第五章 高效毛细管电泳

离模式。
•毛细管凝胶电泳（CGE）：将聚丙烯酰胺在毛细管柱 内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用， 试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰 型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。
• 毛细管胶束电动力学色谱（MECC）：
用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应 用范围。
二、仪器装置
• 电压：0～30KV。
• 分离柱不涂敷任何固定液；
• 紫外或激光诱导荧光检测器（10-19～10-21 mol/L）
三、主要特点和应用
☺高分辨率：理论n高达数百万块，甚至数千万块； ☺高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质； ☺高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分 钟分离19种阳离子；4分钟可分离10种蛋白质； ☺试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样； ☺仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升
第八节
高效毛细管电泳简介
一、基本原理
1、概述
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在 电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷 相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由
于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率
不同可实现分离。
毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细
管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分
流动液。
不足之处： ♣ 进样不够方便。应用范围相对较窄。 ♣ 分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但 电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反， 出峰时间较长。
配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。
电渗流现象：石英玻璃表面存在硅羟基，pH>3时,

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石英表面 负电荷
＋＋ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－
＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － － － － － EOF
－ － － － －
水合阳 离子在 表面积 聚
电场作用下 向负极运动
＋
－ －
电渗流的一个独特性质是其具有平面
流型，推动液体流动的力在毛细管内 均匀分布，平面流型的优点是对谱带 的扩散没有直接作用。
热称为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、 外加电压等影响。 不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引 起区带展宽。温度变化1℃→黏度变化 2%～3% →淌度变化2%～3% 。 进样塞长度——在进样过程中减少样品塞 长度非常重要。对进样长度的限制是低于 毛细管总长度的（1～2）%。例 70cm长 的毛细管，进样量应小于7mm。
溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖
尾 或发生对溶质的完全吸附。对多肽和 蛋白质来说，这种吸附特别严重。可采 用多种方法来减少相互作用： 增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷； 在极端pH值下进行分离，使石英表面 硅羟基以不带电的形式存在； 对毛细管壁进行涂层处理。 电分散作用——样品区带与操作缓冲液 的电导差异可产生峰型畸变。

表面活性剂

在毛细管电泳中常添加表面活性剂， 作为疏水性溶质的增溶剂、与溶质形 成离子对，或作为毛细管内壁的改性 剂等，以改善分离效率。常用表面活 性剂有 ： 阴离子—十二烷基硫酸钠（SDS） 阳离子---十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB） 两性离子---N,N’二甲基胺-3-丙烷-1磺酸
化合物 HCl NaCl 甘氨酸 柠檬酸 细胞色素C 人血红蛋白 烟草花叶病毒
扩散系数D 3.05 1.48 1.06 0.66 0.11 0.069 0.0046

CGE在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广 阔的应用。在分子生物学上实现了包括寡聚核 苷酸纯化、DNA测序和PCR产物的分析，在蛋 白质化学方面用于多肽和蛋白质分子的分子量 测定，原蛋白和结合蛋白的分离等。此外， CGE还可用于其它带电物质的分离，并可通过 加入手性试剂、离子对试剂、络合试剂等添加 剂改变分离的选择性。
离子色谱的固定相是离子交换树 脂。在固定相的表面，分布着许多适 合于分离阴离子的活性中心（如：
+ − — N(CH3 )3 OH，或适合于分离阳离子
的活性中心（如： SO− H+ ）。当被测 — 3 定的混合离子随流动相（淋洗液）流 经固定相时，由于不同离子的电荷数
或离子半径不同，使它与固定相的作 用力大小不同，造成各种离子在相对 运动的两相之间的分配系数不同，因 此，它们在柱中的迁移速度也就不同， 从而达到分离的目的。
图 毛细管分离示意图
在HPCE中电渗流的一个重要特点是具有 平面流型，电渗的驱动力沿毛细管均匀分 布，它使整个流体象一个塞子一样以均匀 的速度向前运动。而在HPLC中流体流型 则是抛物线型的层流，其中心处速度是平 均速度的2倍。
电渗流的平面流型和HPLC中高压泵驱动 所产生的抛物线型层流的速度曲线不同， 不会直接引起样品组分区带在柱内扩张， 这是HPCE获得高效分离的重要原因之一。
3．毛细管凝胶电泳（capillary gel ．毛细管凝胶电泳（ electrophoresis，CGE） ， ）
CGE是80年代后期发展起来的毛细管电泳 的主要分离模式之一，它将凝胶电泳对生 物大分子的高效分离能力和毛细管电泳的 快速、微量和定量分析相结合，成为当今 分离度极高的一种电泳分离技术。
毛细管电泳一般由一个高压电源，一 根毛细管，一个检测器及两个缓冲液 贮液槽及数据记录系统组成，其仪器 结构示意图如图

第五章高效毛细管电泳分离技术第一节毛细管电泳技术发展简史及其特点电泳是指带电粒子在电场作用下向电性相反的方向迁移的现象。

据此对某些化学或生物化学组分进行分离的技术称为电泳技术。

从1930年瑞典科学家Arne Tiselius首次提出电泳法至今已有70年的历史。

电泳法的发展大致可分为三个阶段。

1950年以前属初创阶段，主要是界面移动自由电泳，一般在U型管内进行，无支持物。

50年代至80年代中期出现了各种有支持物的电泳方法，如纸电泳、醋酸纤维电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，70年代后实现了仪器的自动化。

80年代后期出现了毛细管电泳方法，实现了微型化、自动化、高效、快速分析，毛细管电泳技术已经成为同现代色谱技术相比的分析化学领域中的一个令人瞩目的分支。

毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）或高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）是指以毛细管为分离室、以高压电场为驱动力的一类新型现代电泳技术。

毛细管电泳仪的基本结构见图5-1。

HV（0-+30KV）图1 毛细管电泳仪的结构图C—毛细管；D—检测器；E—电极槽；HV—直流高压电源；Pt—铂电极；S—样品；DA—数据采集处理系统完善的毛细管电泳仪应具备（1）有多种施压模式；（2）恒温精度高，恒温范围宽；（3）精确的进样控制；（4）检测器的灵敏度高等条件。

毛细管电泳分离技术用的是内径为5-100μm，外径为370μm，长为10-100cm的弹性熔融石英毛细管，毛细管的特点是（1）体积小；（2）散热快，可承受高电场；（3）可使用自由溶液、凝胶等为支持电解质，在溶液介质下可产生平面形状的电渗流。

毛细管电泳分离技术与传统的平板电泳和现代液相色谱分离技术相比具有很多优点：（1）高效（105-107理论塔板/米）；（2）快速（几十秒至几十分钟）；（3）分离模式多，选择自由度大；（4）分析对象广，从无机离子到整个细胞；（5）高度自动化；（6）样品需量小，运行成本低，无环境污染。