圣西马,以基因工程技术引领绿色健康养殖——访深圳市圣西马生物技术有限公司总经理苏向东先生

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１６４~１７３ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２２收稿日期:２０２３－０３－２７基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１５００６０２－１)ꎻ国家现代农业产业技术体系项目(ＣＡＲＳ－０６－１４.５－Ｂ１６)作者简介:王晓东(１９９６ )ꎬ男ꎬ研究实习员ꎬ主要从事高粱栽培与育种工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:１００９１２４７３７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:肖继兵(１９７６ )ꎬ男ꎬ研究员ꎬ主要从事旱作农业研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｘｉａｏｊｂ２００４＠１２６.ｃｏｍ高粱抗旱性研究进展王晓东ꎬ李俊志ꎬ窦爽ꎬ肖继兵ꎬ辛宗绪ꎬ吴宏生ꎬ朱晓东(辽宁省旱地农林研究所ꎬ辽宁朝阳㊀１２２０００)㊀㊀摘要:干旱是限制植物生产力和威胁粮食安全的重要因素之一ꎮ高粱(ＳｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒＬ.Ｍｏｅｎｃｈ)是全球主粮和饲料作物ꎬ因其具有较强的抗旱性和能够在恶劣的环境条件下生存而广泛种植于干旱半干旱地区ꎬ在作物抗旱领域中具有重要的研究价值ꎮ深入解析干旱胁迫下高粱的形态和生理特性㊁鉴定和筛选抗旱品种㊁挖掘相关抗旱基因ꎬ对推动高粱抗旱育种进程㊁提高品种抗旱性㊁提高产量具有重要意义ꎮ本文从干旱胁迫对高粱生长的影响㊁高粱对干旱胁迫的生理响应㊁高粱耐旱性鉴定方法和鉴定指标㊁高粱抗旱性分子生物学和提高高粱抗旱性方法５个方面对高粱抗旱性研究进展进行综述ꎬ并对高粱抗旱性研究方向进行展望ꎬ以期为进一步研究高粱抗旱的形态㊁生理特性及分子机制奠定基础ꎮ关键词:高粱ꎻ干旱胁迫ꎻ生理响应ꎻ分子生物学ꎻ鉴定ꎻ抗旱性中图分类号:Ｓ５１４㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１６４－１０ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎＤｒｏｕｇｈｔＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＳｏｒｇｈｕｍＷａｎｇＸｉａｏｄｏｎｇꎬＬｉＪｕｎｚｈｉꎬＤｏｕＳｈｕａｎｇꎬＸｉａｏＪｉｂｉｎｇꎬＸｉｎＺｏｎｇｘｕꎬＷｕＨｏｎｇｓｈｅｎｇꎬＺｈｕＸｉａｏｄｏｎｇ(ＬｉａｏｎｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＦｏｒｅｓｔｒｙｉｎＡｒｉｄＡｒｅａｓꎬＣｈａｏｙａｎｇ１２２０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｄｒｏｕｇｈｔｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｌｉｍｉｔｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｒｅａｔｅｎｆｏｏｄｓｅｃｕｒｉｔｙ.Ａｓａｇｌｏｂａｌｓｔａｐｌｅｆｏｏｄａｎｄｆｏｒａｇｅｃｒｏｐꎬｓｏｒｇｈｕｍ(ＳｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒＬ.Ｍｏｅｎｃｈ)ｈａｓｇｏｏｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｌｏｎｇｗｉｔｈａｂｉｌｉｔｉｅｓｔｏｓｕｒｖｉｖｅｉｎｈａｒｓｈｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓꎬａｎｄｉｓｗｉｄｅｌｙｐｌａｎｔｅｄｉｎａｒｉｄａｎｄｓｅｍｉ￣ａｒｉｄａｒｅａｓꎬｗｈｉｃｈｇｉｖｅｉｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｖａｌｕｅｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｃｒｏｐｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.Ｉｔｉｓｏｆｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｃｅｉｎａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｂｒｅｅｄｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｏｆｄｒｏｕｇｈｔ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｙｉｅｌｄｏｆｓｏｒｇｈｕｍｔｏｆｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｚｅｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｕｎｄｅｒｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓꎬｉｄｅｎｔｉｆｙａｎｄｓｃｒｅｅｎｔｈｅｅｘｃｅｌｌｅｎｔｄｒｏｕｇｈｔ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓꎬａｎｄｄｉｇｏｕｔｄｒｏｕｇｈｔ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓ.Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｔｈｅｒｅ￣ｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｓｏｒｇｈｕｍｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄｆｒｏｍｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｏｎｓｏｒｇｈｕｍｇｒｏｗｔｈꎬｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｓｏｒｇｈｕｍｔｏｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓꎬｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｉｎｄｅｘｅｓꎬｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙꎬａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｒｅｃｔｉｏｎｏｆｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｓｏｒｇｈｕｍｗａｓｐｒｏｐｏｓｅｄꎬｉｎｏｒｄｅｒｔｏｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ￣ｔｉｃｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｓｏｒｇｈｕｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＳｏｒｇｈｕｍꎻＤｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓꎻＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅꎻＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙꎻＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻＤｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ㊀㊀干旱是限制作物生产发展的最重要因素之一ꎬ有发生范围广㊁频次高㊁持续时间长等特点[１－２]ꎮ目前ꎬ世界上有三分之一以上总陆地面积的干旱和半干旱地区ꎬ我国现有干旱㊁半干旱和亚湿润干旱区近３００万ｋｍ２ꎬ占国土总面积近四成[３]ꎮ其中ꎬ绝大部分是因为缺乏灌溉条件而以雨养农业为主ꎬ其作物产量占全国总产量的比重较小ꎮ选育耐旱性强的作物品种是保证干旱地区高产稳产的重要举措ꎮ干旱可能会发生在作物生长发育的各个阶段ꎮ然而ꎬ在干旱和半干旱地区ꎬ作物生长季开始和结束时发生干旱的可能性较高ꎮ生长季节开始时的干旱胁迫严重影响植物的生长发育ꎮ如果干旱发生在作物开花期或灌浆期ꎬ可能会导致产量严重下降或歉收[４]ꎮ高粱(ＳｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒＬ.Ｍｏｅｎｃｈ)是禾本科一年生草本植物ꎬ主要种植于热带㊁亚热带和温带的干旱半干旱区ꎬ也是我国主要的杂粮作物之一ꎬ是重要的酿用㊁食用㊁饲用㊁帚用作物ꎬ同时也是全球仅次于水稻㊁玉米㊁小麦㊁大豆种植面积的第五大粮食作物ꎮ高粱具有很强的抗旱㊁耐涝㊁耐盐碱㊁耐瘠薄㊁耐高温等抗逆特性[５]ꎮ高粱不同品种间抗旱能力存在较大差异ꎮ近些年从多个方面开展了高粱抗旱性遗传和抗旱品种选育相关研究[６－７]ꎮ本文综述干旱胁迫对高粱生长的影响㊁高粱耐旱性鉴定方法和鉴定指标ꎬ以及高粱对干旱的生理响应ꎬ并从转录组分析㊁抗旱ＱＴＬ定位和全基因组关联分析方面进行梳理和整合ꎬ并对高粱抗旱性的分子调控机制㊁鉴定体系及抗旱性品种选育进行展望ꎬ以期为后人开展相关研究提供理论参考ꎮ１㊀干旱胁迫对高粱生长的影响１.１㊀干旱胁迫对高粱种子萌发和幼苗生长的影响水分缺乏使植物发育迟缓ꎬ干旱胁迫达到一定阈值时ꎬ会显著抑制种子萌发和幼苗生长[８]ꎮ王志恒等[９]研究了高粱萌发阶段受干旱胁迫的响应特性ꎬ发现随着干旱胁迫程度的增加ꎬ高粱种子的发芽率㊁发芽势等显著降低ꎬ种子残留干重逐渐增加ꎬ干物质转移㊁转化效率逐渐下降ꎬ根冠比逐渐增大ꎬ比根重逐渐减小ꎮ长期干旱胁迫降低幼苗的苗高㊁叶长ꎬ幼苗地上部和根的鲜重不同程度的下降[１０]ꎮ１.２㊀高粱萌发期及苗期的抗旱性研究大多数农作物在种子萌发㊁幼苗形成和开花阶段对干旱胁迫较为敏感ꎬ干旱胁迫下萌发期和苗期表现出耐旱性是作物生长发育的前提ꎮ对高粱萌发期和苗期耐旱性的研究发现ꎬ高粱萌发期和苗期的耐旱性是不一致的ꎮ张笑笑[１１]对７３份高粱品种进行萌发期和苗期耐旱性鉴定ꎬ初筛结果发现萌发期和苗期都抗旱的品种５份ꎬ苗期抗旱品种１０份ꎬ田间和室内采用多重表型分析最终得到苗期抗旱品种１份ꎮ郝培彤等[１２]在２０％ＰＥＧ干旱胁迫下评价２１份饲草高粱材料的耐旱性ꎬ筛选出萌发期耐旱和苗期耐旱材料各３份ꎬ萌发期和苗期共同耐旱材料１份ꎮ由此可见ꎬ高粱品种萌发期和苗期耐旱性是不同的ꎬ萌发期耐旱品种苗期不一定耐旱ꎬ苗期耐旱品种萌发期也可能不耐旱ꎮ针对高粱萌发期和苗期耐旱性ꎬ许多学者是分开进行研究的ꎬ而在大田干旱生产条件下ꎬ种子从萌发阶段就已经受到干旱胁迫的影响ꎮ因此研究植物的耐旱性ꎬ应该从种子萌发到苗期进行不间断的干旱胁迫处理ꎬ这样可以更加全面地反映出植物在萌发期和苗期对干旱胁迫的各种反应ꎮ１.３㊀干旱胁迫对高粱光合作用的影响Ｚｈａｎｇ等[１３]研究发现ꎬ在干旱胁迫处理后ꎬ高粱叶片叶绿素总含量及叶绿素ａ㊁叶绿素ｂ含量降低ꎬ且叶绿素ａ的降低幅度显著大于叶绿素ｂꎮ干旱胁迫下叶绿素含量降低主要是由于叶绿素生物合成下降ꎬ从而导致叶绿素加速分解ꎮ植物进行光合作用时ꎬ要保证充足的光照ꎬ然而光照过强ꎬ会造成叶片吸收的光能超出同化所需ꎬ进而造成光抑制或者光破坏[１４]ꎮ因此植物会通过植物激素㊁外源物质等来减缓由于光能过多引起的光抑制ꎬ促进光合活性ꎬ避免ＰＳⅡ系统受到破坏[１５]ꎮ张姣等[１６]的研究表明ꎬ干旱胁迫下ꎬ高粱叶片的净光合速率(Ｐｎ)㊁气孔导度(Ｇｓ)㊁最大光化学效率(Ｆｖ/Ｆｍ)㊁光化学淬灭系数(ｑＰ)㊁电子传递速率(ＥＴＲ)出现不同程度的下降ꎬ初始荧光(Ｆｏ)与对照组相比有所升高ꎬＺｈａｎｇ等[１３]也得出相同的结论ꎮ说明干旱胁迫会使光合相关酶活性丧失ꎬ导致光能过剩而产生积累ꎬ通过热耗散等途径消耗多余的光能ꎬ可以让作物适应干旱胁迫环境ꎮ干旱胁迫导致光合作用能力下降主要原因是非气孔限制[１７]ꎮ王祁等[１８]的研究还发现ꎬ在轻度干旱胁迫下ꎬ高粱叶片ＰＳⅡ系统结构和功能损伤较小ꎬ然而在重度胁迫下ꎬ叶片ＰＳⅡ系统遭到破坏ꎬ进而发生光抑制现象ꎮ光合作用的强弱可以直接反映出植物抵御干旱胁迫的能力ꎬ保证叶绿素含量的稳定㊁保护光合相关酶活性ꎬ可抵５６１㊀第１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王晓东ꎬ等:高粱抗旱性研究进展御干旱胁迫对其光合作用的影响ꎮ２㊀高粱对干旱胁迫的生理响应２.１㊀有机渗透调节干旱胁迫下ꎬ植物细胞通过调节可溶性物质的浓度来维持细胞内外渗透压平衡ꎬ进而应对干旱胁迫带来的影响ꎮ参与渗透调节的物质可分为两类ꎬ第一类是外界环境提供的无机离子ꎬ第二类是胞内合成的有机溶质ꎮ第二类渗透调节物质主要包括甜菜碱㊁脯氨酸㊁糖和糖醇等有机化合物[１９]ꎮ近些年来ꎬ可溶性蛋白㊁可溶性糖㊁脯氨酸等渗透调节物质被广泛研究ꎮ脯氨酸的积累可以使许多植物应对渗透胁迫反应ꎬ作为一种相容的渗透剂ꎬ其可以提高细胞或组织的保水能力ꎬ同时可以作为碳水化合物的来源ꎻ作为一种酶的保护剂ꎬ也可以减轻蛋白质变性ꎬ具有很强的抗氧化能力ꎮ张玉霞等[２０]用聚乙二醇溶液模拟干旱胁迫ꎬ结果表明饲用高粱品种脯氨酸含量与对照组相比显著升高ꎮ王艳秋等[２１]研究发现ꎬ干旱胁迫下高粱叶片的脯氨酸含量显著增加ꎬ且其显著性较大ꎬ是高粱调节适应干旱胁迫的重要指标ꎮ可见ꎬ脯氨酸在干旱胁迫下至关重要ꎬ但是也有不同观点:董喜存等[２２]的研究发现ꎬ在不同程度干旱胁迫下ꎬ甜高粱品种叶片脯氨酸含量变化趋势并不一致ꎮ因此认为ꎬ单纯测定脯氨酸含量不能准确反映抗旱性ꎬ可以将其作为一种抗旱胁迫下的保护性反应ꎮ可溶性糖主要包括葡萄糖㊁蔗糖㊁果糖和半乳糖ꎮ可溶性糖既可以为植物生长发育提供能量ꎬ并且具有信号功能ꎬ又是植物生长发育的重要调节因子[２３]ꎮ何玮等[２４]研究不同干旱胁迫下甜高粱叶片可溶性糖含量的变化时发现ꎬ轻度干旱胁迫下可溶性糖含量先下降然后突然升高ꎬ再下降之后突然升到最高ꎻ在重度干旱胁迫下ꎬ可溶性糖含量先下降ꎬ然后升到最高ꎬ再下降ꎮ总体表明ꎬ在受到干旱胁迫时ꎬ高粱叶片可溶性糖含量整体呈升高趋势ꎮＧｉｌｌ等[２５]研究不同非生物胁迫下高粱可溶性糖含量变化的结果表明ꎬ干旱胁迫下总的可溶性糖含量呈升高趋势且高于对照ꎬ其中果糖含量始终高于葡萄糖和蔗糖ꎮ此外ꎬ在干旱胁迫下ꎬ可溶性糖还可以作为蛋白质渗透保护剂而发挥作用ꎮ可溶性蛋白含量的变化可以直接反映植物渗透调节能力的大小ꎬ它不仅可以提高细胞的保水能力ꎬ而且可以有效地保护生物膜以及细胞的生命物质ꎮ荣少英等[２６]研究不同高粱品种在不同干旱条件下可溶性蛋白的变化时发现ꎬ甜高粱㊁普通高粱和对照相比可溶性蛋白含量随着干旱胁迫的加剧呈上升趋势ꎮ有研究[２７－２８]表明ꎬ在逆境胁迫下ꎬ膜质过氧化产物丙二醛抑制蛋白质的生物合成ꎻ长时间重度干旱使植物体内分解代谢加剧ꎬ导致大量可溶性蛋白分解ꎮ２.２㊀抗氧化防御系统活性氧具有很强的氧化能力ꎮ植物在进行有氧代谢的过程中会产生活性氧ꎬ低浓度的活性氧可以作为信号分子参与调控植物非生物胁迫反应[２９－３０]ꎮ抗氧化防御系统具有维持植物体内活性氧平衡的功能[３１]ꎮ该系统包括两大类ꎬ一类是非酶促抗氧化物质ꎬ其中最为重要的是水溶性抗坏血酸(Ａｓｃ)ꎬ其次是谷胱甘肽(ＧＳＨ)ꎬ还有脂溶性生育酚㊁类胡萝卜素等ꎻ另一类是酶促抗氧化剂ꎬ包括超氧化物歧化酶(ＳＯＤ)㊁过氧化物酶(ＰＯＤ)和过氧化氢酶(ＣＡＴ)[３２]ꎮ植物抗氧化调控系统中ꎬ提高酶活性和抗氧化物的表达量是作物抵御逆境胁迫的关键因素ꎮ陈敏菊等[３３]研究发现ꎬ高粱幼苗叶片ＳＯＤ和ＣＡＴ活性因干旱胁迫的强度不同而存在差异ꎬ土壤含水量在５５％~６０％时ＳＯＤ活性逐渐升高ꎬ随着干旱程度加剧ꎬＳＯＤ活性逐渐下降ꎻＣＡＴ活性在土壤含水量为４０％~６０％时高于对照ꎬ随着干旱加剧活性逐渐降低ꎻＰＯＤ活性的变化规律和ＳＯＤ一致ꎮ这表明轻度干旱胁迫可以提高高粱幼苗叶片抗氧化酶活性ꎮ卢峰等[３４]研究高粱幼苗不同生长阶段受到干旱胁迫时酶活性的变化情况表明ꎬ胁迫６㊁８㊁１２㊁２４ｄ时ＳＯＤ活性显著高于对照ꎬ干旱胁迫１２ｄ时酶活性达到峰值ꎬＰＯＤ活性的变化和ＳＯＤ基本一致ꎮ说明高粱幼苗在受到干旱胁迫时ꎬ通过提高叶片保护酶活性来抵御其危害ꎮ２.３㊀激素调节植物激素参与干旱胁迫调节ꎮ通过外源激素来提高作物的抗旱性是现阶段重要的科学途径之一[３５－３６]ꎮ细胞分裂素通过促进细胞分裂ꎬ延缓植物叶片中叶绿素的降解来提高植物的抗旱性[３７]ꎮ６６１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀生长素可以正向调控四种抗氧化酶(ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ㊁ＧＲ)活性来降低干旱胁迫对植株的抑制作用ꎻ同时生长素可以通过调节根生物量㊁增加根的分支来提高水分吸收效率进而提高抗旱性[３８]ꎮ脱落酸(ＡＢＡ)对植物在逆境胁迫下的应答起着关键作用ꎬ其参与气孔的开关ꎬ保卫细胞的通道活动ꎬ调节转录钙调蛋白的表达ꎬ诱导相关基因的表达[３９]ꎮ植物在受到干旱胁迫时ꎬ也可以通过减少赤霉素的方式来适应胁迫环境[４０]ꎮ关于干旱胁迫下植物激素调节机制ꎬ国内外对水稻㊁小麦等作物的报道较多ꎬ逆境胁迫下高粱中植物激素的作用机制还需进一步探讨和研究ꎮ高粱的抗旱性在生理上涉及到三个方面:第一是干旱胁迫下需要维持高的含水量ꎬ维持高粱水分平衡ꎬ通过增加脯氨酸㊁可溶性糖㊁可溶性蛋白质等物质含量提高渗透调节能力ꎬ维持细胞或者组织持水ꎬ进而维持膨压ꎻ第二是干旱胁迫下保证其基本的生理功能ꎬ通过激素调节㊁酶活性提高等来维持高粱正常的生理功能ꎻ第三是干旱胁迫解除时高粱含水量和生理功能的恢复能力ꎮ做好以上三点ꎬ可以有效地抵御干旱胁迫带来的负面影响ꎮ３㊀高粱耐旱性鉴定方法及鉴定指标因为各个时期的耐旱机制不同ꎬ一般将高粱耐旱性鉴定分为萌发期㊁苗期和全生育期鉴定ꎮ萌发期是作物在干旱胁迫条件下能否完成生长周期的关键时期[４１]ꎬ对高粱群体结构和数量起着决定性作用ꎮ高粱萌发期抗旱性鉴定多采用聚乙二醇(ＰＥＧ)㊁葡萄糖溶液等模拟干旱胁迫环境进行ꎬ通过种子发芽率㊁萌发抗旱指数等反映高粱的抗旱性ꎮ其中ＰＥＧ－６０００是目前被广泛应用的鉴定萌发期抗旱性较为理想的溶液ꎮ陈冰嬬等[４１]使用１５份保持系㊁１８份恢复系和８份杂交种ꎬ通过ＰＥＧ－６０００水溶液模拟干旱胁迫环境ꎬ筛选出１份恢复系和１份保持系萌发期抗旱性亲本材料ꎻ通过抗旱性因子分析ꎬ认为萌发抗旱指数㊁根长和剩余干物质量可以作为高粱萌发期抗旱性筛选的鉴定指标ꎮ候文慧等[４２]利用１５％的聚乙二醇溶液进行干旱胁迫处理ꎬ采用隶属函数分析方法对８个饲用高粱萌发期抗旱性进行排序ꎬ得出ＳＵ９００２为抗旱性最强的材料ꎬＢＪ０６０２为抗旱性最为敏感的材料ꎻ并利用主成分和聚类分析方法ꎬ对萌发期５个抗旱指标进行分析ꎬ结果表明ꎬ发芽指数和发芽率可以作为饲用高粱萌发期抗旱性评价的指标ꎮ采用聚乙二醇等高渗溶液不仅方法简单ꎬ而且排除了外界环境的干扰ꎬ可以获得更加准确的数据ꎬ有效地缩短了鉴定周期ꎬ提高鉴定效率ꎮ苗期是高粱整个生长发育阶段的关键时期之一ꎬ其生长好与坏直接影响着最终的产量和品质ꎬ因此ꎬ苗期抗旱性鉴定尤为重要ꎮ高粱苗期抗旱性鉴定方法可以分为三种ꎮ第一种较为常见的是使用ＰＥＧ－６０００溶液模拟干旱胁迫环境ꎮ赵晓倩[４３]采用２５％ＰＥＧ－６０００对２５９份高粱品种进行干旱胁迫处理ꎬ筛选出极抗旱品种１４份㊁极敏感品种３３份ꎬ并通过主成分分析方法对９个指标进行分析ꎬ结果表明ꎬ苗高㊁成活率㊁根冠比㊁根长和根鲜重可以作为评价高粱苗期抗旱性的指标ꎮ第二种是干旱复水法ꎬ是指在干旱胁迫后进行复水处理ꎬ用复水后的恢复能力指标评价高粱抗旱性ꎮ刘婷婷等[４４]利用盆栽控水法对８个高粱品种幼苗进行干旱复水处理ꎬ通过研究生物量㊁水势㊁渗透式㊁光合参数等生理指标的变化情况来分析不同高粱品种的抗旱能力以及干旱适应能力和旱后复水恢复能力的关系ꎬ分析鉴定出了一份抗旱性强的品种辽杂２１和旱后复水能力强的品种Ｍｏｅｎｃｈ.ｃｖ.Ｇａｄａｍｂａｌｉａꎮ干旱胁迫时维持较高的叶片净光合速率和相对含水量有助于其提高干旱复水能力ꎬ因此ꎬ叶片净光合速率和相对含水量可以作为筛选高粱苗期抗旱性的生理指标ꎮ第三种是反复干旱法ꎬ是指通过高粱苗期连续两次干旱胁迫控水ꎬ以材料存活率为评价指标的一种鉴定方法ꎬ适用于大批量的品种鉴定ꎮ李舒凡[４５]通过反复干旱法ꎬ对２００份高粱品种进行苗期耐旱性鉴定ꎬ将叶片与根系的长势作为抗旱性的评价指标ꎬ能够从存活的质量上区别品种的抗旱性差异ꎬ进一步提高了筛选抗旱性品种的准确性ꎮ对高粱苗期抗旱性的鉴定只能反映出营养生长阶段的情况ꎬ需要结合生殖生长阶段的抗旱性ꎬ对不同品种抗旱能力进行综合评价ꎮ作物全生育期抗旱性鉴定对于抗旱新品种的选育㊁抗旱机制的研究以及抗旱基因的挖掘有着重要意义ꎬ共有两种鉴定方式ꎮ一种是通过人工７６１㊀第１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王晓东ꎬ等:高粱抗旱性研究进展控制水分和环境ꎬ通过干旱棚㊁人工气候箱等模拟干旱环境ꎬ研究各个生育期干旱胁迫对籽粒产量和品质的影响ꎮ汪灿等[４６]通过在干旱棚内设置两个处理对５０份酒用高粱材料进行成株期抗旱性鉴定ꎬ测定了成株期８个农艺性状ꎬ筛选出两个成株期酒用高粱抗旱性强的品种粱丰１４１－３和粱丰２４７－３ꎻ通过主成分㊁灰色关联度分析ꎬ认为分蘖数㊁穗粒数和单株粒重可作为酒用糯高粱资源成株期抗旱性评价指标ꎮ另一种是自然环境法ꎬ设置干旱和水地两个处理ꎬ操作简便ꎬ没有设备的要求ꎬ测定的结果更具说服力ꎬ但受环境因素影响较大ꎬ需要多年的试验数据进行支撑ꎮ袁闯等[４７]采用自然环境法ꎬ设置灌水和干旱两个处理ꎬ通过测定高粱成熟期株高㊁穗重㊁千粒重㊁产量等１０个性状ꎬ对２２份不同品系的甜高粱进行成熟期耐旱性鉴定ꎬ筛选出３份抗旱品种和２份抗旱敏感性品种ꎻ通过主成分分析和逐步线性回归分析ꎬ认为千粒重㊁单株粒重㊁穗粒数和穗茎粗可以作为甜高粱成熟期抗旱性的评价指标ꎮ现阶段ꎬ高粱各抗旱指标评价鉴定基本都是局限于某一个时期ꎬ因此ꎬ需要综合高粱生长发育每个时期的指标来进行综合分析ꎬ建立综合指标评价体系ꎬ以提高高粱品种抗旱性鉴定的可靠性和真实性ꎮ４㊀高粱抗旱性分子生物学研究现阶段ꎬ国内外对于高粱抗旱性鉴定㊁抗旱生理生化以及干旱对农艺性状影响的研究已趋于完善ꎬ并且对于以基因为基础的转基因和分子标记技术也广泛应用到抗旱性分子遗传研究领域ꎬ通过转录组分析㊁ＱＴＬ定位和全基因组关联分析(ＧＷＡＳ)构建分子遗传图谱ꎬ挖掘抗旱相关基因是高粱抗旱性分子遗传研究的发展方向ꎮ４.１㊀转录组分析转录组分析对于研究未知基因功能和特定调节基因的作用机制起着关键作用[４８]ꎮ近年来新一代的转录组测序技术(ＲＮＡ－ｓｅｑ)应运而生ꎬ它可以研究作物在干旱胁迫下的基因表达模式㊁分析抗旱分子机制㊁确定候选基因并进行功能注释[４９]ꎮＤｕｇａｓ等[５０]通过渗透胁迫和脱落酸对高粱植物的转录组进行了分析ꎬ利用转录组测序技术揭示高粱的抗旱机制和基因筛选ꎮＺｈａｎｇ等[５１]使用转录组测序方法对干旱胁迫下高粱的叶和根进行转录组分析ꎬ鉴定出了差异表达基因ꎬ通过富集(ＧＯ)分析出耐旱性相关转录因子ꎮ王志恒等[５２]用ＰＥＧ－６０００对甜高粱进行干旱胁迫ꎬ对高粱幼苗进行转录组测序分析并建立包含ｃＤＮＡ的文库ꎬ对差异表达基因进行ＧＯ富集分析和ＫＥＧＧ分析ꎬ发现有两个代谢通路与干旱胁迫响应相关ꎬ这两个通路都属于遗传信息代谢通路ꎮ表明甜高粱通过激活与干旱胁迫相关的蛋白表达和与碳水化合物相关的基因表达而增强渗透调节能力来响应干旱胁迫ꎮＸｕ等[５３]对两个抗旱性不同的高粱品种进行转录组分析ꎬ运用转录组测序技术确定了候选基因并进行了基因功能注释ꎬ分析了代谢通路ꎮ转录组测序技术促进了基因功能和表达水平的研究ꎬ通过分析干旱胁迫下基因的表达网络和富集通路ꎬ挖掘相关的新基因ꎬ可为今后进一步揭示干旱胁迫调节机制提供理论支撑ꎮ４.２㊀抗旱基因ＱＴＬ定位植物的抗旱性是受多基因控制的数量性状ꎬ遗传复杂ꎮ干旱对作物的影响程度变化较大ꎬ常规育种方法费时㊁费力ꎬ难以选育优质的抗旱品种ꎮ随着分子生物学的发展ꎬＱＴＬ分析被广泛应用到分子遗传领域ꎮ赵辉[５４]利用籽粒高粱６５４和甜高粱ＬＴＲ１０８组成２４４个ＲＩＬ群体ꎬ并构建了分子遗传连锁图谱ꎬ利用ＱＴＬ定位分析耐旱性相关性状ꎬ分别在１㊁４㊁６㊁７染色体上检测出３㊁１㊁１㊁３个与抗旱系数相关的ＱＴＬｓ位点ꎬ并且在ＬＧ－１㊁ＬＧ－６㊁ＬＧ－７上定位到５个影响株高的ＱＴＬｓꎮＨａｕｓｓｍａｎｎ等[５５]用ＩＳ９８３０和Ｎ１３与Ｅ３６－１分别构建２２６个ＲＩＬ群体ꎬ通过构建遗传图谱ꎬ发现标记分别位于１０个连锁群和１２连锁群中ꎬ利用复合区间作图检测到的３个性状的ＱＴＬ数量在５个到８个之间ꎬ解释了３１％和４２％的遗传变异ꎮＳａｋｈｉ等[５６]对１０７份孕穗期的高粱材料进行干旱胁迫处理ꎬ使用１０条染色体上９８个ＳＳＲ标记位点的基因型数据对２３对性状进行关联分析ꎬ鉴定出９个ＱＴＬ与８个抗旱性状相关ꎮ持绿性是高粱干旱胁迫耐受性的一个组成部分ꎮＳｕｋｕｍａｒａｎ等[５７]对Ｔｘ４３６(非持绿性)和００ＭＮ７６４５(持绿性)构建重组自交系进行遗传定位ꎬ利用全基因组单标记扫描和复合区间影射互补方法ꎬ检测到了１５个与抗旱性状相关的ＱＴＬꎻ在１号染色体上发现了籽粒产量ＱＴＬꎬ解释了８％~１６％的表型变异ꎬ８６１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀在第２㊁６㊁９号染色体上发现了开花时间ＱＴＬꎬ解释了６％~１１％的表型变异ꎬ在３㊁４号染色体上发现了持绿性ＱＴＬꎬ解释了８％~２４％的表型变异ꎮ有关高粱ＱＴＬ定位的研究可为后续高粱抗旱基因的精细定位㊁挖掘抗旱性相关基因和分析抗旱性机理奠定基础ꎮ４.３㊀全基因组关联分析(ＧＷＡＳ)ＧＷＡＳ是对多个个体在全基因组范围内进行遗传标记多态性检测ꎬ将基因型和表型进行关联并应用到寻找遗传图谱和挖掘性状相关候选基因的一种方法ꎮ近年来ꎬ为解析高粱抗旱性的遗传基础ꎬＸｉｎ等[５８]研究３５４份甜高粱在两种不同干旱处理下的株高性状ꎬ并将基于株高的平均生产力㊁干旱指数和胁迫耐受指数作为表型数据ꎬ结合甜高粱再测序获得的６１８６个ＳＮＰｓꎬ使用三种不同的数量性状遗传模型进行ＧＷＡＳ分析ꎬ结果表明ꎬ在ＧＬＭ㊁ＭＬＭ和ＦａｒｍＣＰＵ下分别检测到４９㊁５个和２５个耐旱相关的遗传位点ꎬ发现２个耐干旱的候选基因ꎬ其中ꎬＳｂ０８ｇ０１９７２０.１基因与Ａｔｈａｌｉ￣ａｎａＥＦＭＴＦ基因同源ꎬ而Ｓｂ０１ｇ０３７０５０.１基因与玉米ｂＺＩＰＴＦ基因同源ꎮ高奇[５９]用４０１份甜高粱材料进行干旱胁迫处理ꎬ并通过三个与干旱相关的性状筛选出耐旱评价指标并作为表型数据ꎬ利用高粱全基因组ＳＮＰ标记ꎬ对三个性状耐旱指数进行全基因组关联分析ꎬ检测到两个株高性状基因可能是耐旱候选基因ꎮ赵晓倩[４３]对２５９份高粱的７个苗期耐旱性相关性状进行全基因组关联分析ꎬ检测到１０２个显著的ＳＮＰ位点ꎬ筛选出７个抗旱候选基因ꎮ通过全基因组关联分析揭示耐旱候选基因可为后续基因功能验证和高粱耐旱分子机制研究奠定基础ꎮ５㊀提高高粱抗旱性的方法５.１㊀传统育种方法传统的育种方法包括杂交育种㊁回交育种㊁系统选育㊁混合选育等ꎬ其中较为常见的是杂交育种ꎮ杨伟等[６０]通过母本不育系７５０１Ａ和父本恢复系ＲＨＭＣ３８６进行组配杂交ꎬ选育出优质抗旱高粱新品种潞杂９号ꎮ杨婷婷等[６１]研究发现ꎬ以不育系ＳＸ６０５Ａ为母本㊁以恢复系ＳＸ８７０为父本杂交育成高粱品种晋杂３１号ꎮ其选育过程中ꎬ亲本都是通过杂交再连续多代自交得到的稳定品种ꎬ都具有很强的抗旱性ꎬ通过该方法可以提高选育品种的抗旱性ꎮ李继洪等[６２]同样用不育系亲凡Ａ为母本㊁以恢复系苏丹草黑壳３号为父本杂交选育出抗性强的品种吉草３号ꎮ由此可见ꎬ选育抗旱性强的不育系和恢复系是提高高粱杂交种耐旱性的重要途径ꎮ５.２㊀施加外源物质通过对高粱施加外源营养元素㊁生长调节剂以及进行种子引发等都可以提高其抗旱性ꎮＡｈｍｅｄ等[６３]发现硅营养对高粱的生长和生理参数有显著影响ꎬ通过在干旱胁迫条件下对高粱进行施加硅营养处理ꎬ可以提高耐旱基因型品种(系)的叶片水势㊁叶面积指数㊁蒸腾速率和ＳＰＡＤ值ꎬ同时在硅处理下净同化和相对生长量表现出最大值ꎮ张瑞栋等[６４]分别用聚乙二醇(ＰＥＧ)㊁ＫＣｌ㊁ＣａＣｌ２和水杨酸(ＳＡ)对高粱种子进行引发处理ꎬ显示其可以促进干旱胁迫下种子萌发率ꎬ促进胚根和胚芽的伸长ꎮ其原因可能是引发处理提高了胚芽内抗氧化酶活性ꎬ同时促进糖代谢ꎬ增加脯氨酸含量ꎬ解决了干旱胁迫下发芽率低㊁胚根胚芽生长受抑制的问题ꎬ进而提高高粱萌发期的抗旱性ꎮＴｏｕｎｅｋｔｉ等[６５]的研究也得到一致的结果ꎮＫａｍａｌｉ等[６６]研究发现ꎬ使用固氮菌和丛枝菌根真菌(ＡＭＦ)的高粱比不使用的受干旱胁迫程度较轻ꎬ固氮菌和丛枝菌根真菌可以减少高粱电解质渗漏和丙二醛含量ꎬ通过提高花青素㊁类胡萝卜素㊁黄酮㊁生长素(ＩＡＡ)等物质含量和抗氧化酶活性来缓解干旱胁迫的影响ꎮＫａｍａｌｉ等[６７]同时也发现细菌和丛枝菌根真菌也可以通过增加光合色素㊁可溶性蛋白等物质含量提高高粱渗透调节能力ꎬ继而应对干旱胁迫环境ꎮＳｈｅｈａｂ等[６８]研究发现ꎬ脱落酸(ＡＢＡ)和茉莉酸甲酯(ＭｅＪＡ)可以减轻干旱胁迫引起的负面效应ꎬ降低干旱胁迫下高粱中氰化氢(ＨＣＮ)的含量ꎮ植物生长调节剂(ＰＧＲｓ)改善高粱抗旱性归因于可溶性蛋白㊁丙二醛㊁活性氧㊁过氧化氢等的积累减少ꎬ光合参数的改善以及抗氧化酶活性的变化ꎬ进而提高其抗旱能力ꎬ特别在甜高粱中尤为明显ꎮ５.３㊀转基因方法植物抗旱性是受多基因控制的数量性状ꎬ其中包括参与调控植物活性氧㊁可溶性糖㊁抗氧化酶㊁叶绿素和ＡＢＡ信号转导等生理生化过程的基９６１㊀第１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王晓东ꎬ等:高粱抗旱性研究进展。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１４７~１５５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２０收稿日期:２０２３－０４－０７基金项目:国家重点研发计划 食品安全关键技术研发 重点专项(２０１７ＹＦＣ１６０１４００)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＴＺＸＤ００２２)ꎻ泰山学者工程专项经费资助(ｔｓｑｎ２０１９０９１６８)ꎻ山东省自然科学基金青年基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ２２６)ꎻ济南市 新高校２０条 项目(２０２２２８０６２)ꎻ山东省农业科学院国际科技合作专项(ＣＸＧＣ２０２２Ｆ０９)作者简介:袁玮(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为食品微生物检测技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:７９４３９３６１７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:陈相艳(１９７３ )ꎬ女ꎬ研究员ꎬ研究方向为食源性病原微生物检测及标准物质研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:３１５４７８８４５＠ｑｑ.ｃｏｍ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用袁玮１ꎬ２ꎬ陈蕾蕾１ꎬ２ꎬ杨金玉１ꎬ周庆新１ꎬ２ꎬ裘纪莹１ꎬ赵双枝１ꎬ付恩君１ꎬ赵国琰２ꎬ陈相艳１(１.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东师范大学生命科学学院ꎬ山东济南㊀２５００１４)㊀㊀摘要:针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状ꎬ本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作ꎮ首先构建了创伤弧菌毒力基因ｖｖｈＡ的重组质粒ꎬ经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉ꎬ然后对其进行ＰＣＲ定性检测及紫外分光光度计法定量分析ꎮ均匀性检验结果表明ꎬ样品间无显著差异ꎬ均匀性良好ꎬ符合预期目标ꎻ短期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在４ħ㊁３７ħ条件下稳定保存１４天ꎻ长期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ研究结果表明ꎬ创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求ꎬ为创伤弧菌的快速㊁高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质ꎮ将标准样品应用于鱼类㊁贝类等１０份海鲜类食品样品的检测中ꎬ经传统培养法验证ꎬ检测结果准确无误ꎮ本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力ꎬ为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础ꎮ关键词:创伤弧菌ꎻ质粒定性标准样品ꎻ水产品ꎻ检测中图分类号:Ｓ８５２.６１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１４７－０９ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｅｒｔｉｆｉｅｄＰｌａｓｍｉｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｆｏｒＨｅｍｏｌｙｓｉｎＧｅｎｅｖｖｈＡｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓａｎｄＩｔ ｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＡｑｕａｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＹｕａｎＷｅｉ１ꎬ２ꎬＣｈｅｎＬｅｉｌｅｉ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＪｉｎｙｕ１ꎬＺｈｏｕＱｉｎｇｘｉｎ１ꎬ２ꎬＱｉｕＪｉｙｉｎｇ１ꎬＺｈａｏＳｈｕａｎｇｚｈｉ１ꎬＦｕＥｎｊｕｎ１ꎬＺｈａｏＧｕｏｙａｎ２ꎬＣｈｅｎＸｉａｎｇｙａｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄ＆ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｖｅｌＦｏｏｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤｕｅｔｏｌａｃｋｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎＣｈｉｎａꎬａｒｅａｄｙ￣ｔｏ￣ｕｓｅｃｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｒｅｉｎ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｉｒｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｐｏｗｄｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｅｉｎｇｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ.Ｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｗａｓａｓｅｘｐｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｅ￣ｐａｒｅｄｐｌａｓｍｉｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｓｔａｂｌｙｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ１４ｄａｙｓａｔ４ħｏｒ３７ħꎬａｎｄｆｏｒａｔｌｅａｓｔ１２ｍｏｎｔｈｓａｔ－２０ħ.ＴｈｅｏｖｅｒａｌｌｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｎａｔｉｏｎａｌｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｒｅｌｉａｂｌｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ.Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ１０ｓｅａｆｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｓｕｃｈａｓｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈ.ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅａｃｃｕｒａｔｅｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ.ＡｂｏｖｅａｌｌꎬｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｌａｙｉｎｇａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓꎻＣｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌꎻＡｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓꎻＤｅｔｅｃｔｉｏｎ㊀㊀创伤弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ)是一种革兰氏阴性菌ꎬ主要特性为嗜盐㊁喜温ꎬ自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２]ꎬ是一种人畜共患病原菌ꎬ容易感染鱼㊁虾㊁牡蛎㊁蛤㊁螃蟹等海产品ꎬ人类通过生食或食用未完全煮熟的海产品㊁破损皮肤直接接触被其污染的海水或海产品而患病[３]ꎮ创伤弧菌与霍乱弧菌㊁副溶血弧菌并称为人类三大致病弧菌[４]ꎬ弧菌感染病例具有明显的季节性ꎬ大多数发生在夏季和初秋气温较高的时期[５]ꎮ随着全球气候变暖㊁海洋温度升高等自然条件的变化ꎬ创伤弧菌的感染率也逐年增加ꎮ在全世界范围内创伤弧菌感染的死亡率高达６０％ꎬ在美国约为３３％ꎬ使其成为严重的公共卫生和食品安全问题[６－７]ꎮ创伤弧菌感染的主要症状包括肠胃炎㊁原发创伤性感染㊁败血症和坏死性筋膜炎等ꎬ免疫力低下或患有糖尿病㊁肝脏疾病等慢性基础病的患者属于易感人群[８]ꎮ创伤弧菌伤口感染通常以肿胀㊁红斑和剧烈疼痛为特征ꎬ潜伏期短ꎬ发病迅速ꎬ病变经常演变为可坏死的囊泡或充满液体的大泡ꎬ最终引起多脏器衰竭[９]ꎮ创伤弧菌菌体产生的创伤弧菌外毒素通过特定的毒力机制引发疾病ꎮ创伤弧菌毒力因子主要包括溶细胞素㊁铁载体㊁金属蛋白酶㊁荚膜多糖等[１０]ꎬ由ｖｖｈＡ基因编码的创伤弧菌溶细胞素是唯一分泌到细胞外的外毒素ꎬ具有创伤弧菌种属特异性ꎬ可作为鉴定创伤弧菌的指标[１１]ꎮ当前ꎬ对创伤弧菌进行定量检测主要通过平板计数㊁ＭＰＮ法等传统培养法ꎬ这些方法需要进行过夜培养㊁选择性平板分离㊁生化鉴定㊁血清学检测等繁琐的试验步骤ꎬ不仅耗时费力ꎬ同时样本中杂菌的过量繁殖也会对鉴别结果产生影响ꎮ另外ꎬ由于水产品中的创伤弧菌通常处于 活的且不可培养 的状态[１２－１３]ꎬ传统的培养方法很难对该部分创伤弧菌进行有效鉴定ꎬ严重降低了检测结果的准确度ꎮ作为最危险的食源性细菌之一ꎬ创伤弧菌造成了９５％的海鲜相关死亡ꎬ已成为一个主要的食品安全问题[１４]ꎮ随着食品供应链的全球化ꎬ创伤弧菌的定期监测变得更加重要ꎮ为了满足当下快速㊁高通量检测的需求ꎬ分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用ꎬ但相关的参考物质相对匮乏ꎮ食源性微生物检测即用型标准样品的研制ꎬ有助于解决目前国内食品微生物检测中存在的参考物质不足的难题ꎬ使具有自主知识产权的标准样品在相关领域得到更好的推广和应用ꎬ从而摆脱对国外标准样品的依赖ꎮ因此ꎬ建立创伤弧菌鉴定检测即用型质粒定性标准样品用于其快速㊁高通量鉴定ꎬ对提高水产品的质量安全㊁保证人类健康具有重要意义ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀菌株来源㊀创伤弧菌(ＣＩＣＣ２１６１５)来源于中国工业微生物保藏中心ꎮ１.１.２㊀主要试剂㊀琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司ꎻＰＮＣＣ增菌液基础培养基㊁ＰＮＣＣ添加剂㊁ｍＣＰＣ琼脂基础培养基㊁多粘菌素Ｅ㊁多粘菌素Ｂ购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ㊁Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒ㊁Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋ￣ｅｒ㊁质粒大提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司ꎻ５０ˑＴＡＥ缓冲溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻ２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ㊁琼脂糖８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀凝胶ＤＮＡ回收试剂盒㊁ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司ꎮ１.１.３㊀仪器和设备㊀ＺＨＷＹ－２００Ｈ恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司ꎻＳＷ－ＣＪ－２Ｄ双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司ꎻＣ１０００ＴｏｕｃｈＰＣＲ仪㊁ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司ꎻＪＹ６００Ｃ水平电泳仪㊁ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀重组质粒的获取与验证㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎬ获得重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ并保存于大肠埃希氏菌Ｔｏｐ１０菌株中ꎮ依据ＧＢ４７８９.４４ ２０２０«食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验»[１５]中创伤弧菌ＰＣＲ检测的引物序列ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表１)ꎮ以重组质粒为模板ꎬ利用创伤弧菌鉴定引物ꎬ对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析ꎬ使用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒对ＰＣＲ产物进行胶回收ꎬ使用ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒将ＰＣＲ纯化产物连接至ｐＬＢ－ｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ上ꎬ并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ置于３７ħ培养箱培养１２ｈꎮ从平板上挑取单菌落ꎬ经ＰＣＲ反应鉴定为阳性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定ꎬ测序结果与预期一致的ꎬ即为验证正确的重组质粒ꎮ将携带正确重组质粒的大肠埃希氏菌于－８０ħ超低温冰箱中甘油管保存ꎮ㊀㊀表１㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因的引物序列引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)片段大小/ｂｐｖｖｈＡ－ＦＣＣＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡｖｖｈＡ－ＲＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＣＣ５１９１.２.２㊀重组质粒的提取㊀将携带重组质粒的大肠埃希氏菌甘油管解冻ꎬ接入４ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ放入２００ｒ/ｍｉｎ的振荡摇床中３７ħ培养１２ｈꎬ取２ｍＬ种子液转接于２００ｍＬ的ＬＢ液体培养基中扩大培养ꎬ获取大量携带重组质粒大肠埃希氏菌的培养液ꎬ利用细菌质粒大提试剂盒提取质粒ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性ꎬＰＣＲ验证目的基因ꎬ紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度ꎮ１.２.３㊀重组质粒的含量检测㊀取重组质粒样品１μＬꎬ于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计中检测浓度ꎬ每管检测两次ꎮ１.２.４㊀重组质粒的分装㊀将大提的质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ每管１００μＬ分装至螺口冻存管中ꎬ贴上标签ꎮ１.２.５㊀重组质粒的冷冻干燥㊀由于质粒样品较为稳定ꎬ分装后可直接冻干ꎮ在－２５ħ㊁真空度为５０Ｐａ条件下冻干２０ｈꎮ１.２.６㊀质粒定性标准样品的均匀性分析㊀按照随机抽号系统抽取的号码ꎬ抽取质粒定性标准样品１２管ꎬ用１００μＬ无菌水溶解质粒冻干粉ꎮ取０.５μＬ溶解的质粒样品作为ＰＣＲ模板ꎬ按照１.２.１方法进行基因定性检测ꎻ取质粒样品２μＬꎬ按照１.２.１方法琼脂糖凝胶电泳分析质粒样品的完整性ꎻ取质粒样品１μＬꎬ采用紫外分光光度计法进行复溶质粒样品的定量试验ꎬ检测样品的浓度ꎬ每管测两次ꎬ核酸含量＝核酸浓度ˑ水化体积ꎬ核酸含量结果统计分析采用方差分析法ꎮ１.２.７㊀质粒定性标准样品的稳定性分析㊀稳定性检验方法同均匀性检验ꎬ核酸含量结果统计分析采用单因素方差分析法ꎮ短期稳定性检验:采取两种短期稳定性试验ꎮ第一种模拟冰袋运输:在４ħ条件下的短期储存稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于４ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎻ第二种模拟高温运输:在３７ħ条件下稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于３７ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天时每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎮ长期稳定性检验:质粒样品经冷冻干燥后ꎬ需要在－２０ħ条件下长期冷冻保存ꎮ为了测定质粒样品长期保存时间及其稳定性ꎬ每次检测时ꎬ从冷冻样品中随机取出３管样品ꎬ每管重复２次ꎮ抽样时间点遵循先密后疏的原则ꎬ分别在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月共７个时间点抽样检测ꎮ１.２.８㊀创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用㊀食品样本的前处理:将购买的食品样本按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求处理ꎬ在无菌条件９４１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用下ꎬ称取鲫鱼㊁偏口鱼㊁银鲳鱼㊁鲤鱼㊁鲅鱼㊁黄花鱼６种鱼类样品的表面组织㊁肠和腮各２５ｇꎬ花蛤㊁海蛎子和生蚝３种贝类样品内容物各２５ｇꎬ明虾的头足部组织２５ｇꎬ分别放入含２２５ｍＬＰＮＣＣ增菌液的无菌均质袋ꎬ用拍打式无菌均质器拍打２ｍｉｎ制成样品匀液ꎻ将均质袋放入培养箱３７ħ培养１８ｈ获得增菌液ꎬ取距液面１ｃｍ深处菌液１ｍＬ放入离心管中ꎬ９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎻ用１ｍＬＰＢＳ磷酸盐缓冲液悬浮清洗后９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎬ重复２次ꎻ加入１ｍＬ无菌去离子水ꎬ煮沸１０ｍｉｎꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎮＰＣＲ分析:将上清液用作ＰＣＲ反应的ＤＮＡ模板ꎻ随机抽取１管创伤弧菌重组质粒定性标准样品ꎬ加入１００μＬ无菌去离子水溶解ꎬ作为阳性对照ꎻ将大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３基因组ＤＮＡ冻干粉用３００μＬ无菌水溶解(终浓度为２０ｎｇ/μＬ)后作为阴性对照ꎻ无菌去离子水为空白对照ꎬ按照１.２.１的方法进行ＰＣＲ分析ꎮ创伤弧菌的分离验证:取检测为阳性的食品样本的增菌液ꎬ用接种环将其划线接种于ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ验证菌落形态是否符合创伤弧菌菌落形态特征ꎬ即圆形㊁扁平ꎬ光照下透明但中心不透明的黄色或橘黄色菌落ꎬ直径１~２ｍｍꎮ创伤弧菌的生化鉴定:按照ＧＢ４７８９.４４２０２０进行创伤弧菌的培养和生化特性鉴定ꎮ１.３㊀数据统计与分析使用ＳＰＳＳ２６.０软件的ＡＮＯＶＡ法进行单因素方差分析ꎬ统计各处理组之间的差异性ꎬ数据用平均值ʃ标准误 表示ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀创伤弧菌重组质粒的验证以创伤弧菌重组质粒为模板ꎬ对其进行目的基因ＰＣＲ扩增验证ꎬ以大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３为阴性对照ꎬ无菌去离子水为空白对照ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增结果(图１Ａ)显示ꎬ创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ基因为阳性ꎬ条带清晰ꎬ片段大小为５１９ｂｐꎬ符合目的条带大小ꎬ说明成功构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ重组质粒ꎬ质粒图谱如图１Ｂ所示ꎮＭ:Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｖｈＡ质粒ꎻ２:阴性对照ꎻ３:空白对照ꎮ图１㊀创伤弧菌重组质粒ＰＣＲ扩增(Ａ)及ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ重组质粒图谱(Ｂ)２.２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度及纯度分析取重组质粒１μＬꎬ利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００测定其浓度和纯度ꎬ结果如表２所示ꎬＡ２６０/２８０㊁Ａ２６０/２３０均超过１.８ꎬ说明所提取的质粒纯度高ꎬ无蛋白质和有机物污染ꎻ对其携带的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图２Ａ)显示ꎬ目的基因ｖｖｈＡ条带单一且片段大小符合预期ꎬ质粒完整性分析(图２Ｂ)显示质粒条带完整ꎬ说明所制备的质粒符合预期ꎮ㊀㊀表２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度与纯度样品管号浓度/(ｎｇ/μＬ)Ａ２６０/Ａ２８０Ａ２６０/Ａ２３０ＶＡ１１６７.０１.８６２.２１ＶＡ２１８９.５１.８８２.２９ＶＡ３１７３.６１.８８２.２６ＶＡ４８２.１１.８９２.５３０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｍ:Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１~８:ｖｖｈＡ质粒样品ꎮ图２㊀创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ的ＰＣＲ扩增(Ａ)及质粒完整性(Ｂ)分析㊀㊀将４管大提的创伤弧菌重组质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ取１００μＬ分装至２ｍＬ螺口冻存管中ꎬ所有质粒溶液分装４５０管后ꎬ置于真空冷冻干燥机中按照冷冻程序真空冷冻干燥ꎬ获得白色粉末状的冻干质粒样品ꎬ设计创伤弧菌重组质粒定性标准样品标签纸ꎬ打印并贴在管外(图３)ꎮ质粒定性标准样品置于－２０ħ冰箱冻存ꎮ２.３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的均匀性分析从４５０管质粒标准样品中随机抽取１２管进行ＰＣＲ定性试验ꎬ结果如图４Ａ所示ꎬ各管ＰＣＲ扩增目的基因均为阳性ꎬ条带单一且清晰ꎬ图４Ｂ显示质粒完整无降解ꎮ使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计进行质粒标准样品的浓度㊁纯度分析ꎬ对所测数据进行单因素方差分析ꎬ结果如表３所示ꎬ在９５％的置信概率下ꎬＦ值小于Ｆ临界值ꎬ各管间质粒含量无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品均匀性良好ꎮ图３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~１２:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎮ图４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ)及均匀性(Ｂ)分析㊀㊀表３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品均匀性试验方差分析平方和ＳＳ自由度均方ＭＳＦ值Ｆ临界值置信概率Ｐ值组间０.０２１１１０.０２２.７００２.７２０.９５０.０５１组内０.００８１２０.０１２.４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的稳定性分析温度是运输过程中影响质粒定性标准样品质量的主要因素ꎬ因此设计不同温度模拟质粒样品运输条件ꎬ以质粒标准样品目的基因阳性检出㊁质粒完整性及核酸含量变化确定其短期稳定性(运输稳定性)ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品分别在４ħ和３７ħ条件下保存１４ｄꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图５㊁图６)显示第１天和第１４天目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小ꎬ质粒无降解ꎻ质粒含量统计学分析结果如图７所示ꎬ各时间点间无显著性差异ꎬ表明质粒含量无明显变化ꎬ说明质粒定性标准样品在上述条件下是稳定的ꎮ因此创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品可与冰袋(４ħ)一起运输ꎬ也可在温度较高(３７ħ)且无降温装置条件下运输ꎮ１５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~６:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎻ７:阴性对照ꎻ８:空白对照ꎬ下同ꎮ图５㊀４ħ条件下保存１天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图６㊀３７ħ条件下保存１４天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图７㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准㊀㊀样品短期稳定性定量分析为了分析创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的长期稳定性ꎬ在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月随机抽取３管样品进行定性和定量分析ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在－２０ħ条件下保存１２个月ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果显示第１个月和第１２个月目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小(图８Ａ㊁Ｂ)ꎬ质粒无降解(图８Ｃ㊁Ｄ)ꎮ质粒含量统计学分析结果如图９所示ꎬ各时２５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀间点间无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品在－２０ħ条件下稳定ꎬ说明创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ图８－２０ħ条件下保存１㊁１２个月创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图９－２０ħ条件下创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒㊀㊀定性标准样品长期稳定性定量分析２.５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用为了验证创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用效果ꎬ将其作为阳性对照ꎬ参照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０的方法ꎬ利用ＰＣＲ对１０种水产品中的创伤弧菌基因ｖｖｈＡ进行检测ꎬ每种样品取样７次ꎬ每个样品７个重复ꎮ结果如表４所示ꎬ在１０种水产品样本中检测出１例ｖｖｈＡ基因阳性ꎮ将阳性样本的增菌液划线至创伤弧菌鉴定平板ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板中ꎬ每种平板重复划线３次ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ平板菌落为黄色㊁圆形且扁平(图１０)ꎮ挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求进行生化鉴定(图１１㊁表５)ꎬ验证此阳性样本感染创伤弧菌ꎮ㊀㊀表４㊀海鲜样品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ检出结果海鲜类型检测份数检出阳性次数鱼类６０贝类３１虾类１０总计１０１㊀㊀表５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本生化鉴定结果项目结果赖氨酸紫色氨基酸对照黄色无盐胰胨水微弱生长６％氯化钠胰胨水生长旺盛８％氯化钠胰胨水不生长１０％氯化钠胰胨水不生长Ｖ－Ｐ半固体穿刺周围扩散增长３５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用图１０㊀ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板创伤弧菌菌落特征图１１㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本菌体的生化鉴定结果３㊀讨论与结论本研究构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ经测序验证后ꎬ将质粒样品真空冷冻干燥制成创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品冻干粉ꎮ对其进行均匀性和稳定性分析ꎬ检测结果均为阳性且符合目的基因片段的大小ꎬ质粒样品无降解ꎻ均匀性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品无管间差异ꎬ均匀性良好ꎻ稳定性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品在低温(４ħ)或高温(３７ħ)下可稳定保存１４天ꎻ在－２０ħ下长期存储１２个月ꎬ亦未观测到不稳定性ꎮ将所研制的创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品应用于１０种海鲜产品的检测ꎬ检出１份阳性样本ꎬ经传统培养法和生化鉴定验证ꎬ证实阳性样本确为创伤弧菌污染ꎬ表明质粒定性标准样品能够满足水产品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的快速㊁精确检测ꎮ该研究填补了我国创伤弧菌鉴定即用型质粒定性标准样品的空白ꎬ为创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测领域的应用研究打下了良好的基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＹｕｎＮＲꎬＫｉｍＤＭ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ:ａｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｔｈｒｅａｔｔｏｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ[Ｊ].ＫｏｒｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０１８ꎬ３３(６):１０７０－１０７８.[２]㊀Ｈｅｒｎáｎｄｅ￣ＣａｂａｎｙｅｒｏＣꎬＡｍａｒｏＣ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｌｉｆｅｃｙｃｌｅｏｆｔｈｅｚｏｏｎｏｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２２(１０):４１３３－４１４８.[３]㊀彭钟琴ꎬ黄璐.水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展[Ｊ].食品安全导刊ꎬ２０２１(３６):１９０－１９２.[４]㊀ＷａｎｇＭＹꎬＨｕＣＪ.ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｆＶｉｂ￣ｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏ￣ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２９(１２):１４７０－１４７３.[５]㊀ＩｗａｍｏｔｏＭꎬＡｙｅｒｓＴꎬＭａｈｏｎＢＥꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｓｅａ￣ｆｏｏｄ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１０ꎬ２３(２):３９９－４１１.[６]㊀ＪｏｎｅｓＭＫꎬＯｌｉｖｅｒＪＤ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｅｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙꎬ２００９ꎬ７７(５):１７２３－１７３３.[７]㊀ＨｅｎｇＳＰꎬＬｅｔｃｈｕｍａｎａｎＶꎬＤｅｎｇＣＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｂｕｒｄｅｎ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:９９７.[８]㊀ＨｏｒｓｅｍａｎＭＡꎬＳｕｒａｎｉＳ.ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｓｅｖｅｒｅｓｅｐｓｉｓａｎｄｓｋｉｎａｎｄｓｏｆｔ￣ｔｉｓｓｕｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓ￣ｅａｓｅｓꎬ２０１１ꎬ１５(３):ｅ１５７－ｅ１６６.４５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[９]㊀Ｂａｋｅｒ￣ＡｕｓｔｉｎＣꎬＴｒｉｎａｎｅｓＪꎬＧｏｎｚａｌｅｚ￣ＥｓｃａｌｏｎａＮꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｈｏｌｅｒａｖｉｂｒｉｏｓ:ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｂａｒｏｍｅｔｅｒｏｆｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２５(１):７６－８４.[１０]ＬｉＧꎬＷａｎｇＭＹ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎｉｔｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｐｓｉｓ[Ｊ].ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０２０ꎬ６５(２):２６５－２７４.[１１]ＧａｖｉｎＨＥꎬＢｅｕｂｉｅｒＮＴꎬＳａｔｃｈｅｌｌＫＪ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｄｏｍａｉｎｒｅ￣ｇｉｏｎｏｆｔｈｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓＭＡＲＴＸｔｏｘｉｎｃｏｎｆｅｒｓｂｉｐｈａｓｉｃｅｐｉ￣ｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｓｐｒｅａｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１７ꎬ１３(１):ｅ１００６１１９.[１２]ＲａｏＮＶꎬＳｈａｓｈｉｄｈａｒＲꎬＢａｎｄｅｋａｒＪＲ.Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬｒｅｓｕｓｃｉｔａ￣ｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｅｓｏｆｖｉａｂｌｅｂｕｔｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅａｗａｔｅｒ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ３０(８):２２０５－２２１２.[１３]包秋华ꎬ刘倩宇.基于ＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅ细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析[Ｊ].食品科学ꎬ２０２３ꎬ４４(５):２４８－２５６.[１４]ＺｈａｎｇＸꎬＧｕｏＢꎬＹａｎｇＬＨꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ１２ａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉ￣ｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｏｎｅｔｕｂｅ[Ｊ].ＡｃｔａＢｉｏ￣ｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＳｉｎｉｃａꎬ２０２３ꎬ５５(２):３２２. [１５]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准:食品微生物学检验创伤弧菌检验:ＧＢ４７８９.４４２０２０[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０２０.５５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用。

专利名称：一种分泌抗菌肽的乳酸链球菌基因工程制备方法与应用
专利类型：发明专利
发明人：张捷,郑文官,潘韵,彭永鹤,李永新
申请号：CN201210051654.8
申请日：20120301
公开号：CN103289944A
公开日：
20130911
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种分泌抗菌肽的益生菌的基因工程制备方法。

本发明所应用的益生菌为乳酸链球菌ctis subsp.cremoris MG1363。

本发明实例引用的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05具有序列表中SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

本发明益生菌与其表达的抗菌肽具有联合免疫效应，应用于制备保健类产品，如相关饲料添加剂、食品、医药产品等。

申请人：深圳市圣西马生物技术有限公司
地址：518057 广东省深圳市南山区高新中四道31号研祥科技大厦10楼B1-B2单元
国籍：CN
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老西的中国情愫--记浙江省首位外籍劳模、巨化巨圣公司副总
经理西特里维先生
吴水清;刘红平;鲍伟忠
【期刊名称】《国际人才交流》
【年(卷),期】2004(000)012
【摘要】@@ 10年前,一位已届花甲之年的氟化工专家和学者,从俄罗斯远道来华工作,为了浙江巨化集团巨圣公司氟化工事业、为了中俄合作和友谊,在这片热土上,谱写了一曲"老骥伏枥,志在千里"的新篇章.他就是拥有多项技术发明和专利的参与者、现任俄罗斯应用化学科学中心设计院院长助理、巨化巨圣公司副总经理西特里维·德米特里·尼基甫洛维奇先生.
【总页数】2页(P26-27)
【作者】吴水清;刘红平;鲍伟忠
【作者单位】无
【正文语种】中文
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1.浙江首位外籍劳模西特里维 [J], 《国际人才交流》编辑部
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4.圣西马,以基因工程技术引领绿色健康养殖——访深圳市圣西马生物技术有限公
司总经理苏向东先生 [J],
5.沧海横流劲风扬帆——访深圳市圣西马生物技术有限公司副总经理李永新先生[J], 王芳
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张超峰：我们都在宣传健康养殖的理念
陈石娟
【期刊名称】《海洋与渔业》
【年(卷),期】2011(000)006
【摘要】抗菌肽作为替代抗生素的“新秀”．近年来在动物养殖、饲料加工、疾
病防控等领域成了高频词。

深圳市圣西马生物技术有限公司是国内专业生产抗菌肽的高新技术企业．也是全球最早将抗菌肽技术应用于畜牧养殖业的企业．近期也在致力于从事水产动物专用抗菌肽方面的研究及产品开发。

近日。

圣西马高级工程师、市场部经理张超峰先生在接受本刊专访时。

诠释了圣西马健康养殖的理念。

【总页数】2页(P27-28)
【作者】陈石娟
【作者单位】
【正文语种】中文
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1.积极探索不断创新做节能减排带头人——上海石化腈纶部张超峰同志主要先进事迹 [J], 石腈
2.转变养殖理念,推进健康养殖—奶牛健康养殖理念 [J], 张丽明;付国兵
3.倡导健康养殖理念发展现代畜牧产业——对健康养殖的几点思考 [J], 李强斌;
4.完整准确全面贯彻新发展理念扎实建筑材料行业碳达峰目标的提前实现——学习领会中共中央、国务院《关于完整准确全面贯彻新发展理念做好碳达峰碳中和工作的意见》的贯彻措施 [J], 中国建筑材料联合会
5.宣传科学养殖知识,传播健康养殖理念——河北农大赴永年开展社会实践暨见习实习活动 [J], 赵娜
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服务永新——访SKF中国有限公司副总经理王辉先生
杨霞
【期刊名称】《汽车制造业》
【年(卷),期】2006(000)013
【摘要】斯觊孚精密机械（上海）有限公司暨SKF主轴服务中心2006年6月16日举行了隆重的开业庆典，从而更好地实现了对各种品牌．各种结构主轴提供全面的维修．维护．调试．升级及现场指导．安装等一站式服务内容。

【总页数】1页(P20)
【作者】杨霞
【作者单位】《汽车制造业》记者
【正文语种】中文
【中图分类】F279.243
【相关文献】
1.借力SKF ABBA发力经济危机——访SKF全资子公司ABBA总经理王辉先生[J], 张淼;邢立显
2.准确定位确保质量完善服务——访SKF台资子公司国科精工(上海)有限公司总经理王辉 [J], 汪艺
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海上明珠——圣马科发射场
马晨
【期刊名称】《航海》
【年(卷),期】2007(000)005
【摘要】圣马科发射场位于非洲东部肯尼亚东海岸的恩格瓦纳海湾。

距海岸4．8千米，有一个巨大的海上平台，这就是意大利政府委托罗马大学航空与航天研究中心筹建并管理使用的圣马科航天发射场。

圣马科发射场处于南纬2．9度、东经40．3度的位置，是距赤道最近的一个航天发射场，同时也是世界上惟一的一个
海上发射场。

【总页数】2页(P41,33)
【作者】马晨
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】V551
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射场3.圣西马,以基因工程技术引领绿色健康养殖——访深圳市圣西马生物技术有
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life'sDHA,您一生的健康呵护神奇的海藻：life's DHA健康
安全的缔造者
佚名
【期刊名称】《中国乳品工业》
【年(卷),期】2010(038)005
【摘要】@@ 大自然以其无穷的智慧将一些神奇罕见的功能赋予了各种藻类.创建于1985年的马泰克生物科学有限公司发现了藻类这些有益于人类健康的特征并进行开发,将这些营养特质应用于life'sDHA产品,从而开创了海藻营养应用的先河.1985年,一些科学家开始研究藻类对于长期太空作业的有益用途.
【总页数】1页(P12)
【正文语种】中文
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5.life'sDHA:让健康相伴您的一生——访马泰克生物科学有限公司罗本·阿布瑞尔博士 [J], 马哲
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