农杆菌介导Ds转座因子的黄瓜遗传转化

农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系的建立作者：魏爱民杜胜利韩毅科刘楠来源：《中国瓜菜》2014年第05期摘要：为了建立一种直接获得转基因纯系的转化方法，首次开展了农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系研究。

试验以除草剂草胺膦为选择标记，胚胎发生阶段，最适除草剂质量浓度为0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根阶段除草剂质量浓度为2.0 mg·L-1；以羧苄青霉素为抑菌剂，最适抑菌质量为450 mg·L-1；最佳浸染方法为OD600=0.3农杆菌工程菌，浸染10 min；共培养时间为3 d；在浸染菌液和共培养基中加入0.01% 的silwet-77，有利于获得较多抗性胚胎及抗性植株。

该遗传转化体系的建立，为黄瓜转基因方法研究开辟了新途径。

关键词：黄瓜；未受精子房；农杆菌；转化体系黄瓜是我国人民喜食的蔬菜之一，消费量大，种植面积广。

近年，随着人民生活水平的提高，对黄瓜新品种提出了更高要求。

由于黄瓜遗传基础狭窄，依靠现有材料很难选育出商品性、抗病性、品质性状等方面均具有突破性的新品种。

基因工程方法可以创造性地获得新材料，特别是通过常规育种方法不能获得的育种新材料。

基因工程技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用，我国已成功选育了抗虫、抗除草剂、抗病、养分高效、耐盐和高产等一系列转基因水稻品系/组合[1]。

黄瓜转基因研究开始于上世纪90年代，研究者对遗传转化体系进行了大量研究，应用较多的转化方法主要为：以体细胞再生体系为基础的农杆菌介导法[2-4]、花粉管通道法[5-6]，研究者已对黄瓜抗病[7]、抗虫[8]、抗逆[9]、品质[10]、产量[4]等相关性状基因进行目的基因转化研究。

但上述转基因研究中存在转化率低、基因型差异明显、转化体多为嵌合体、多代筛选才能获得抗性纯合株系、重复性差等问题。

目前，黄瓜的转基因研究尚未应用于育种实践。

黄瓜未受精子房培养技术已获得成功，并进行育种应用[11]。

西北农业学报2011,20(2):134-139A cta A gr icultur ae Bor eali-occidental is Sinica黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化田花丽,刘缙,张彦锋,刘君,郭蔼光(西北农林科技大学生命科学学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌712100)摘要:建立黄瓜的高效再生和遗传转化体系,并进行银杏抗菌肽GK-2的遗传转化。

研究结果表明,M S6 (M S+0.005mg/L T D Z+0.20mg/L I AA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽分化,7d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。

进一步用带有银杏抗菌肽GK-2目的基因的农杆菌转化黄瓜,筛选出了侵染时间20min、共培养时间3d以及卡那霉素抗性筛选质量浓度为100mg/L的最佳转化体系。

利用该体系转化黄瓜,获得的转化植株阳性率高达17.9%,并对黄瓜枯萎病表现出明显的抗性。

关键词:黄瓜;遗传转化;银杏抗菌肽中图分类号:S642.2;Q78文献标志码:A文章编号:1004-1389(2011)02-0134-06Establishment of an Efficient Genetic Transformation System of Cucumber and Transformation of Ginkgo Ant-i fungal Peptide GeneT IA N Huali,LIU Jin,ZHAN G Yanfeng,LIU Jun and GU O Aig uang (College of Life Scien ces,Sh aanxi Key Lab oratory of M olecular Biology for Agriculture,Northw estA&F Univer sity,Yangling Shaanxi712100,C hina)Abstract:A fast regeneratio n system and a hig hly efficient g enetic transfo rmatio n system of cucumber w ere established,and the transform ation of Ginkgo ant-i fungal peptide GK-2gene w as also done.The result show ed that M S6(MS+0.005m g/L TDZ+0.20m g/L IAA)m edium w as suitable for cucum-ber callus formation and adventitious bud differentiation,w hich ex hibited100%callus rate and 86.67%differentiatio n rate w ithin7days.T ransferring Ginkgo ant-i fungal peptide GK-2g ene into cucumber by Agr obacter ium-mediated,w e obtained the optimized genetic transfo rmation system o f20 min infection time and3day s co-culture as w ell as100m g/L kanamy cin resistance screening concen-tration.U sing this sy stem,the positive rate w as17.9%,and transgenic plants exhibited a high re-sistance to Fusarium w ilt.Key words:Cucumber;Genetic transformation;Ginkg o ant-i fungal peptide枯萎病是黄瓜的主要病害之一,由黄瓜镰刀胞菌侵害引起,病原菌主要从植株根部或茎部侵入,在维管束内寄生,导致植株严重生长不良而整株枯死,给黄瓜生产造成较大的经济损失[1-2]。

生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。

一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。

常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。

1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。

该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。

首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。

在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。

2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。

将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。

在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。

3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。

通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。

二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。

常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。

1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。

它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。

在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。

通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化任国良;杨绪勤;何欢乐;蔡润;潘俊松【摘要】为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(T“)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究.使用限制性内切酶K pnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体.通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率.580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37％.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2014(032)003【总页数】6页(P89-94)【关键词】黄瓜;果瘤基因;载体构建;遗传转化【作者】任国良;杨绪勤;何欢乐;蔡润;潘俊松【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S642.2;Q786黄瓜是世界普遍栽培的经济作物,也是我国保护地生产的第一大作物[1],对保障蔬菜供应起着重要作用。

长期以来,对于黄瓜的育种研究主要围绕两个方面,一方面是提高黄瓜单位面积产量;另一方面是改良黄瓜的品质性状[2]。

果瘤是黄瓜果实表面的隆起部分,是黄瓜的特有性状。

果瘤是黄瓜十分重要的品质性状,与黄瓜的经济价值息息相关。

遗传转化是验证克隆基因功能最直接、最重要的方法之一,由于很多植物的遗传转化方法成熟,可重复性强,为基因功能验证提供了便利条件。

目前,像拟南芥[3-5]、番茄[6-8]等植物的遗传转化为克隆基因的功能验证提供了十分重要的手段,但是,由于葫芦科植物如黄瓜[9-15]、甜瓜[16-17]等遗传转化很难,且重复性差,给这些植物基因验证带来了很大困难,因此,我们迫切地需要转化效率高、重复性好的遗传转化方法,这将极大地推动黄瓜、甜瓜等植物的基因功能研究。

遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。

其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。

其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。

农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。

改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。

保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。

在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。

在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。

在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。

2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。

发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。

发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。

发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。

例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。

3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。

农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。

以上内容仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。

通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。

实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。

实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。

同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。

结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。

农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。

其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。

本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。

一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。

它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。

因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。

农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。

其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。

二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。

例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。

在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。

其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。

此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。

为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。

一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。

农杆菌介导遗传转化原理农杆菌介导遗传转化是一种常用的遗传工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。

它的原理是利用农杆菌与植物之间相互作用的特点，通过构建适当的载体将外源基因导入农杆菌，然后通过农杆菌感染植物的细胞，将外源基因转移到植物细胞内，使其表达。

农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，具有携带可导致植物组织的病变形成的质体。

这种质体称为农杆菌的转座质粒（Ti质粒），其中包含了表达病原蛋白的基因。

在自然界中，农杆菌通过感染植物细胞并将自身质粒中转座基因转移到植物细胞中，从而引起植物组织的异常增生和瘤形成。

1.构建适当的载体：首先需要构建一个适合农杆菌介导遗传转化的载体，该载体通常包含农杆菌的图纸质粒与外源基因。

2. 转座基因的导入：将外源基因转移到农杆菌中，一般利用基因工程技术将外源基因插入到农杆菌的质粒中，通常选用表达农杆菌亲和素（VirA/VirG）基因的质粒。

这些基因能够诱导农杆菌感染植物细胞并转座到植物基因组中。

3. 农杆菌感染植物细胞：利用农杆菌对植物细胞的感染能力，将转座基因导入植物细胞中。

通常使用离体培养的植物组织进行转化，如幼苗的叶片、幼芽、胚轴等。

在转化过程中，植物组织被浸泡在含有农杆菌的培养液中，农杆菌利用其细菌素（VirE/VirF）蛋白，将转座质粒导入植物细胞中。

4.外源基因的整合与表达：经过转化的植物细胞在激素的诱导下会形成植物的癌瘤样结构，其中农杆菌转座质粒中的外源基因将被整合到植物基因组中。

随着癌瘤的生长，外源基因会在植物组织中得到表达。

5.植物再生和筛选：癌瘤样组织可通过激素的去除和调节激素比例来诱导植物再生。

然后通过选择合适的培养基和条件培养植物胚，获得含有外源基因的转基因植株。

农杆菌介导遗传转化技术广泛应用于植物基因工程中，可用于植物基因功能研究、育种改良、生产含有特定蛋白质的转基因植物等。

这种遗传转化技术具有高效性、简便性和广泛适用性的优点，已被应用于多种作物植物的转基因研究和应用实践中。

农杆菌介导转化黄瓜系统中影响植株再生的几个因素
卢淑雯;刘文萍;南相日;刘建新
【期刊名称】《农业科技通讯》
【年(卷),期】2008(000)007
【摘要】以农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系为基础.以抗冷基因BnCS为外源基因对黄瓜进行转化试验,对转化系统中影响植株再生的主要因素进行研究,结果表明,子叶节预培养1d,再生效果最好;用划伤的方法处理微伤口较好,切割边缘制造微伤口效果较差;侵染时间以20min为最佳,再生芽率达到52.6%;脱菌抗生素cef对芽分化的影响较大,降低再生率近20%.对本试验的再生植株进行PCR检测,结果显示,PCR阳性率为38.4%.
【总页数】3页(P50-52)
【作者】卢淑雯;刘文萍;南相日;刘建新
【作者单位】东北农业大学,哈尔滨,150030;黑龙江省农科院生物技术研究所,哈尔滨,150086;黑龙江省农科院生物技术研究所,哈尔滨,150086;黑龙江省农科院生物技术研究所,哈尔滨,150086
【正文语种】中文
【中图分类】S6
【相关文献】
1.农杆菌介导转化小麦几个影响因素的再研究 [J], 张志清;郑有良;王丕武;魏育明;颜泽洪;刘虹
2.黄瓜离体培养植株再生技术及影响因素分析 [J], 吴丹;孟茜;司龙亭
3.不同因素对黄瓜子叶再生植株影响的研究 [J], 秦华伟;徐跃进;何丹;汪祖程;万正杰
4.影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素 [J], 高三基;陈如凯;马宏敏
5.影响长寿花离体培养及植株再生的几个因素 [J], 黄海帆;李保印;李平
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农杆菌介导的黄瓜开花整合子CFL基因转化仙客来徐京;韩雪;潘孝根;庞基良【期刊名称】《分子植物育种》【年(卷),期】2011(9)5【摘要】以农杆菌介导法将黄瓜开花整合子CFL基因分别对仙客来幼嫩叶片、叶柄及愈伤组织进行遗传转化,比较了三种转化受体的遗传转化效率。

应用超声波辅助的农杆菌介导法,对以叶片为转化受体的仙客来遗传转化体系进行了优化。

结果表明:幼嫩叶片是最佳的转化受体,再生植株GUS阳性率达27.25%。

叶片在农杆菌浸染时辅以60s的超声波处理,经超声波处理的转化效率与未经超声波处理的相比,叶片组织的GUS染色阳性率提高4倍。

经GUS染色、PCR和RT-PCR检测,初步证明CFL基因已整合到仙客来再生植株的基因组中。

本研究成功将CFL基因转入仙客来,并建立了高效的仙客来遗传转化体系,这不仅为培育早花仙客来新品种提供新的途径,也为进一步用分子手段对仙客来进行遗传改良奠定了基础。

【总页数】6页(P629-634)【关键词】仙客来;花期;黄瓜CFL基因;农杆菌介导法【作者】徐京;韩雪;潘孝根;庞基良【作者单位】杭州师范大学生命与环境科学学院;杭州师范大学物业服务中心【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.农杆菌介导的MADS-box基因转化黄瓜初步研究 [J], 赖来;潘俊松;何欢乐;蔡润2.农杆菌介导的CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因遗传转化大岩桐 [J], 张明哲;王利琳;叶丹;吴志毅;陈曦;张晓峰;边红武;韩凝;朱睦元3.农杆菌介导的BnCS基因对黄瓜遗传转化研究 [J], 刘文萍;卢淑雯;刘建新;南相日;柳景兰;李柱刚4.农杆菌介导黄瓜Tril基因转化及体系优化 [J], 肖婷婷;蔡润;杜慧;潘健;孙敬贤;陈岳;张乐钰;潘俊松;王刚;何欢乐5.农杆菌介导的玉米合子基因转化 [J], 刘德璞;袁英;郝文媛;王景会;李晓辉;孔祥梅;姜志磊;孙传波;曲文利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黄瓜离体培养及根癌农杆菌介导的遗传转化体系的
研究的开题报告
1. 研究目的
本研究旨在建立适用于黄瓜的离体培养和遗传转化体系，以便在该
体系中实现基因转移和功能验证，为黄瓜的分子遗传育种提供新的手段。

2. 研究方法
2.1 黄瓜离体培养体系的建立
以黄瓜茎段为试材，在MS培养基中不同浓度的植物生长调节剂的
组合下，筛选出黄瓜最适宜的离体培养体系。

同时，考虑到和遗传转化
相关的因素，培养基配方和培养条件需要综合考虑。

2.2 黄瓜根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立
选用已经在其他植物进行广泛应用的辛烷基农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术，通过处理黄瓜离体组织，将目的基
因导入到黄瓜的基因组中，并在转化后的植株上进行基因型鉴定和表型
分析。

3. 研究内容和意义
黄瓜作为世界上重要的蔬菜之一，在农业生产中发挥着重要的作用。

但是，黄瓜的育种工作发展相对滞后，在遗传多样性的挖掘和利用以及
新品种选育等方面存在诸多问题。

该研究主要探究黄瓜离体培养和遗传
转化体系的建立，扩大黄瓜品种的遗传多样性并且为基因分析、功能分
析和分子机制研究提供有效手段。