生物制品生产用动物细胞制备及检定规程Requirements for Preparation and Control of Animal Cell Substrates Used for Production of Biologics
本规程适用于生产和/或检定疫苗等生物制品的细胞培养，其中包括二倍体细胞、传代细胞和原始细胞培养。本规程对这些细胞的性质、质量及安全性检定提出了明确要求。
A 对各类细胞培养总的要求
1 细胞库的建立
来自人或动物的细胞，已经通过全面检定，并得到国家药品管理当局批准，方可用于生物制品生产及检定。
1.1原始细胞库
由一个原始细胞群体，发展成细胞系（株）或经过克隆培养而形成拘泥的细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产及检定。为了保证能持续使用而建立原始细胞库。目的是使得制品每一生产周期，都能提供一个已标定好的相同质量的细胞源。因此，在特定条件下由有一定数量、成分一致的细胞，按一定量均匀分装于安瓿，于液氮或-100℃以下冻存备用，即为原始细胞库。
1.2主细胞库（MCB）
取原始细胞种子，通过相应方式进行细胞传代，增殖一定数量细胞，将所有细胞均匀混合成一批，定量分装安瓿，保存于液氮或-100℃以下备用。这些细胞必须以其自身的特定质控要求进行全面检定，全部合格后即为主细胞库，为建立工作细胞库用。
1.3工作细胞库（WCB）
工作细胞库的细胞由主细胞库细胞传代扩增而来。主细胞库之细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，全部合并成一批均质细胞群体，再按要求的细胞数量分装安瓿，保存于液氮或-100℃以下备用。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批产品。此时传代的水平必须在该细胞用于生产限制最高代次之内。工作细胞库细胞，必须按该细胞的检定要求，逐项进行全面检定，合格后方可用于生产。
1.4生产用细胞培养
取出冻存的工作细胞库中一个或多个安瓿，混合后培养，传递一定代次后供生产制品使用。其代次不得超过对该细胞用于生产的最高限制代次。从工作细胞库取出的细胞种子增殖出来的细胞，不再回冻保存和再用于生产。
1.5体外培养细胞龄的计算
二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代；1瓶传4瓶（1：4）为二
世代；1瓶传8瓶（1：8）则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。
传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。依据每个细胞系的时间经验数据，确保细胞质量及安全，确定生产使用细胞最后限制代次。
有的原始细胞可以传少数几代（一般不应超过5代），尚可用于生产，但要以该细胞生长特性及对病毒繁殖敏感性不发生改变为基础。
2 生产管理
2.1 细胞生产质量管理
细胞培养操作必须按照GMP要求，防止污染。在生产区内不能进行非生产用细胞微生物的操作，生产人员要定期检查身体。在同一工作日于操作细胞之前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。用于制品生产的培养物中不准加青霉素或β-内酰胺（β-Lactam）抗生素。虽允许少量使用其他抗生素，但最好不使用任何抗生素。
2.2原材料的选择
各种类型细胞的供体材料均不应有任何外源因子污染。二倍体细胞的供体包括胎儿的父母应为无传染性疾病和严重的遗传病，也无不确定病因的疾病。
培养细胞用牛血清，来源地区应没有牛脑海绵体脑病的健康牛群，应检查无外源因子污染方可使用，应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中牛血清的有关规定。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明吴细菌、真菌、支原体和感染性病毒，特别是胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如牛、猪的细小病毒等。
3 细胞培养的检查
包括细胞种子、细胞库细胞的各项检查。
3.1 细胞培养用原材料检查
3.1.1 牛血清的检查
牛血清应从健康牛群中的小牛或胎牛中采集。生产单位对牛血清应进行细菌、真菌、支原体检查，按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》进行；病毒检查应特别重视牛腹泻病毒的检查；噬菌体检查应注意大肠杆菌噬菌体的检查。检查结束应能证明无任何外源或内源因子污染。
3.1.2胰蛋白酶检查
消化分散细胞用胰蛋白酶应按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》检查细菌、真菌、支原体。生产厂家应对胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒（如牛和猪的细小病毒）进行检查。
3.2 细胞培养物的检查
3.2.1 细胞、真菌检查
细胞培养上清液样品，按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。
3.2.2支原体检查
按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》B项进行。
3.2.3病毒检查
应注意检查细胞株中有无细胞来源物种可能潜在感染的病毒，以及由于操作带来的外源性病毒。特别注意逆转录病毒的检查。
3.2.3.1细胞培养直接观察及红细胞吸附试验
去混合瓶细胞样品，接种小瓶，待细胞长成单层换维持液，观察两种，镜检细胞，应保持正常形态特征。培养至少14天，分别取1/3细胞培养瓶，用0.2%~0.5%豚鼠红细胞混合悬液做红细胞吸附试验，加入红细胞后先置于4~8℃，后置于20~25℃各30分钟，两次观察结果均应为阴性。新用红细胞在2~8℃保存不得超过7天，溶液中不应含有钙或镁离子。
3.2.3.2不同细胞传代培养检查
细胞培养上清液混合样品，至少接种3种细胞（猴源细胞、人源细胞和同种不同批细胞），接种样品量应占维持液的1/4以上，培养至少14天时，进行血吸试验（同A 3.2.3.1项）。培养7天的上清液接种于同种细胞培养，盲传一代，全部观察共14天，应物细胞病变，血吸试验应为阴性。
3.2.3.3动物和鸡胚检查
用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚（两组不同日龄）共计6组。每组动物或鸡胚接种待检细胞样品不应少于107细胞/ml。按表1所列方法进行试验和观察。如试验到期有80%以上动物或鸡胚健存，此试验成立，再经其他检测以确定结果。
表 1
动物组要求数量接种途径接种细胞液量
ml/只
观察天数结果
乳鼠24小时内≥10（2窝）脑内0.01 21 应健在
腹腔0.1
成鼠12~14g 10 脑内0.03 21 应健在
腹腔0.5
豚鼠①350~500g 5 腹腔 5.0 42 应健在，解剖无结核病变家兔 1.5~2.5kg 5 皮下9.0 21 无异常
皮内②0.1×10
鸡胚9~11日龄10 尿囊液0.2 3~4 尿液血凝试验阴性③鸡胚5~6日龄10 卵黄囊0.5 5 应存活
①豚鼠注射前和观察4周做结核菌素试验应为阴性。
②每只家兔于皮内注射10处，每处0.1ml。
③应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液做直接血凝检查。
3.2.3.4 逆转录病毒检查
（1）透射电镜检查。
