土壤磷酸酶测定中不同缓冲溶液对显色液吸收波长的影响

土壤酸性磷酸酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定⑴原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。

⑵测定方法①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.2 mL甲苯和4 mL ph6.5 磷酸缓冲液，再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，摇匀；③而后在2500r/min下离心5min；取上层清夜于10ml 离心管4000r/min下再离心5min.④取上清液在410 nm处比色，并记录吸收光值。

⑶标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。

表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、120.005?mol/mLpNP（mL）0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 0.09 0.10 0.11 0.12H2O（mL）0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.72 0.71 0.70 0.69 0.68pNP的含量（?mol）0、0.00005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006摇匀0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液（mL） 40.5mol/L CaCl2（mL） 10.5mol/L NaOH（mL） 4②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。

土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法）实验试剂:1、pH7。

6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液（三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L 的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。

2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠，加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液，沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml，继续沸水浴处理,直至完全溶解，用同样的缓冲液定容至100ml。

3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0。

01mol/L的CaCl2溶液。

4、0。

6mol/L乙酸铅溶液。

5、草酸钠—乙酸混合溶液：每1000ml0。

26mol/L的草酸钠溶液含有240。

7ml0。

2mol/L的乙酸.6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮，0。

02g 抗坏血酸，溶于100ml无水乙醇。

7、0。

2％KIO3溶液。

8、pH5.8乙酸-乙酸钠缓冲液：94 ml0。

2mol/L乙酸钠与6ml0。

2mol/L乙酸混合.9、0.01%甘氨酸标准溶液：1g甘氨酸溶于1000ml水，再稀释10倍。

10、甲苯。

以上试剂均为分析纯。

实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0。

01％甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0。

213、0。

320、0。

426、0。

533、0.639μg/ml），加入2mlpH5。

8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1。

5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂，混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀，用蒸馏水定容至10ml，1h内在570nm处比色测定吸光值；以氨基氮(NH2）的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线.2、培养与测定①称取0.200g土壤,加入2mlTris—HCl—CaCl2混合溶液和1ml甲苯,混合均匀后静置15min以抑制微生物活性；②然后再加入5ml2%的酪酸钠溶液,50℃振荡培养2h。

土壤酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定1.试剂制备(1)0.115mp-硝基苯磷酸钠溶液取10.67 GP硝基苯磷酸二钠（6H2O，分子量371.1）溶于pH4。

5 5在普通缓冲液中稀释至250ml，在4℃冰箱中保存。

(2)通用缓冲液（ph4.5）（缓冲液久置会有沉淀）储备溶液由以下成分组成：三羟甲基氨基甲烷12.1g顺丁烯二酸11.6g柠檬酸14g硼酸6.3g溶于500ml 1nnaoh（40g定容1L），加入蒸馏水至1L。

取200ml储备溶液，加入0.1nhcl或浓HCl，将pH值调节至4.5。

最后，稀释至1L。

（3）甲苯(4)0.5mol/lcacl2.2h2o溶液：36.75gcacl2。

2H 2O定容500ml（无水CaCl2:11.1g定容200ml）（5）0.5mol/lnaoh 溶液：20gnaoh定容1L 2。

测量步骤取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（ph4.5）、0.25ml甲苯和1ml0.115mp-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml0 5mol/L氯化钙溶液和4ml 0 5mol/LNaOH溶液，用浓滤纸过滤至50ml容量瓶中，用蒸馏水定容后在410nm处比较颜色。

3.计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示，w（mgg-1h-1）=m1/（m×t）式中：M1——标准曲线上发现的样品中对硝基苯酚的质量（mg）；T-反应时间（H）=1hm-样品土壤重量（g）无土壤ck:用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质ck:用1ml蒸馏水代替1mlpnpp。

每个处理做1个。

标准曲线的制备：1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1l，低温保存。

2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加ph6.5通用缓冲液4ml，cacl2.2h2o溶液1ml，naoh溶液4ml，② 混合后，将定量滤纸过滤至50ml容量瓶中。

参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法一、土壤蔗糖酶3，5- 二硝基水杨酸比色法：1、试剂的配制①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

③8%蔗糖溶液。

④甲苯。

⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。

然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。

再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。

标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。

摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。

到时取出，迅速过滤。

从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。

溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖（毫克）=a×4式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数二、土壤淀粉酶3，5- 二硝基水杨酸比色法:1、试剂配制①1%淀粉。

磷酸单酯酶（对硝基苯磷酸盐法）(Tabatabai, 1994)1.原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。

酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。

2.试剂: （1）甲苯。

（2）pH 6.5缓冲溶液：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol ﹒L－1）溶液调至pH6.5，用水定容；或pH 11缓冲溶液：用氢氧化钠（0.1 mol﹒L －1）溶液调至pH11，用水定容。

通用缓冲液：称取12.1g三（羟甲基）氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3g硼酸于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用。

)（4）对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。

（5）0.5 M CaCl2溶液：称取73.5 g CaCl2﹒2H2O溶解于700 mL水中，用水定容到1L。

（6）0.5 mol﹒L－1 NaOH溶液：称取20 g NaOH 溶解于700 mL水中，用水定容到1L。

（7）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0 g 对硝基苯酚于700 ml 水中，稀释至1L，低温保存。

配置工作曲线用的溶液。

将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml三角瓶中（分别含0 mg、0.01 mg、0.02 mg、0.03 mg、0.04 mg、0.05 mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5 ml，再加入1 ml的CaCl2和4 ml 的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400 nm－420 nm条件下比色。

3. 仪器:50mL三角瓶；培养箱；分光光度计4. 步骤:将1.00 g新鲜土样（< 2 mm）放入50mL三角瓶中，加入0.2 mL 甲苯、4 ml的缓冲液和1 ml的对硝基苯磷酸二钠溶液。

土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号:BC0280规格:50T/48S产品简介：土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。

通常按照其最适pH范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。

碱性环境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-AKP/ALP活性。

产品内容：试剂一：液体21mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

用前加50mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。

临用前加1152μL无水乙醇（自备），48μL蒸馏水充分溶解。

（变褐色后不能再使用）标准品：液体1mL×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯（不允许快递）。

操作步骤：催化反应：称取风干混匀土壤约0.1g，加入0.05mL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。

10000rpm室温离心10min，取上清液置于冰上待测。

显色反应：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL试剂一，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A空白管。

显色条件对酸性土壤有效磷测定的影响研究摘要为了探讨应用Bray-Kurtzl法测定有效磷时显色条件对磷标准曲线以及样品有效磷含量的影响，在标线溶液和样品浸提液中加入钼锑抗显色剂后，分别放置于20、25、30 ℃水浴或空气中显色30 min，测定其吸光度。

结果表明：标准曲线溶液在20 ℃和25 ℃的空气和水浴中、30 ℃的空气中均无法完全显色，导致吸光度偏低；在30 ℃水浴中能很好地显色，得到合格的标准曲线。

样品浸提液则对显色条件要求不高，各条件下均能得到相似的结果。

Abstract In order to investigate the effects of the coloration condition on drawing phosphorous standard curves and on determining available phosphorus contents of samples when applying Bray-Kurtzl method，standard solutions and sample extracts were placed under water bath or air conditions at 20 ℃，25 ℃，30 ℃respectively for 30 min after adding Mo-Sb chromogenic agent and then measured. The results showed that in water bath at 20 ℃and 25 ℃，or air conditions at 20 ℃，25 ℃，30 ℃，standard solutions could not react completely，resulting in low absorbance. While in 30 ℃water bath，the standard curve was good. For sample extracts，the coloration condition was not so important，and similar results were obtained under all experiment conditions.Key words acidic soil；available phosphorus；coloration temperature；coloration environment土壤有效磷是土壤中可被植物吸收的磷组分，是土壤肥力的重要指标之一。

土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）一、原理测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。

研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：4~5、6~7、8~10。

因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。

磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠等。

现介绍磷酸苯二钠比色法。

二、试剂1）缓冲液：a. 醋酸盐缓冲液 PH 5.00.2mol/L 醋酸溶液: 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液: 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L。

或者取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L.b. 柠檬酸盐缓冲液 PH 7.00.1mol/L 柠檬酸溶液： 19.2g C6H7O8溶至1L.0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.c. 硼酸盐缓冲液 PH 9.60.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml. 2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 95%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。