石榴皮单宁的提取及抑菌效果研究

第41卷2016年第5期石榴皮单宁的提取及抑菌效果研究舒杨雄，陈亚，谭念，龚丽，冯晓栋（武昌工学院食品工程学院，湖北武汉430065）

收稿日期：2016-08-30基金项目：武昌工学院学生科研项目（2015XSC14）。作者简介：舒杨雄，男，本科，研究方向为食品质量与安全。通信作者：谭念，女，硕士，实验师，研究方向为食品加工。第41卷第5期2016年10月Vol.41，No.5Oct.2016GrainScienceandTechnologyandEconomyDOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20160517［摘要］对石榴皮中单宁的提取工艺进行研究，通过正交试验优化提取条件，并对石榴皮单宁的抑菌活性进行了研究。结果显示，石榴皮最佳提取工艺条件为：提取剂60%丙酮，提取温度50益，提取时间2h，料液比1颐25，在此条件下石榴皮单宁提取率为27.41%。抑菌试验结果表明，石榴皮单宁对细菌有较强的抑制作用，霉菌和酵母菌无明显抑制作用；金黄色葡萄球菌的MIC为0.625mg/mL，大肠杆菌的MIC为5mg/mL。［关键词］石榴皮；单宁；提取；抑菌石榴属于落叶灌木或小乔木，原产于中亚地区，我国南北都有栽培，其中以安徽、江苏、河南等地种植面积较大咱1暂。石榴主要作鲜果食用，约占石榴重量20豫耀30%的石榴皮大部分被废弃，导致石榴皮资源浪费，不能得到充分的发挥和利用。研究发现，石榴皮中富含的单宁、黄酮类等化学物质具有抑菌效果。单宁也称鞣质，是多元本酚类的衍生物，具有止血、抑菌、抗癌等多种生理活性。本研究通过正交试验方法确定石榴皮单宁最佳提取条件，并研究单宁的抑菌效果，对比常用食品防腐剂的作用效果，分析石榴皮单宁作为天然食品防腐剂的可行性咱2暂。1材料与方法1.1材料1.1.1石榴皮粉新疆石榴购于超市，手工取皮，于50益恒温烘干后粉碎过60目筛，粉末置于棕色试剂瓶保存备用。1.1.2试验用菌株细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，霉菌为青霉菌，酵母菌为面包酵母，均由武昌工学院食品工程学院实验室提供。1.1.3试剂和培养基主要试剂为甲醇、乙醇、丙酮、醋酸锌、EDTA二钠盐、氨水、氯化氨、铬黑T、硫酸，均为分析纯：上海国药集团化学试剂有限公司；培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司。1.1.4主要仪器AR2140型电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司；GZX-9070MBE型数显鼓风烘箱：上海博讯实业有限公司；HH-2型恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；LD5-2B型离心机：金坛医疗仪器厂；JJ-GJ-2FD型超净工作台：苏州净化设备有限公司；DNP-9082型恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；MJS-54型全自动高压灭菌锅：施都凯仪器设备上海有限公司。1.2方法1.2.1石榴皮单宁提取采用水浴回流法提取石榴皮中的单宁咱3暂。将已处理的石榴皮粉末称取0.5g，置于100m蕴圆底烧瓶中，按比例加入一定体积的提取剂，在一定温度下水浴一定时间后，离心，取上清液，待测。1.2.2石榴皮单宁测定方法将提取所得的上清液加入50%丙酮至20m蕴，于水浴锅中加热至35益恒温。另取1m蕴浓度为1mol/L的乙酸锌溶液和0.7m蕴饱和氨水于锥形瓶中，摇匀使白色溶液全部溶解后与上述提取液混合，置于原水浴锅继续加热30min后，冷却至室温过滤。取1mL续滤液于锥形瓶中，加入1.25mLpH为10的NH4Cl-NH3·H2O缓冲液，0.05mL铬黑T指示剂，15mL蒸馏水，以0.05mol/L的EDTA二钠标准溶液滴定，待溶液由紫红色变为蓝色即为终点。单宁提取率=0.1556伊VM伊100%63.com.cn. All Rights Reserved.第41卷2016年第5期

（下转第69页）式中：0.1556为实验所得的比例常数；V为1mol/L醋酸锌标准溶液的络合沉淀消耗量，mL；M为样品质量，g。1.2.3提取剂的选择选取水、50%甲醇、50%乙醇、50%丙酮4种溶剂作为提取剂，比较提取效果。1.2.4正交试验根据相关资料和初步实验的结果，确定对提取率有较大影响的4个因素分别为提取剂、提取温度、提取时间和料液比。采用L9（34）做正交试验，确定最佳提取工艺条件。因素及水平见表1。表1石榴皮单宁提取的正交试验因素水平B提取温度/益706050C提取时间/h1.522.5A提取剂40%丙酮50%丙酮60%丙酮水平123D料液比g颐mL1颐201颐251颐301.2.5抑菌效果试验（员）菌悬液的制备。将菌种通过划线法接种于相应平板培养基上，细菌在37益恒温培养24h，霉菌和酵母菌在28益恒温培养48h，连续培养两代，取活化后的单菌落于无菌生理盐水中配置浓度为106CFU/mL的菌体悬浮液，备用。（2）最小抑菌浓度（MIC）试验。按照正交试验所得的最佳提取工艺，将提取液于50益旋转蒸发，得到的浓缩液置于真空干燥箱中，得到单宁固体。采用琼脂二倍稀释法咱4袁6暂，将单宁配制成浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312mg/mL的溶液，每个浓度的单宁溶液各取1mL于不同平板中，加入15mL已灭菌并冷却到50益的固体培养基，混匀冷却，待培养基凝固后取1mL各菌悬液注入平板内，涂布均匀，制成含菌平板。每个浓度每个菌种做3个重复，以无菌水作对照组，待干燥后按菌悬液的制备方法倒置于培养箱中培养，肉眼观察无菌落形成的最小单宁浓度为最小抑菌浓度。（3）防腐剂对照。将苯甲酸钠配制成单宁溶液的相同浓度，按照最小抑菌浓度试验方法，测定苯甲酸钠对各菌种的最小抑菌浓度。2结果与分析2.1不同提取剂对石榴皮单宁提取率的影响由表2可知，提取剂为50%丙酮时，石榴皮单宁的提取率最高，且丙酮易于回收，比较适宜作为石榴皮单宁的提取剂。表2不同提取剂对石榴皮单宁提取率的影响水17.1150%甲醇19.2450%乙醇18.7150%丙酮22.68提取剂单宁提取率/%2.2正交试验结果由表3极差R分析可知，各因素对石榴皮单宁提取率影响的主次关系为提取剂浓度（A）>提取时间（C）>提取温度（B）>料液比（D）。最佳提取条件为A3B3C2D2，即提取剂为60%丙酮，提取温度50益，提取时间2h，料液比1颐25。表3石榴皮单宁提取的正交试验结果A11122233323.6424.5425.441.80B12312312323.9724.1325.521.39C12323131223.7325.2324.651.51D12331223124.4024.7324.490.33提取率/%22.1224.1224.6824.6124.1024.9025.1724.1726.97试验号123456789K1K2K3R2.3石榴皮单宁抑菌效果分析本实验采用琼脂稀释法，以有无细菌生长判断指标来表示抑菌效果。由表4可知，石榴皮单宁对细菌有较强的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性，G+）的抑菌效果高于大肠杆菌（革兰氏阴性，G-），对霉菌和酵母菌无明显抑制作用。对金黄色葡萄球菌的MIC为0.625mg/mL，大肠杆菌的MIC为5mg/mL。表4单宁对各菌的最低抑菌浓度供试菌株金黄色葡萄球菌大肠杆菌青霉菌面包酵母10--++5--++2.5-+++1.25-+++0.625-+++0.312++++单宁浓度/mg·mL-1注：“-”表示无菌落生长，“+”表示菌落生长。2.4苯甲酸钠最小抑菌浓度的测定苯甲酸钠是食品中最常用的化学防腐剂，采用与石榴皮单宁相同浓度，测定对各种菌种的MIC，用于判定石榴皮单宁替代化学防腐剂的可行性。由表5可知，苯甲酸钠对各菌种均有不同程度抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的MIC为10mg/mL，大肠杆菌的MIC为5mg/mL，青霉菌的MIC为2.5mg/mL，面包酵母菌的MIC为1.25mg/mL。可舒杨雄等：石榴皮单宁的提取及抑菌效果研究

64.com.cn. All Rights Reserved.第41卷2016年第5期（上接第64页）见苯甲酸钠对酵母菌的抑制作用最明显，对细菌的抑制作用最弱，其次为霉菌。表5苯甲酸钠对各菌的最低抑菌浓度供试菌株金黄色葡萄球菌大肠杆菌青霉菌面包酵母苯甲酸钠浓度/mg·mL-110----5+---2.5++--1.25+++-0.625++++0.312++++3结论石榴皮单宁最佳提取条件：提取剂为60%丙酮，提取温度为50益，提取时间为2h，料液比1颐25，提取率达到27.41%。石榴皮单宁对细菌有较强的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性，G+）的抑菌效果高于大肠杆菌（革兰氏阴性，G-），对霉菌和酵母菌无明显抑制作用，金黄色葡萄球菌的MIC为0.625mg/mL，大肠杆菌的MIC为5mg/mL。与常用食品防腐剂苯甲酸钠相比，石榴皮单宁对细菌的抑菌效果较好。石榴皮中单宁的含量较高，有效利用石榴皮资源，研发天然防腐剂，对资源合理应用和食品防腐具有重要的研究意义。参考文献［1］何锦，李勇.石榴化学成分及其保健功能的研究进展［J］.粮油食品科技，2012，20（2）：42-45.［2］徐云凤，李光辉，梁秀君，等.石榴皮单宁的提取、纯化及抑菌作用的研究［J］.食品工业科技，2014，猿缘（2）：83-86.［3］任平，岳淑宁，李忠玲，等.石榴皮单宁类化合物的提取研究［J］.食品工业科技，2007，18（1）：149-153.［4］熊素黄，岳田利.石榴皮提取物抑菌作用研究［J］.食品工业，2007，28（5）：18-20.［5］张雅丽，李建科，刘柳，等.五倍子单宁对常见食品腐败菌和到病菌抑制作用研究［J］.食品工业科技，2013，34（18）：141-143.［6］王虹玲，武婷茹，姜诗文，等.香蕉皮单宁的提取及其提取物的抑菌抗氧化活性［J］.食品与发酵工业，2014，40（11）：253-259.李玉珍等：花生蛋白质改性机理及应用研究进展proteinisolateglucomannanconjugatespreparedbyultrasonictreat原ment［J］.UltrasonicsSonochemistry，2014，21（5）：1722-1727.［20］SunQJ，XiongL，BuXH，etal.Studyonmechanismofcross-Link原ingofpeanutproteinisolatemodifiedwithtransglutaminase［J］.Ad原vancedMaterialsResearch，2012：550-553，1304-1308.［21］ClareD，GharstG，SandersT.Transglutaminasepolymerizationofpeanutproteins［J］.JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2007，55（2）：432-438.［22］FengXL，LiuHZ，ShiAM，etal.Effectsoftransglutaminasecat原alyzedcrosslinkingonphysicochemicalcharacteristicsofarachinandconarachin-richpeanutproteinfractions［J］.FoodResearchIn原ternational，2014（62）：84-90.［23］ZhaoG，LiuY，RenJ，etal.Effectofproteasepretreatmentonthefunctionalpropertiesofproteinconcentratefromdefattedpeanutflour［J］.JournalofFoodProcessEngineering，2013，36（1）：9-17.［24］魏红艳.花生蛋白的微波改性及其在蒸煮面制品中的应用研究［D］.郑州：河南工业大学，2010.［25］李向阳，董海洲，刁恩杰，等.改性花生蛋白粉对面团特性及挂面品质的影响［J］.中国粮油学报，2012，27（11）：6-9.［26］LiY，GuoXD.Developmentofdefattedpeanutnutritivenoodlesandtheirrelatedproperties［J］.FoodScience，2010，31（16）：305-311.［27］石晓，豆康宁，赵永敢.花生蛋白在低温肉制品中的应用研究［J］.粮油加工，2010（12）：179-181.［28］朱清，张光先，张凤秀，等.花生蛋白在碱减量腈纶表面上的接枝及接枝腈纶服用性能研究［J］.西南大学学报：自然科学版，2010（3）：140-145.［29］张雪春，王振兴，涂宗财，等.酶-微射流复合改性花生蛋白及其在微胶囊粉末油脂中的应用研究［J］.中国油脂，2014，39（11）：32-35.［30］李萌萌，卞科，陶平平，等.微波改性花生蛋白标签胶的研究［J］.中国油脂，2012，37（1）：60-64.［31］金刚，张国治，袁东振，等.花生蛋白凝胶食品制作工艺研究［J］.粮食与油脂，2014，27（6）：40-42.［32］冯紫慧，赵超，王凤艳，等.新品花生蛋白露的加工技术［J］.山东食品发酵，2010（2）：23-25.［33］张春红，高爽，王六强，等.谷氨酰胺转移酶改性对花生蛋白膜性能的影响［J］.食品与发酵工业，2013，39（12）：35-38.［34］FoegedingEA，DavisJP.Foodproteinfunctionality：acomprehen原siveapproach［J］.FoodHydrocolloids，2011，25（8）：1853-1864.［35］KoplinJJ，AllenKJ.Earlyintroductionoffoodsforfoodallergypre原vention［J］.CurrentTreatmentOptionsinAllergy，2014（2）：107-116.［36］赵凯艳，魏安池，郑彦芳，等.花生蛋白酸奶工艺条件的研究［J］.粮食与饲料工业，2014（6）：27-30.［37］DhallR.Advancesinediblecoatingsforfreshfruitsandvegetables：areview［J］.CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition，2013，53（5）：435-450.［38］苏国万.花生粕酶解及其产物呈味特性研究［D］.广州：华南理工大学，2012.［39］CuqB，GontardN，GuilbertS.Proteinsasagriculturalpolymersforpackagingproduction［J］.CerealChemistry，1998，75（1）：1-9.［40］S佗izJ，MontealegreC，MarinaML，etal.Peanutallergens：anoverview［J］.CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition，2013，53（7）：722-737.［41］ChalkerJM，GaJBernardes，DavisBG.A"tag-and-modify"ap原proachtosite-selectiveproteinmodification［J］.AccountsofChemi原calResearch，2011，44（9）：730-741.［42］AvramenkoNA，LowNH，NickersonMT.Theeffectsoflimiteden原zymatichydrolysisonthephysicochemicalandemulsifyingproper原tiesofalentilproteinisolate［J］.FoodResearchInternational，2013，51（1）：162-169.［43］SpicerCD，DavisBG.Selectivechemicalproteinmodification［J］.NatureCommunications，2014（5）：doi：10.1038/ncomms5740.［44］MillsCP，JohnsonE，Zuidmeer-JongejanL，etal.Effectofprocess原ingontheallergenicityoffoods［M］.RiskManagementforFoodAl原lergy，2014.［45］DodoHW，KonanKN，ChenFC，etal.Alleviatingpeanutallergyus原inggeneticengineering：thesilencingoftheimmunodominantallergenArah2leadstoitssignificantreductionandadecreaseinpeanutal原lergenicity［J］.PlantBiotechnologyJournal，2008，6（2）：135-145.69.com.cn. All Rights Reserved.