6 实验六 现代免疫学检测技术：ELISA(ppt 31页)

优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。
——需制备各种酶标抗原或抗体。
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11
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分
为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液
和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检
样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形
成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗
原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色
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2
ELISA的发展概况
自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检 测方法之一。
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5
酶标板
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6
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。

目的：通过室内质控，可以及时发现检 测过程中可能存在的问题，并采取相应 的措施加以纠正，从而提高检测结果的 准确性和可靠性
实施：实验室应建立完善的室内质控体系， 并定期对检测过程进行质控，以确保检测 结果的准确性和可靠性
室间质评计划：制定并执行统一的质评计划，确保各实验室之间的质评活动相互协调
室间质评样品：由权威机构制备和分发统一的质评样品，各实验室使用相同的质评样品进行 检测
试剂质量不稳定：选择高质量的试剂，确保试剂在有效期内使用 试剂盒灵敏度低：调整试剂盒的灵敏度，提高检测的准确性 试剂盒特异性差：选择特异性好的试剂盒，避免交叉反应
试剂盒保存不当：按照试剂盒说明书正确保存试剂盒，避免受潮、污染等影响
自动化技术：提高ELISA检测 效率和质量的关键
智能化技术：实现ELISA检测 的自动化和智能化
通过将抗原或抗体与酶结合形 成酶标抗原或抗体，使其具有 酶的催化作用
酶联 测方法
在固相载体表面进行抗原抗体 反应，加入底物后根据颜色变
化判断结果
酶联免疫吸附试验具有灵敏度 高、特异性强、操作简便、易
于定量等优点
临床诊断：用于检测各种疾病相关的抗原、抗体和细胞因子等 食品安全：检测食品中的微生物、毒素和过敏原等 生物安全：检测实验室中的生物因子和微生物等 环保监测：检测环境中的污染物和有害物质等
ELISA检测技术在临床诊断中的应用：用于疾病早期诊断、疗效评估和预后判断 在科研领域的应用：用于疾病的基础研究和临床试验，提高研究质量和效率 未来发展趋势：随着技术进步和应用拓展，ELISA检测技术将更加便捷、准确和高效 展望：随着医疗科技的发展，ELISA检测技术将在未来发挥更加重要的作用
汇报人：
样本类型：血清、血浆、细胞培养 上清等

ELISA
1
原理
2
方法
3
操作
4
注意事是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活 性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相 载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上 形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶 标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时 固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶 反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标 本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性 或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反 应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
5
双抗原夹心法测抗体
Title in here
5
竞争法检测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去 ，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用竞争法检测特异性抗体。
Title in here
5
竞争法测抗体
Title in here
5
竞争法测抗体
Title in here
5
竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可 作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可 以采用竞争法模式。小分子激素 、 药物等ELISA测定多用此法。
Title in here
5
ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素 (biotin)系统(system)的略语。生物素 与亲和素的结合具有很强的特异性， 其亲和力较抗原抗体反应大得多，两 者一经结合就极为稳定。由于一个亲 和素可与 4个生物素分子结合，因此 如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲 和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素生物素（ABC）法两种类型。两者均

1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备 特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可 检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
2 ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
4 对照设定
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果 的对照。
阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含 蛋白保护剂的缓冲液为基质。
加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物 质的量。
1.1.2 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之 间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1.1.3 最适比例
1.1.4 敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
ELISA的试剂准备A
固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但 空白值也略高。

优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为
谢谢！
xiexie!
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。

总结词
通过间接利用酶标记的抗抗体与待测 样本中的抗原反应。
详细描述
间接ELISA是在固相载体上包被已知 抗原，然后加入酶标记的抗抗体与待 测样本中的抗原反应，再加入底物显 色，达到检测抗原的目的。
夹心ELISA
总结词
通过酶标记的二抗将待测样本中的抗原夹在固相载体和酶标记的抗体之间。
详细描述
夹心ELISA是在固相载体上包被特异性抗体，然后加入待测样本与酶标记的二抗 反应，形成固相抗体-抗原-酶标记抗体的复合物，再加入底物显色，达到检测 抗原的目的。
《elisa检测技术》ppt 课件
目录
• ELISA检测技术概述 • ELISA检测技术的分类 • ELISA检测技术实验步骤 • ELISA检测技术的影响因素 • ELISA检测技术的优缺点 • ELISA检测技术的应用实例
01
ELISA检测技术概述
ELISA检测技术的定义
要点一
酶联免疫吸附分析（EnzymeLinked Immu…
一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的方法将 免疫反应与化学信号放大，实现对目标分子的定量或定性 分析。
要点二
特点
灵敏度高、特异性强、操作简便、适用于大量样本检测。
ELISA检测技术的原理
抗原或抗体与固相载体表 面的抗原或抗体结合，形 成固相复合物；
加入酶标记的抗原或抗体 ，与固相复合物结合；
基因表达研究
通过ELISA检测技术可以检测基因表达产物的含量和活性，了解基因表达的规律和调控机制。
THANKS
感谢观看
显色
01
02
03
显色
加入显色底物，使抗原抗 体复合物呈现颜色反应。
显色底物

拓展ELISA检测技术在生物医学、环境监测 、食品安全等领域的应用，推动相关产业的 发展。
2024/1/28
22
06 ELISA实验操作技巧与注 意事项
2024/1/28
23
实验前准备工作建议
01
仔细阅读试剂盒说明书 ，了解实验原理、操作 步骤和注意事项。
2024/1/28
02
准备好所需的试剂、耗 材和仪器，确保它们的 质量和性能符合要求。
去除异常值、缺失值等， 保证数据质量。
2024/1/28
数据转换
对数据进行对数转换、归 一化等处理，以满足后续 分析需求。
统计分析
采用t检验、方差分析等统 计方法，对实验组和对照 组数据进行比较，评估差 异显著性。
13
结果解读与报告撰写
结果解读
根据统计分析结果，结合专业知 识对实验数据进行解读，如判断 样品中目标物质的含量是否超标
《elisa检测技术》ppt课件
2024/1/28
1
目 录
2024/1/28
• ELISA检测技术概述 • ELISA实验方法与步骤 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术在生物医学领域应用 • ELISA技术挑战与发展趋势 • ELISA实验操作技巧与注意事项
2
01 ELISA检测技术概述
发展多重ELISA检测技术，实现对多个目标物的同时检测，提高检 测效率。
20
新型ELISA技术发展趋势
数字化ELISA
利用微流控、微阵列等技术，实现ELISA检测的数字化、自 动化和智能化。
免疫荧光ELISA
结合免疫荧光技术，提高ELISA检测的灵敏度和特异性。
化学发光ELISA

镜检观察或进行自动化测定
为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪， 酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗 镜检观察或进行自动 按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、48孔或24孔)。 电子显微镜和发光免疫测定仪等 用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。 化测定 荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂
1 PBS/Tween
2 1:100阴性血清
3 1:1,000
4 1:5,000
5 1:10,000 6 1:50,000
阳性血清
7 1:100,000
8 1:500,000
4.4 加酶标抗体:加入HRP-抗体(抗抗体，本实验中已经根据说明书稀释一千 倍)，每孔加l00μL，封板后置37℃温育lh，按上法至少洗涤5次，最后用蒸
Across）。
3 按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数， 打印机输出数据。
4 按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。
酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱
动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗
免疫检测
灵敏度 辣根过氧化物酶：10－20pg
碱性磷酸酶：10－50pg
自动酶标仪（Elx800UV）使用程序
1 开机，进行System self-test…
2 按 “ DEFINE” 键 ， 进 入 “ SELECT ASSAY NUMBER”， 用 “NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay 01 为 quick read，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改测试的 “NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：

洗涤
洗涤在ELISA过 程中虽不是一个 反应步骤，但却 也决定着实验的 成败。
聚苯乙烯等塑料对蛋白 质的吸附是普遍性的而 在洗涤时可清除在反应 过程中非特异性地吸附 于固相载体的干扰物质
洗涤时可清除残留在 板孔中没能与固相抗 原或抗体结合的物质
洗涤方式（浸泡式）
a.
甩干孔内反应液；
b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，
即甩去）；
c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置3分钟，间
歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d. 甩去液体后在吸水纸上拍干；
e.重复操作c和d，洗涤3次。
保 温
1）在ELISA中抗原抗体反应的完成需要 有一定的温度和时间，这一保温过程称
为温育。
2）温育常采用的温度有43℃、37℃、室 温和4℃（冰箱温度）等。 3）保温时为避免蒸发，板上应加盖，也 可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。
• 抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面， 并且保持其免疫活性； • 抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结 合物，同时保持各自的免疫活性和酶活 性； • 酶结合物与相应的抗原或抗体结合后， 能通过加入底物的颜色反应来确定免疫 反应的发生，颜色反应的深浅与标本中 相应抗原或抗体的量成正比。
ELISA 的分类、原理和操作
显色和比色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此 时酶催化无色的底物生成有色的产物。 在定量测定中，加入底物后的反应温度 和时间应按规定力求准确。定性测定的显 色时间一般不需要严格控制及时判断。 比色使用酶标比色仪在405nm波长读数。 若要终止反应，以防反应过度，常用的碱 性磷酸酶反应终止液为1M NaOH,每孔 100ul。

竞争法 原理：通过a组和b组显色的差异，来确定标 本中待测蛋白的量

将特异性抗体与固相载体结合 加入待测抗原与抗体结合
洗涤去除未结合的抗原
双抗体夹心法ELISA原理示意图
01
加入酶标记的二抗与另 一特异性抗体结合，形 成双抗体夹心结构
02
洗涤去除未结合的酶标 二抗
03
加入底物，酶催化底物 生成有色产物
04
通过比色或分光光度法 测定吸光度，计算抗原 含量
04 ELISA实验数据 分析与解读
发展历程
自1971年Engvall和Perlmann首次 报道以来，ELISA技术得到了迅速 发展和广泛应用。
免疫学基础与抗原抗体反应
免疫学基础
免疫系统能够识别和清除外来抗原，维持机体内环境稳定。
抗原抗体反应
抗原与抗体特异性结合形成免疫复合物，引发一系列免疫反应。
ELISA技术分类及应用领域
技术分类
靠性。
数据分析策略及软件工具介绍
描述性统计分析
方差分析（ANOVA）
对数据进行初步的描述性统计分析，如计算 平均值、标准差、变异系数等，以了解数据 的分布和离散程度。
用于比较不同组别之间的差异显著性，如比 较不同浓度标准品或不同处理组之间的吸光 度值差异。
回归分析
软件工具
通过建立数学模型，探究自变量（如标准品 浓度）和因变量（如吸光度值）之间的线性 或非线性关系。
ELISA原理示意图详解ppt 课件
目录
• ELISA基本原理与概述 • ELISA实验步骤与操作规范 • ELISA原理示意图详解 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术应用案例分享 • ELISA技术挑战与发展趋势
01 ELISA基本原理 与概述
ELISA定义及发展历程
定义