ELISA检测中存在的问题及对策

ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。

2.试剂失效。

3.试剂过失效日期。

4.试剂开启时间过长，污染。

5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。

6.反应时间不足。

7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。

1.控制室温并确保试剂回至室温。

2.与我公司联系。

3.更换新批号的试剂盒。

4.试剂开启后尽快用完。

5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。

移液不宜过快，排放应完全。

吸头内壁要清洁，最好一次性使用。

6.准确计时。

7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。

9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。

11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。

10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。

如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。

曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。

11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。

3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。

洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。

12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。

洗涤次数不够及注水量不够。

14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。

15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。

中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。

1、ELISA试验的稳定性问题做ELISA实验时，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5，下午做时就是0.9了，所以都没有办法下结论，为什么会差异这么大呀？（1）多设平行空孔，请别人代劳，以判断究竟是否操作问题（2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边缘，那么在重复的时候，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂，这个就很正常了。

建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上。

2、酶不稳定，有何高招？（1）保存浓度尽量高些，（2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。

（3）加入50%甘油-20度保存、避免反复冻融。

（4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠，其对HRP活性有很大影响）（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应，可以考虑一下酶类的稳定性与保存方法的很大关系。

干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。

液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易降解、变性。

2、一般需加入防腐剂和稳定剂，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。

此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。

3、贮藏温度要求低，避免反复冻融。

3、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？最大的原因是封闭的效果不好，应该调整封闭液；可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度、时间，试试哪个效果好阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢？我做ELISA时，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高，有时候高出0.1个OD，导致实验经常重复，但原因也找不到在哪里？这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。

ELISA实验操作中常见问题分析1 标本及采集、贮运因素严峻溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

血清标本宜在新奇时检测，严峻溶血标本禁用。

一样说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中储存时刻过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。

超过一周测定的需－20℃储存。

冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并幸免产动气泡。

混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

反复冻融会使抗体效价跌落，因此测抗体的血清标本如需储存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

2、试剂的阻碍ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。

由于历史的缘故，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采纳了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏锐度不够，稳固性也成问题。

也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏锐度，科学地对待反应结果。

基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，要紧是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品差不多上采纳了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳固、纯度更高的HCV 特异性抗原。

ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。

2.试剂失效。

3.试剂过失效日期。

4.试剂开启时间过长，污染。

5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。

6.反应时间不足。

7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。

1.控制室温并确保试剂回至室温。

2.与我公司联系。

3.更换新批号的试剂盒。

4.试剂开启后尽快用完。

5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。

移液不宜过快，排放应完全。

吸头内壁要清洁，最好一次性使用。

6.准确计时。

7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。

9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。

11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。

10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。

如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。

曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。

11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。

3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。

洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。

12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。

洗涤次数不够及注水量不够。

14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。

15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。

中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。

ELISA实验可能出现的问题及原因分析1.应该注意试剂4°c冷藏时水化层形成，蛋白分子分布异常；2.标本由于冷藏时Ig G聚合成多聚体，Fib非特异性吸附，反复冻融机械切力致使蛋白分子受损；3.加样时不准，枪头吸样时插入样本液面下2mm为宜；4.常采用的温度有43、37°c、室温、或者4°c等。

37°c最常用，4°c效果最好，但孵育时间有异；5.要注意内源如风湿因子，补体，高浓度非特异性免疫球蛋白，异嗜性抗体及某些自身抗体等；外源如标本溶血，细菌污染，储存时间过长及凝固等因素影响。

6、在使用ELISA试剂盒时应注意：2-8℃保存（特殊情况除外）、同一品种不同批号试剂不能混用、不同品种试剂盒显色剂不能混用。

常见问题及分析1阳性对照不显色漏加阳性对照阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂阳性对照受污染2、阳性对照显色浅（HBeAb HBcAb阴性对照显色浅）试剂和保存不当、活性下降在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育时间不够或孵育温度过低洗板浸泡时间过长、洗板次数过多使用不正确的洗液洗液中含有防腐剂同时残留量过多洗板后酶标板被干透读数时使用波长不正确滤光片不清洁或滤光片位置错误读数时酶标板放置位置错误阳性对照活性下降酶标失活3、阴性对照显色（HBeAb、HBcAB除外）实验过程受污染阴性对照污染酶滴在孔壁上4、整板不显色试剂和保存不当、已经失活忘记加酶、可检查滴瓶内酶量忘记加抗原或中和试剂忘记加显色剂A或显色剂B5、阳性对照读数不正常加入标本后未进行必要的混匀标本稀释错误加样量不正确冷冻标本未完全溶解混匀标本中含有防腐剂6、血清本底高试剂盒灵敏度高加样时使用同一枪头、交叉污染孵育时间过长或温度过高洗板次数不足，浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔洗板机管道中有霉菌生长洗液瓶混用洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染读数时酶标板底部有水蒸气凝结酶标仪偏差7、假阳性结果实验器具被污染血清中出现纤维蛋白凝集血清标本中出现过多的红细胞血浆标本处理不当标本中含有灰尘、颗粒或细菌等标本被反复冻融加标本后进行不正确的振荡沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净混用洗液或洗液稀释错误洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌洗板次数不足或浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔读数时酶标板底部有水蒸气凝结洗液瓶、废液瓶混用读数过程中板孔中有气泡酶标仪偏差8、同一板内重复性差标本混匀不充分试剂混匀不充分标本与酶结合物混匀不充分加样技术差异加样器故障或加样器被污染加样时间过长导致孵育时间不同孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异读数时酶标板孔间有气泡9、HCV血清本底高灵敏度高样本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本10、HIV阳性对照低误将阳性对照稀释阳性对照未混匀加液量不足11、HIV血清本底高标准变更，灵敏度提高标本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本。

ELISA实验中常见问题和注意事项临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。

本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。

当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。

2）标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。

3）血清标本可在2～8℃下保存1周。

如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。

冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。

此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。

ELISA测定中试剂准备在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。

如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。

因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。

其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。

加血清样本及反应试剂血清样本使用微量加样枪加样。

使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点：1）加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。

2）加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。

尽量避免出现气泡。

3）反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。

滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间。

温育的时间与温度温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。

温育温度应在37℃，水浴。

温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。

温育实际测定操作中要注意以下几点：1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。

浅析ELISA中的常见问题ELISA是蛋白定量的金标准，也是免疫学研究中最常用的实验方法之一。

很多人觉得ELISA很简单，其实不然。

ELISA中出现的各种问题，正是很多人对其认识不足而产生的。

今天跟大家分析一下ELISA 实验中的常见问题，希望对大家有所帮助。

一、标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。

标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。

在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。

单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。

二、标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。

推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。

如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。

对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

三、标曲显色，样本不显色遇到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。

任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。

目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。

对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。

因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度最低的S7点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。

而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

需要指出的是，国内某些所谓的高敏ELISA试剂盒，并没有采用信号增强剂的方法，而只是简单地提高了抗体浓度，较普通ELISA其灵敏度的提升有限。

ELISA实验中常见的问题及解决方法如下：
加样误差：包括加样本及试剂量不准、孔间不一致。

解决方法包括校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密；重复某一样品时，加样时间尽可能与上次接近；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。

温育时间或洗板不一致：导致显色底物孵育效果不佳。

解决方法包括检查时间是否一致；校正温育箱温度。

试剂问题：包括显色液变质或者试剂过期、试剂稀释有误，如加酶的浓度过高、蒸馏水受酶等污染。

解决方法包括检查试剂盒有效期；请按说明书所示稀释倍数配制；使用新鲜蒸馏水。

洗板问题：如果没有洗板机，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

封板膜使用不当：在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体时，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。

每次使用后要更换新的封板膜。

未及时读数：加完终止液后，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

以上内容仅供参考，如果无法解决你的问题，建议咨询专业人士获取帮助。

ELISA操作常见问题解决办法ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。

平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。

冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。

注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。

加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

溅出会对邻近孔产生污染。

出现气泡则反应液界面有差异。

所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

ELISA常见问题及处理方法一、概述ELISA试验以灵敏度较高,特异性较好的特点在临床上、兽药残留检测得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致实验失败。

二、样本的处理步骤：采样与样品的制备（样品预处理）提取净化浓缩检测三、样品制备（1）样本采集来后应应注意：1.遵循代表性原则2.除去不可食部分3.防止处理样本时被污染3.如需制成同一样本，应将其混匀后再分次匀将4.匀将后分袋分装(一般用2号自封袋,每袋约30g)5.样品储存在–20℃6.不使用有异味或坏了的样本.四、药物提取用溶剂将待测样品中兽药溶解、分离出来的操作步骤。

根据样本和待测兽药种类，用不同溶剂和方法进行提取。

✶原理：相似相溶。

选择与待测兽药极性相似的溶剂，提取剂沸点应45～80℃，且不能与样本发生作用，毒性低，价格便宜，必须能溶解待测兽药。

对含水量高的样本，一般选与水相混溶的溶剂（乙腈、丙酮等），要求溶剂对样本有较强的渗透能力，以便能将样本中兽药充分提取。

当单一溶剂效果不理想，可选择2种或2种以上不同极性的溶剂，以不同比例配成混合提取剂。

四、提取方法✶①振荡法：将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使容器内的样品与提取溶剂充分接触，以深入到样本组织内部提取待测组分✶振荡方式：✶振荡器上进行上下、往返式振荡。

手摇式上下振荡✶注：1、在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。

②均质法：用均质机对加提取剂的样本快速均质。

特点是快速、简便。

③超声法：样本加入提取剂，以超声波提取。

④索氏提取：提取效果好，但时间长，干扰物多。

多用于动物样本。

⑤快速混匀法：适用于液体样品。

五、净化将样本中待测兽药与干扰杂质分离的步骤。

原则是尽量完全除掉干扰杂质，而又使待测兽药损失尽量少。

但经过提取的待测组分，提取物中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质，这就导致我们在检测过程中出现假阳性。

ELISA操作：Elisa实验结果不理想，应出现的问题总结ELISA操作：Elisa实验结果不理想，应出现的问题总结优化ELISA的重点之一在于洗涤。

洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号，从而增加分析的信噪比。

每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留，在最后一步产生信号。

而不充分的洗涤会导致差异和高背景，从而带来不理想的结果。

在做ELISA实验时，洗板有两种方法：手工法洗板和洗板机洗板。

二者没有本质的差别，只要操作合乎要求，均能得到正确、可靠的结果。

手工洗板手工洗板人为因素比较大，实验人员必须经验丰富，洗涤次数要足够，冲击力又不要太大，加入的洗液量以说明书为准，防止孔口内有游离酶未能洗净，同时防止孔与孔之间液体交叉。

洗涤结束后扣干亦非常重要，否则易造成假阳性。

每次洗完板后，在吸水纸上轻轻拍干，拍板时要垂直，避免交叉感染。

用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离;吸水纸要一次性使用，应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。

酶结合物不耐干燥，特别在较高的温度下更易失活，所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间，时间越长，吸光度值越低。

手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种方法：浸泡式1. 吸干或甩干孔内反应液;2. 用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去);3. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1～2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短;4. 吸干孔内液体。

吸干应，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;5. 重复操作步骤3和4，洗涤3～4次(或按说明规定)。

在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。

聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。

2.将反应板放入恒温箱时，反应板不能叠放，以保证反应板受热均匀，温度能迅速达到平衡。

四、洗板
1.要按照试剂说明书上的说明配制好洗涤液，配制洗涤液用水最好为新鲜的蒸馏水，配制倍数准确。

2.洗板时要按照试剂说明书上的洗涤方法洗涤，不能随意改变洗涤方法，洗涤时间，洗涤次数。

3.不同厂家，不同批次试剂的洗涤液不能混用。

4.配制洗涤液用水的质量很重要，关系试验成败，准确与否，洗涤用水最好用新鲜合格的蒸馏水。

五、OD值测定
显色完成，加终止液后将反应板放入酶标仪检测OD值。

1.在反应结束前应将酶标仪开启，预热10～20 min，仪器放置应
鸡新城疫（New Castle disease）又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由副黏病毒科的新城疫病毒引起的急性高度接触性传染病，传播迅速，对鸡养殖业造成严重危害和巨大的经济损失。

对该病的防治目前没有特别有效的手段，主要通过接种疫苗来进行预防。

最近的研究表明，新城疫的流行表现出一些新的趋势，即在目前普遍采用疫苗免疫的情况下，。

ELISA实验可能出现的问题及原因分析1.应该注意试剂4°c冷藏时水化层形成，蛋白分子分布异常；2.标本由于冷藏时Ig G聚合成多聚体，Fib非特异性吸附，反复冻融机械切力致使蛋白分子受损；3.加样时不准，枪头吸样时插入样本液面下2mm为宜；4.常采用的温度有43、37°c、室温、或者4°c等。

37°c最常用，4°c效果最好，但孵育时间有异；5.要注意内源如风湿因子，补体，高浓度非特异性免疫球蛋白，异嗜性抗体及某些自身抗体等；外源如标本溶血，细菌污染，储存时间过长及凝固等因素影响。

6、在使用ELISA试剂盒时应注意：2-8℃保存（特殊情况除外）、同一品种不同批号试剂不能混用、不同品种试剂盒显色剂不能混用。

常见问题及分析1阳性对照不显色漏加阳性对照阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂阳性对照受污染2、阳性对照显色浅（HBeAb HBcAb阴性对照显色浅）试剂和保存不当、活性下降在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育时间不够或孵育温度过低洗板浸泡时间过长、洗板次数过多使用不正确的洗液洗液中含有防腐剂同时残留量过多洗板后酶标板被干透读数时使用波长不正确滤光片不清洁或滤光片位置错误读数时酶标板放置位置错误阳性对照活性下降酶标失活3、阴性对照显色（HBeAb、HBcAB除外）实验过程受污染阴性对照污染酶滴在孔壁上4、整板不显色试剂和保存不当、已经失活忘记加酶、可检查滴瓶内酶量忘记加抗原或中和试剂忘记加显色剂A或显色剂B5、阳性对照读数不正常加入标本后未进行必要的混匀标本稀释错误加样量不正确冷冻标本未完全溶解混匀标本中含有防腐剂6、血清本底高试剂盒灵敏度高加样时使用同一枪头、交叉污染孵育时间过长或温度过高洗板次数不足，浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔洗板机管道中有霉菌生长洗液瓶混用洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染读数时酶标板底部有水蒸气凝结酶标仪偏差7、假阳性结果实验器具被污染血清中出现纤维蛋白凝集血清标本中出现过多的红细胞血浆标本处理不当标本中含有灰尘、颗粒或细菌等标本被反复冻融加标本后进行不正确的振荡沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净混用洗液或洗液稀释错误洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌洗板次数不足或浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔读数时酶标板底部有水蒸气凝结洗液瓶、废液瓶混用读数过程中板孔中有气泡酶标仪偏差8、同一板内重复性差标本混匀不充分试剂混匀不充分标本与酶结合物混匀不充分加样技术差异加样器故障或加样器被污染加样时间过长导致孵育时间不同孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异读数时酶标板孔间有气泡9、HCV血清本底高灵敏度高样本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本10、HIV阳性对照低误将阳性对照稀释阳性对照未混匀加液量不足11、HIV血清本底高标准变更，灵敏度提高标本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本。

问题可能原因解决方法无颜色试剂孵育的时间没有按说明书操作。

确定生物素化抗体，联接的hrp试剂或链霉亲和素-hrp使用的时间是否适当。

不同试剂盒或不同批号的试剂混用。

重新检查试剂的标签，确保所有组分都属于正使用的试剂盒。

不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

漏加酶检查操作流程，注意不要漏加hrp酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠标准品有问题（若在标本孔中有信号）按说明书检查标准品的配制过程使用1瓶新标准品某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂.漏加显色剂a或b加显色剂后观察孔中液面高度试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。

缓冲液污染配制新鲜的缓冲液显色弱超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。

检查产品的有效期加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确和加入时间是适当。

试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右缩短孵育时间能使实验的信号变弱。

检查孵育的时间。

在温度变化的环境内孵育酶标板。

确定孵育的温度，应避免温度的变化。

使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。

标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。

低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。

样品用nan3防腐,抑制了酶的反应显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。

检测时间不当是否在规定的时间内检测。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

仪器是否设定正确，滤光片的选择是否相符等。

高背景（本底）洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。

最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。

每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。

若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。

板的内侧不应接触设备。

检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。

在两次洗板之间加30秒的浸泡。

ELISA中常见问题及解决方法：ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。

我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。

下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法1 选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。

2 加样可能原因：1)血清或血浆标本分离不好即进行加样；2)手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；3)加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

解决办法：1) 标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。

2) 加样后及时放入孵箱。

3) 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4) 如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。

5) 标本较多时，请分批操作。

3 孵育可能原因：1) 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2) 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

解决办法：1) 贴封片或加盖；2) 按说明步骤严格控制操作时间。

4 洗板可能原因：1) 采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。

2) 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。

3) 反应板过多造成洗板等待时间长。

解决办法：1) 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干；2) 合理安排，或多用几台洗板机。