORDISK INC LILLY
胰岛素国内主要生产厂家
1. 通化东宝
1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖” 甘舒霖® R-- 常规重组人胰岛素注射液 甘舒霖® N-- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖® 30R-- 30/70混合重组人胰岛素注射液