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细菌耐药性检测方法 Prepared on 22 November 2020细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml 的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
![医学微生物学[第十三章性传播的病原微生物]山东大学期末考试知识点复习](https://uimg.taocdn.com/f9249ebd65ce050876321362.webp)
第十三章性传播的病原微生物学习纲要性传播疾病(sexually transmitted disease，STD)：通过性行为引起流行的传染病，简称性病。
引起性病的病原微生物有许多种，包括细菌、病毒、衣原体、支原体、螺旋体、真菌、原虫等。
我国当前发病最多的性病主要有由淋病奈瑟菌引起的淋病。
(一)淋病奈瑟菌1．生物学性状(1)形态与染色：菌体肾形，排列似一对咖啡豆，革兰染色阴性。
有荚膜和菌毛，无鞭毛，无芽孢。
(2)培养特性：营养要求高，常用巧克力(色)血琼脂培养基。
菌落凸起，圆形、灰白色或半透明、光滑。
(3)生化反应：只分解葡萄糖，产酸不产气，氧化酶试验阳性。
(4)抗原结构与分类：外膜蛋白可分为P I、PⅡ和PⅢ三种。
P I为主要外膜蛋白，是淋病奈瑟菌分型的主要基础。
PⅡ蛋白，主要功能是使细菌彼此黏附在一起或黏附于宿主细胞上，并参与营养物质的摄取。
脂多糖具有很强的致热毒性，与致病性及免疫性有关。
菌毛蛋白抗原存在于有毒株。
(5)抵抗力：不耐热和寒冷，对消毒剂敏感。
易产生耐药性。
2．致病性和免疫性(1)致病物质：主要是菌毛、荚膜、外膜蛋白，以及内毒素和IgAl蛋白酶。
IgAl蛋白酶破坏黏膜表面存在的特异性IgAl，有利于淋病奈瑟菌黏附。
PI可直接插入中性粒细胞的膜上，导致膜损伤。
菌毛和荚膜具有抗吞噬作用。
(2)所致疾病：人是淋病奈瑟菌的唯一宿主。
主要引起人类泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性感染。
儿童淋病包括：幼儿淋菌性阴道炎、新生儿淋菌性结膜炎。
(3)免疫性：人类对淋菌缺乏天然抵抗力。
3．微生物学检查方法用棉拭蘸取泌尿生殖道脓性分泌物直接涂片镜检；症状轻或无症状的患者均应作淋病奈瑟菌分离培养及鉴定；PCR检测核酸；还可做免疫酶试验和直接免疫荧光试验。
4．防治原则目前尚无淋病疫苗；预防淋病主要措施是使用安全套；婴儿出生时，不论母亲有无淋病，都应以l％硝酸银或其他银盐溶液滴眼，以预防新生儿淋菌性眼炎的发生。
【论著】ＰＩＢ基因点突变与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药相关性的研究孙爱华（浙江医学高等专科学校，杭州３１００５３）［摘要］目的：了解浙江地区分离的淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素的耐药率及该菌ＰＩＢ基因Ｇ１２０和Ａ１２１点突变与青霉素和四环素耐药性的关系。
方法：采用高保真ＰＣＲ扩增２５株淋病奈瑟菌ＰＩＢ基因序列，Ｔ—Ａ克隆后测序。
分析测序菌株ＰＩＢ基因中与耐药性密切相关的Ｇ１２０和Ａ１２１变异情况，采用二倍琼脂稀释法确定ＰＩＢ菌株的耐药性。
结果：２５株淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素均耐药，耐药率为１００％。
经测序的２５株ＰＩＢ淋病奈瑟菌中，１株（４．Ｏ％）Ｇ１２０或Ａ１２１均未突变，其对青霉素和四环素的ＭＩＣ分别为８¨ｇ／ｍｌ和４斗ｇ／ＩＩｌｌ。
５株（２０．０％）Ｇ１２０Ｄ／Ｎ突变而Ａ１２１不变，１株（４．０％）Ｇ１２０不变而Ａ１２１Ｇ突变，２株（８．Ｏ％）Ｇ１２０Ｎ突变但Ａ１２１缺失，１６株（６４．０％）Ｇ１２０Ｋ和Ａ１２１Ｄ双位点突变。
２４株Ｇ１２０和／或Ａ１２１突变的ＰＩＢ菌株均对青霉素和四环素的ＭＩＣ为４～１２８Ｉｘｇ／ｍｌ不等。
结论：浙江地区分离的ＰＩＢ型淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药率为１００％。
上述淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药与ＰＩＢ基因氨基酸序列Ｇ１２０和／或Ａ１２１突变密切相关。
［关键词］淋病奈瑟茵；青霉素／四环素；耐药性；ＰＩＢ基因；点突变［中圈分类号］Ｒ７５９．２［文献标识码］Ａ［文章绵号】１００４—８６８５（２００７）１２—２１５９—０３ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｉｎＩＢｇｅｎｅＳｕｎＡｉ—ｈｕａ（ＺｈｅｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５３，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇａｎｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔ１１ｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎＧ１２０ｏｒ／ａｎｄＡ１２１ｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌＰＩＢｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＰＩＢｇｅｎｅｓｏｆ２５Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒＴ—Ａｃｌｏｎｉｎｇ．ＴｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓＧ１２０ａｎｄＡ１２１ｔｈａｔｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄＰＩＢｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ａｎｄｔｈｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇｄｏｕｂｌｉｎｇａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｌｌｔｈｅ２５ｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ，１ｓｔｒａｉｎ（４．０％）ｈａｄｎｏａｎｙｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｈｅＧ１２０ａｎｄＡ１２１ｓｉｔｅｓａｎｄｉｔ’ＳＭＩＣｏｆｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｗａｓ８斗ｇ／ｍｌａｎｄ４Ｉｘｇ／ｍｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｗｈｉｌｅ５ｓｔｒａｉｎｓ（２０．０％）ｓｈｏｗｅｄＧ１２０Ｄ／ＮｏｒＡ１２１Ｇｍｕｔａｔｉｏｎ，１ｓｔｒａｉｎｏｎｌｙＡ１２１Ｇ，２ｓｔｒａｉｎｓＧ１２０ＮａｎｄＡ１２１ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ａｎｄ１６ｓｔｒａｉｎｓ（６４．Ｏ％）ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｄｏｕｂｌｅｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎ．ＭＩＣｏｆ２４ＰＩＢｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈＧ１２０ａｎｄ／ｏｒＡ１２１ｍｕｔａｔｉｏｎｒａｎｇｅｗａｓＭＩＣ４～１２８斗ｇ／ｍ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｒａｔｅｏｆｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇａｒｅａｉｓ１００％ａｎｄｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｉｓｃｌｏｓｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＧ１２０ａｎｄＡ１２１ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＰＩＢｇｅｎｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ；Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＰＩＢｇｅｎｅ；Ｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎ从１９４５年到１９８８年，青霉素一直作为淋病治疗的首选药物，然而随着淋病奈瑟菌临床菌株耐药性的增加，青霉素治疗淋病的疗效不断下降导致青霉素不再是治疗淋病奈瑟菌感染的一线抗生素。
菌科细菌产生，由质粒介导，从ＴＥＭ一１，ＴＥＭ一２和ＳＨＶ一１突变而来。
临床对Ｇ内酰胺类药物耐药（包括青霉素类、头孢菌素类和氨曲南），对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感，体外对酶抑制剂敏感。
在国内由于大量应用头孢噻肟，极易选筛出ＣＴＸ—Ｍ型的ＥＳＢＬｓ。
ＣＴＸ—Ｍ型ＥＳＢＬｓ属于ＡｍｂｌｅｒＡ类酶中Ｋ１一ｌｉｋｅ酶，其特点是对头孢噻肟耐药，对头孢他啶敏感［４］。
由于ＥＳＢＬｓ由质粒介导，可在菌株中传播，极易在病房内爆发流行，给临床抗菌治疗带来极大的困难。
在分离的革兰阳性球菌中，对万古霉素耐药率最低，其次为利福平，而对青霉素、红霉素、克林霉素和复方磺胺甲嗯唑的耐药率比较高。
链球菌属对青霉素的耐药率低于葡萄球菌。
２５株凝固酶阴性葡萄球菌和金葡菌中，检出耐苯唑西林的葡萄球菌（ＭＲＳ）分别为５６．２％和２２．２％。
ＭＲＳ对苯唑西林的耐药机制是由于染色体介导的青霉素结合蛋白（ＰＢＰ）２ａ所致，导致对所有Ｊ３内酰胺类抗生素的亲和力下降。
总之，为了延缓细菌耐药性的产生，控制耐药菌株的播散和流行，医院应加强综合管理，定期监测细菌的耐药趋势，合理使用抗菌药物。
参考文献［２］［３］［４］张卓然，倪语星，洪秀华，等．临床微生物学和微生物检验［Ｍ］．第３版．北京：人民卫生出版社，２００３．李景云，马越，张力，等．临床５２家医院常见分离菌株的药物敏感性监测［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００６，２９（５）；４５２—４５３．褚海青，李惠萍，何国钧．铜绿假单胞菌的耐药机制［Ｊ］．中国抗感染化疗杂志，２０（）３，３（１）：５４—５７．倪语星，王金良，徐英春，等．抗微生物药物敏感性试验规范［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，２００２．收稿日期：２（）０６—１１—１４广州地区淋病奈瑟菌耐药性分析吴兴中，郑和平，黄进梅，曾维英，潘慧清，李美玲，薛耀华・实验研究・摘要：目的监测广州地区２００５年分离的淋病奈瑟菌对青霉素、四环素、大观霉素、头孢曲松和环丙沙星的耐药性，分析耐药菌株的流行特点。
巾国皮肤性病学杂志２００６年１月第２０卷第１期ＣｈｉｎＪＤｅｒｍＶｅｎｅｒｅｏｌ，Ｊａｎ．２００６，Ｖ０１．２０，Ｎｏ．１・论著・＜基础研究＞淋病奈瑟菌ｍｔｒＲ基因启动子区的ＩＲ区碱基缺失与其耐药性关系的研究张丽霞，涂亚庭，林能兴，黄长征，陈宏翔，陶娟，林云［摘要］目的探索淋病奈瑟菌（ＮＧ，简称淋球菌）多传递耐药系统Ｒ基因（ｍｔｒＲ）启动子区反向重复序列（ＩＲ）区基因缺失与淋病奈瑟茵染色体所介导的耐药性的关系。
方法以琼脂稀释法做药物敏感试验，选择一临床敏感株采用自身配对法以次抑菌浓度法诱导筛选出对不同抗生素耐药的淋球菌株，以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增包含ＩＲ区在内的目的基因后，对扩增产物测序，并将其ＩＲ区基因突变与临床分离自然耐药株比较。
结果８株敏感株及２４株单独耐１种药物菌株及１株诱导的多重耐药株无ＩＲ区基因突变，７株诱导多重耐药菌株ＩＲ区有碱基Ａ／Ｔ缺失，与自然多重耐药株两者相比较碱基缺失无差异。
结论淋球菌染色体ＩＲ区基因缺失与单独耐一种药物菌株产生无关，ＩＲ区基因缺失参与了淋球菌多重耐药株的产生，人工诱导的多重耐药株与自然多重耐药株ＩＲ区碱基突变无差异。
［关键词］淋病奈瑟茵；基因突变；反向重复序列；微生物敏感性试验［中图分类号］Ｒ３７８．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００１—７０８９（２００６）０１—０００１—０３ＳｔｕｄｙｏｆＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐＢｅｔｗｅｅｎＩＲＧｅｎｅＤｅｌｅｔｉｏｎｉｎＴｈｅｍｔｒＲＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒａｎｄＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａＧｏｎ－ｏｒｒｈｏｅａｅＺＨＡＮＧＬｉ—ｘｉａ，ＴＵＹａ—ｔｉｎｇ，ＬＩＮＮｅｎｇ—ｘｉｎｇ，ｅｔａｌ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＸｉｅｈｅＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｔ才ｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｗｕｈａｎ４３００２２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＩＲ’ＳｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆｍｔｒＲｇｅｎｅａｎｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔ—ａｎｃｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａＧｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙａｇａｒｏｓｅ—ｄｉｌｕｔｉｏｎ—ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒ－ｅｎｔａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈｓｕｂｏｒｄｉｎａｔｅｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｓＭＩＣ）ｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃｉｓｏｌａｔｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｙｓｔｅｍ’Ｓ（ｍｔｒ）ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＲ）ｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．ＲｅｓｕｌｔｓＥｉｇｈｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅｏｒｔｗｅｎｔｙ—ｆｏｕｒｓｉｎｇｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｔｏｒｏｎｅｍｕｈｉｐｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｈａｄｎｏｂａｓｅｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎＩＲｇｅｎｅｂｕｔｓｅｖｅｎｉｎｄｕｃｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｈａｄａｓｉｎ—ｇｌｅｂａｓｅｄｅｌｅｔｉｏｎ（Ｔ／Ａ），ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＩＲｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈｏｓｅｏｆｃｌｉｎｉｃｏｎｅｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｒｅｉｓｎｏｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＩＲｇｅｎｅａｎｄｓｉｎｇｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮＧ，ａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｎｏｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＩＲｇｅｎｅｏｆｃｌｉｎｉｃｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈａｔｏｆｉｎｄｕｃｅｄｏｎｅ，ｂｕｔｓｉｎｇｌｅ—ｂａｓｅｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆＩＲｇｅｎｅｍｉｇｈｔｒｅｓｕｌｔｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓ目前的研究认为淋病奈瑟菌（ＮＧ，简称淋球菌）多重耐药性的产生主要与其染色体基因的多传递耐药系统（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｙｓｔｅｍ，ｍｔｒ）有关，其主要机制有两个，一是ｍｔｒ系统的ｍｔｒＲ基因发生突变导致细胞外膜蛋白ｍｔｒＣＤＥ表达增多，细胞外排能力增加；二是ｍｔｒＲ基因启动子区域反向重复序列（ｉｎ－ｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＩＲ）调控ｍｔｒＲ基因的转录和表达，进而引起淋球菌耐药性的变化…。
四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA）为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1.菌种鉴定：PCR-测序和PCR-DNA探针杂交;缩短检测时间2.确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，判断病情，监测疗效3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状4.细菌耐药监测和分子流行病学调查：随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1.致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3.肿瘤相关基因单基因病 1.致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。
2.致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2.疾病诊断和遗传咨询3.多基因病的研究4.器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。
分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。
重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI)3.日本国立遗传研究所（DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。
蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等。
蛋白质数据库常用的有SWISS-PROT、 PIR、 PDB数据库。
淋病奈瑟菌的研究现状淋病(gonorrhea)是由淋病奈瑟菌，简称淋病奈瑟菌引起的经典性病之一。
人类是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通过性接触而传播。
感染淋病奈瑟菌之后，患者发生泌尿生殖系统的损害，表现为尿道炎和宫颈炎，以及附睾炎、盆腔炎等并发症，女性患者还可由于并发症造成不育、富外孕等严重后果。
淋病常见，在世界范围内广为流行；据近年来世界卫生组织估计，全世界每年约有6200万新病例发生，其中以欧美和非洲一些国家尤甚。
发病与病人因素，诸如年龄、性别、种族、受教育程度、性行为方式及免疫力有关，并随地区和季节的不同会有所变化。
关键词：淋病奈瑟菌、耐药、淋病奈瑟菌PI蛋白、检测方法1.淋病奈瑟菌的感染淋病奈瑟菌主要侵犯粘膜，尤其对单层柱状上皮和移行上皮细胞有很强的亲和力，淋病奈瑟菌侵入前尿道或子宫颈后，借助菌毛、外膜蛋白粘附到柱状上皮细胞表面进行繁殖，之后被柱状上皮细胞吞饮，进入细胞内大量繁殖，导致细胞损伤裂解。
淋病奈瑟菌在逸入粘膜下层，通过内毒素与补体、IgM等协同作用，诱导中性粒细胞聚集吞噬，引起局部急性炎症，出现充血、水肿、粘膜糜烂和尿痛，形成典型尿道脓性分泌物。
当细菌进入尿道腺体和隐窝后，腺管开口及隐窝被阻塞，潜藏的细菌可引起慢性淋病。
2.淋病奈瑟菌PI蛋白目前已知的淋球菌表面抗原有PI(Porin，Por，主要外膜蛋白)，PII(0pa，热修饰蛋白)，PIII(还原反应可修饰蛋白、或浓度相关蛋白)等外膜蛋白，及菌毛蛋白和LPS(脂多糖)、LOS(脂寡糖)，均能诱导相关的特异性体液免疫和细胞免疫。
在这几种抗原中，PI是外膜蛋白中含量最高的蛋白成分，约占60％，且仅有中等程度的抗原变异。
抗PI抗体具有杀菌作用，故而PI抗原最有可能用于制备成功的淋病疫苗，这使其成为目前这一领域的研究热点。
PI 蛋白是淋球菌主要外膜蛋白，它是液态的跨膜蛋白通道，以利于某些离子和大分子通过外膜屏障。
PI蛋白在淋球菌感染致病过程中也起重要作用，因为体外试验显示它能从淋球菌外膜贯穿入中性粒细胞膜，该过程在体内淋球菌粘附至上皮细胞表面中可能起了关键性的作用。
临床分子生物学检验技术模拟题及答案一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、5'-末端的 DNA 探针标记主要依靠的酶是A、T4多聚核苷酸激酶B、末端转移酶C、AKPD、DNA pollE、DNA pol正确答案：A2、氟喹诺酮类药物主要作用靶位是A、糖基转移酶B、DNA 旋转酶C、泵蛋白D、吡嗪酰胺酶E、DNA依赖RNA聚合酶正确答案：B3、第三代测序技术的最主要特征是A、对单分子 DNA 进行非 PCR的测序B、针对SNP进行非 PCR的测序C、高通量和并行 PCR测序D、直接分析SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP研究正确答案：A4、连接酶链反应正确的是A、不能用来检测 DNA 点突变B、DNA连接酶代替DNA 聚合酶C、不需预知靶DNA 的序列D、引物在模板上的位置不能紧密相连E、属于靶序列扩增正确答案：B5、以下哪种检测技术不属于DNA分析A、基因芯片B、ASO杂交C、Northern blotD、RFLP分析E、PCR正确答案：C6、bDNA 扩增是一种A、依赖PCR 扩增B、只能用于扩增DNAC、RNA模板需预先逆转录为cDNAD、基于分支探针的核酸杂交信号放大检测技术E、需要对标本进行抽提纯化正确答案：D7、非整倍体形成的原因可以是A、双雌受精B、核内复制C、染色体不分离D、双雄受精E、核内有丝分裂正确答案：C8、基因多态性连锁分析中，第一、二、三代遗传标记分别是A、VNTR、STR、SSCPB、VNTR、SNP、STRC、VNTR、STR、SNPD、VNTR、SCCP、SNPE、VNTR、STR、RTLP正确答案：B9、最早应用于HLA基因分型的方法是A、RFLP分型技术B、PCR-SSCP 技术C、测序技术D、PCR-SSO技术E、PCR-SSP技术正确答案：A10、先天性卵巢发育不全(Turner综合征)的最常见核型是A、47, XXXB、45,XC、46,YYD、47, XXYE、47, XYY正确答案：B11、下列属于核苷酸三联体重复序列发生高度重复所致的是A、珠蛋白生成障碍性贫血B、血友病C、迪谢内肌营养不良D、镰状细胞贫血E、脆性X综合征正确答案：E12、PCR-RFLP 技术分析 mtDNA A3243G 突变,用ApaI酶切后电泳会观察到几条条带A、1条B、2条C、3条D、4条E、5条正确答案：C13、关于DNA 变性的描述不正确的是A、二级结构破坏B、一级结构破坏C、黏度降低D、生物活性丧失E、浮力密度增加正确答案：B14、关于梅毒螺旋体的描述错误的是A、不会对胎儿产生影响B、梅毒螺旋体属于苍白密螺旋体的苍白亚种C、主要通过性接触、输血、胎盘或产道等途径感染人体D、梅毒螺旋体是梅毒的病原体E、可侵犯皮肤黏膜、内脏器官，导致心血管及中枢神经系统损害正确答案：A15、以下不符合沙眼衣原体基因组结构特征的是A、CT染色体为一闭合环状双链DNAB、CT有一个隐蔽性质粒，此质粒与其他生物间没有同源序列C、DNA 修复能力较弱D、CT原体和网状体内皆含有DNA和RNA两种核酸E、G+C含量小于A+T正确答案：C16、SYBR Green I技术常要求扩增片段不大于A、50bpB、100bpC、200bpD、300bpE、400bp正确答案：D17、关于多重PCR，错误的是A、在同一反应体系中加入多对引物B、同时扩增一份 DNA样品的靶 DNAC、扩增的产物为序列相同的DNA片段D、扩增时应注意各对引物之间的扩增效率基本一致E、扩增产物可以通过电泳分离正确答案：C18、DNA指纹分子的遗传性基础是A、连锁不平衡B、MHC的多样性C、DNA的多态性D、反向重复序列E、MHC的限制性正确答案：C19、异种移植的首要障碍是A、人畜共患病B、供器官来源的选择C、超急性排斥反应D、器官大小和功能的匹配E、伦理道德问题正确答案：C20、Down综合征是A、单基因病B、染色体病C、体细胞病D、多基因病E、线粒体病正确答案：B21、用于肺炎支原体DNA 检测的痰液标本应悬浮于A、1mol/L NaOHB、1mol/L HCLC、变性剂D、酒精E、生理盐水正确答案：E22、以下符合新生隐球菌基因组结构特征的是A、目前全球范围内的新生隐球菌分为8种主要的基因型B、新生隐球菌为二倍体，有14条染色体C、不同基因型菌株间遗传相似度很高D、同一基因型菌株间存在较大的遗传变异E、新生隐球菌主要基因型的致病特点相似正确答案：A23、细菌感染分子生物学检验的检验对象是A、测定血清中蛋白酶活性B、测定样本中核酸含量C、镜检病原体形态D、测定血清中病原体蛋白含量E、测定血清中抗原抗体正确答案：B24、理想的质控品应具备的条件不包括A、靶值或预期结果已知B、基质与待测样本一致C、阳性质控品所含待测物浓度接近试验的决定性水平D、稳定、价廉、同一批次可大量获得E、含有未灭活的传染性病原体正确答案：E25、DNA探针的长度通常为A、1000~2000个碱基B、500~1000个碱基C、400~500个碱基D、100~400个碱基E、<100个碱基正确答案：C26、在多维液相分离技术中最常与其他色谱联合应用的是A、离子交换色谱B、反向色谱C、亲和色谱D、分子排阻色谱E、色谱聚焦正确答案：B27、美国国立生物信息中心是A、NCBIB、EMBLC、SWISS-PROTD、PDBE、NIG正确答案：A28、多基因家族的特点描述错误的是A、由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因B、通常由于突变而失活C、假基因与有功能的基因是同源的D、所有成员均产生有功能的基因产物E、可以位于同一条染色体上正确答案：D29、CYP450酶在哪个组织表达量最多A、心脏B、肝脏C、肾脏D、肺部正确答案：B30、检测靶分子是RNA的技术是A、Southern 印迹杂交B、Western 印迹杂交C、Northern印迹杂交D、Eastern 印迹杂交E、杂交淋巴瘤正确答案：C31、提取DNA的原则除外A、保证核酸一级结构完整性B、保留所有核酸分子C、核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子D、蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度E、排除RNA分子的污染与干扰正确答案：B32、线粒体病分子生物学检验标志物不包括A、重复序列B、点突变位点C、缺失或插入片段D、线粒体单体型E、SNP位点正确答案：A33、下列不能被列入可移动基因范畴的是A、插入序列B、质粒C、染色体DNAD、转座子E、可转座噬菌体正确答案：C34、mtDNA中基因数目为A、39个B、27个C、22个E、13个正确答案：D35、Alu家族属于A、可变数目串联重复序列B、短串联重复序列C、长散在核元件D、短散在核元件E、DNA 转座子正确答案：D36、镰状细胞贫血患者，代替其血红蛋白β链N端第六个氨基酸残基谷氨酸的是A、酪氨酸B、丝氨酸C、缬氨酸D、丙氨酸E、苯丙氨酸正确答案：C37、以下哪种典型疾病的患者以性发育幼稚、身材矮小、肘外翻为特征A、Edward综合征B、Down综合征C、猫叫综合征D、Turner综合征E、Klinefelter综合征正确答案：D38、DNA芯片的固相载体不可以用A、半导体硅片B、玻璃片C、滤纸D、硝酸纤维素膜E、尼龙膜正确答案：C39、扩增产物为 RNA的技术是A、PCRB、逆转录 PCRC、TSAD、巢式PCRE、多重PCR正确答案：C40、不能作为 PCR模板的是A、DNAB、RNAC、质粒DNAD、蛋白质E、cDNA正确答案：D41、荧光定量PCR反应中,Mg²⁺的浓度对Taq酶的活性是至关重要,以DNA 或cDNA 为模板的 PCR反应中最好的Mg²⁺浓度是A、0.2~0.5mMB、1~2mMC、2~5mMD、6~8mME、0.5~2mM正确答案：C42、在对病原体检测中，一次性获得信息量最大的技术是A、ELISAB、荧光定量 PCR技术C、PCR-RFLP技术D、原位杂交技术E、基因芯片技术正确答案：E43、关于电转移下列描述不正确的是A、快速、高效B、需要特殊设备C、缓冲液用TAE或TBED、可产生高温E、常用NC膜作为支持介质正确答案：E44、肽质量指纹图谱常与哪一种质谱技术联合应用A、TOFB、ESIC、ESI-MSD、MALDIE、FAB正确答案：D45、单核苷酸多态性检测芯片探针的设计不正确的是A、一般采用等长移位设计法B、包括与靶序列完全匹配的野生型探针C、三种不同的单碱基变化的核苷酸探针D、靶序列与探针完全匹配的杂交点显示较弱的荧光信号E、可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描正确答案：D46、转录依赖扩增系统的描述错误的是A、以RNA为模板B、首先由靶RNA 合成DNA拷贝C、再由DNA 转录生成大量RNA 拷贝D、产物为DNAE、为等温扩增正确答案：D47、对于寡核苷酸探针，杂交温度一般低于其Tm值A、20~30℃B、10~15℃C、30~40℃D、15~30℃E、5℃正确答案：E48、结核杆菌耐氟喹诺酮类药物的分子机制是A、ropB基因突变B、rpsL基因突变C、katG基因突变D、gyrA基因突变E、embB基因突变正确答案：D49、遗传物质的突变不会导致下列哪些遗传事件A、遗传(基因)多态性B、遗传病C、等位基因D、新性状或表型的产生E、SNP正确答案：C50、关于定量PCR的描述，不正确的是A、可以定量或半定量检测PCR产物的方法B、定量PCR主要进行基因表达的分析和病原体的核酸检测C、水解探针技术中 TaqMan探针的位置位于两条引物之间D、分子信标在自由状态下为发夹结构，荧光信号极低E、定量PCR在封闭状态下进行，有效避免了产物的实验室污染正确答案：A51、在核酸检测体系中加入内质控，其作用不是监控的是A、标本中抑制物或干扰物所致的假阴性B、仪器故障如扩增仪孔间温度差异所致的假阴性C、核酸提取效率太低所致的假阴性D、样本吸取错误所致的假阴性E、试剂失效或Taq酶活性降低所致的假阴性正确答案：D52、下列关于淋病奈瑟菌的分子生物学检测正确的是A、以胞嘧啶 DNA 甲基转移酶基因为扩增靶序列，是早期应用于 PCR的靶点之一，敏感性较高，但是存在假阳性结果B、cppB基因在某些淋病奈瑟菌株中拷贝数较高，可导致假阳性C、omp3和opa基因相对于其他靶基因位点发生重组的频率较高D、以PorA假基因为靶基因扩增敏感度和特异性较低E、采用多个靶基因进行PCR检测可提高敏感性正确答案：E53、以下哪种疾病以身材高、睾丸小、第二性征发育差、不育为特征A、Edward综合征B、Down综合征C、猫叫综合征D、Turner综合征E、Klinefelter综合征正确答案：E54、关于核酸数据库叙述正确的A、主要包含于 GenBank、EMBL和DDBJ三大生物信息数据库B、各个数据库对核酸序列均采用了不同的记录格式C、三大数据库每周进行数据交换以达到数据更新一致D、用户通过特定的申请后可免费获取数据库中的核酸序列信息E、GenBank包含部分已知的核酸序列和部分蛋白质序列正确答案：A55、数字 PCR技术与荧光定量PCR的区别主要在于A、数字 PCR依赖Ct值,而荧光定量PCR不依赖Ct值B、荧光定量PCR是一种绝对定量，而数字PCR是一种相对定量C、数字PCR一般包括 PCR扩增和荧光信号分析两部分，而荧光定量PCR 不是D、荧光定量PCR一般包括PCR扩增和荧光信号分析两部分，而数字 PCR 不是E、荧光定量 PCR是一种相对定量，而数字 PCR是一种绝对定量正确答案：E56、TPMT在哪类药物的体内代谢中起着重要作用A、嘧啶类B、氨基糖苷类C、头孢类D、嘌呤类E、β内酰胺类正确答案：D57、NSCLC患者K-ras基因突变最常见的是A、A突变为TB、C突变为GC、T突变为AD、G突变为TE、G突变为A正确答案：D58、STR法医鉴定的基础是A、蛋白质空间结构B、基因扩增技术C、碱基配对原则D、孟德尔遗传定律E、基因多态性正确答案：D59、在pH为下述何种范围时，Tm值变化不明显A、pH为8~11B、pH为3~5C、pH为5~9D、pH为5~6E、pH为4~5正确答案：C60、1个体细胞中的全部染色体，按照其大小、形态特征顺序排列所构成的图像称为A、核型B、单倍体C、基因组D、染色体组E、整倍体正确答案：A61、焦磷酸测序技术不使用的酶是A、DNA 聚合酶(DNA polymerase)B、DNA 连接酶(DNA ligase)C、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)D、荧光素酶(luciferase)E、三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)正确答案：B62、下面关于 mtDNA转录的描述不正确的是A、mtDNA转录是对称性转录B、重链和轻链的转录分别启动C、转录方向与复制方向相同D、转录过程类似于原核细胞E、成熟的mRNA 在3'末端加 poly尾,5'末端不加帽子结构正确答案：C63、线粒体疾病的遗传特征是A、近亲婚配的子女发病率增高B、女患者的子女约1/2 发病C、交叉遗传D、母系遗传E、发病率有明显的性别差异正确答案：D64、目前已发现多少个 mtDNA突变位点与Leber遗传性视神经病变有关A、20个B、25个C、30个D、35个E、40个正确答案：C65、血浆蛋白质组学研究的关键是A、2-DEB、去除高丰度干扰蛋白质C、质谱分析D、蛋白质酶解E、串联质谱正确答案：B66、PCR-RFLP技术分析mtDNAA3243G突变,PCR产物是A、300bpB、350bpC、400bpD、450bpE、500bp正确答案：C67、具有母亲生育年龄偏大和单卵双生的一致性两个特点的是A、Down综合征B、着色性干皮病C、家族性高胆固醇血症D、猫叫综合征E、WAGR综合征正确答案：A68、由线粒体基因编码的ATP酶亚基数目有A、1个B、2个C、7个D、3个E、13个正确答案：B69、下列叙述不正确的是A、F质粒的主要特征是带有耐药性基因B、R质粒又称抗药性质粒C、Col质粒可产生大肠杆菌素D、F质粒是一种游离基因E、F和Col El质粒可以在同一菌株内稳定共存正确答案：A70、MCC基因定位于哪个染色体上A、染色体5q21B、染色体10p24C、染色体5p23D、染色体1q13E、染色体10q21正确答案：A71、inhA基因的突变与下列哪种药的耐药性相关A、利福平B、异烟肼C、吡嗪酰胺D、乙胺丁醇E、链霉素正确答案：B72、BRCAI基因定位于人哪个染色体上A、染色体11q24B、染色体1p32C、染色体9p21D、染色体2p32E、染色体17q21正确答案：E73、PCR反应中延伸的时间取决于A、引物长度B、待扩增片段的长度C、模板的纯度D、Taq DNA 聚合酶的量E、模板的含量正确答案：B74、线粒体基因组与核基因组之间，下面描述不正确的是A、线粒体基因组与核基因组分别在不同的位置进行自主复制和转录，之间互不影响B、mtDNA突变可引起编码蛋白功能障碍，影响细胞呼吸、氧化功能，进而影响核DNA的表达C、mtDNA 自主性复制，但复制所需的酶、调控因子等由核基因编码D、二者虽在地理位置上独立的，但二者之间关系十分密切E、线粒体基因组与核基因组之间存在“交叉对话”，相互影响，相互协调正确答案：A75、DNA 双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称A、变性B、复性C、复杂性D、杂交E、探针正确答案：A76、结核杆菌的分子生物学检验临床意义中不包括A、早期诊断B、鉴别诊断C、疗效评价D、快速诊断E、耐药检测正确答案：A77、一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称A、复性B、探针C、杂交D、复杂性E、变性正确答案：C78、关于白假丝酵母菌的分子生物学检验，正确的描述是A、PCR技术用于假丝酵母菌诊断研究，主要采用真菌核糖体 RNA 基因(rDNA)片段作为靶基因B、5.8SrDNA、18SrDNA和28SrDNA保守区序列分析适用于种间水平的鉴定C、rDNA 保守序列的ITSI/ITSⅡ可变性很小D、ITSI/ITSⅡ具有一定种间保守性和种内特异性E、ITSI/ITSⅡ可作为属间鉴定的靶点正确答案：A79、流感病毒的植物血凝素和神经氨酸酶是A、胞膜B、衣壳C、胞膜刺突D、核酸E、壳粒正确答案：C80、IPG的特点描述中不正确的是A、IPG是丙烯酰胺衍生物，可形成pH梯度B、IPG-IEF较两性电解质具有更高的分辨率,可达到pH0.001C、IPG长度越长，能分辨出来的蛋白质数量越多D、IPGpH梯度越宽分辨率越高E、IPG在进行第二向电泳前必须进行平衡正确答案：D81、不可进行活体供体器官移植的移植物有A、肝脏B、心脏C、肾脏D、皮肤E、骨髓正确答案：B82、TaqMan探针技术要求扩增片段应在A、300~350bpB、150~200bpC、250~300bpD、200~250bpE、50~150bp正确答案：E83、下列有关遗传病的叙述中正确的是A、遗传病是指由遗传物质改变而引起的疾病B、遗传病只能诊断不能治疗C、先天性疾病都是遗传病D、遗传病都是由基因突变引起的E、遗传病一定是先天性疾病正确答案：A84、核酸分子杂交的基础是A、抗原抗体B、配体受体结合C、甲基化D、磷酸化E、碱基互补配对正确答案：E85、杂交时的温度与错配率有关，错配率每增加1%，则Tm值下降A、2~2.5℃B、1~1.5℃C、3~3.5℃D、0.5℃E、4~4.5℃正确答案：B86、目前被 DNA 自动化测序技术广泛采用的酶是A、大肠杆菌DNA聚合酶ⅠB、Klenow 片段C、测序酶D、耐热 DNA 聚合酶E、限制性内切核酸酶正确答案：D87、当SDS 单体浓度>1mmol/L时，它与大多数蛋白质平均结合比为A、0.14gSDS/1g蛋白质B、0.54gSDS/1g蛋白质C、1.4gSDS/1g蛋白质D、2.4g SDS/1g蛋白质E、3.4g SDS/1g蛋白质正确答案：C88、相对于第二代测序技术，新一代测序技术不具有的优点是A、高通量B、并行C、一次运行可产生海量的高质量数据D、模板不需要克隆E、较长的测序读长正确答案：E89、乙型肝炎病毒的核酸类型是A、双股DNAB、负股DNAC、正股 DNAD、单股DNAE、DNA-RNA 二聚体正确答案：A90、产前诊断临床应用尚不广泛，原因不包括A、需要生殖医学与遗传学技术的结合B、诊断技术不成熟C、诊断的准确性受到多种制约D、单个细胞的遗传诊断困难E、已明确母亲为携带者的婴儿正确答案：B91、假二倍体的染色体条数是A、46B、45C、47D、44E、数目不定正确答案：A92、下列实验材料中不能用于制备染色体的有A、腹水细胞B、红细胞C、绒毛膜细胞D、骨髓细胞E、胸水细胞正确答案：B93、原核生物基因组结构特点不应包括A、断裂基因B、含有重复顺序C、含插入序列D、具有操纵子结构E、转录产物为多顺反子正确答案：A94、以下关于原癌基因说法不正确的是A、普遍存在于人类或其他动物细胞基因组中的一类基因B、在生物进化过程中不稳定C、在控制细胞生长和分化中起重要作用D、容易在多种因素作用下激活成活性形式的癌基因E、活性形式的癌基因才引起细胞癌变正确答案：B95、不是自动 DNA 测序仪主要系统之一的是A、测序反应系统B、电泳系统C、荧光检测系统D、探针荧光标记系统E、电脑分析系统正确答案：D96、电脑显示和打印出的DNA碱基序列图谱中不出现的颜色是A、紫B、蓝C、绿D、橙E、红正确答案：A97、人类可遗传的变异中最简单、最常见的一种是A、RFLPB、VNTRC、STRD、SNPE、CNV正确答案：D98、属于探针序列扩增技术的是A、PCRB、RT-PCRC、巢式PCRD、链置换扩增E、bDNA正确答案：D99、在 Southern印迹中常用的核酸变性剂是A、氢氧化钠B、碳酸钠C、甲醛D、乙醛E、盐酸正确答案：A100、封闭易对膜产生“负染”的封闭剂是A、脱脂奶粉B、凝集素C、血红蛋白D、酪蛋白E、牛血清蛋白正确答案：C。
・论著・作者单位:扬州大学医学院微生物学及免疫学教研室,扬州,225001淋病奈瑟菌耐药性的分子基础初探季明春 陈红菊 严 华 申厚凤[摘要] 目的: 研究染色体介导淋病奈瑟菌耐药的机制。
方法: 应用抑制性消减杂交技术构建和筛选耐药淋病奈瑟菌差异DNA 消减文库。
结果: 从削减文库中随机挑取的96个克隆,发现其中有47个克隆仅能与tester DNA 探针杂交,而不能与driver DNA 探针杂交。
结论: 这些克隆中载有特异基因片段,它们为RS M292C4基因组DNA 所特有,可能代表某些淋病奈瑟菌新基因。
[关键词] 淋病奈瑟菌; 耐药性; 差异基因Molecular b ase of antimicrobial resistance of Neisseria GonorrhoeaeJi Mingchun ,Chen Hongju ,Yan Hua ,et al .Department o f Microbiology and Immunology ,Yangzhou Univer sity ,Yangzhou 225001[Abstract ] Objective :T o study the mechanism of chrom os ome -mediated antimicrobial resistence of Neisseria gon 2orrhoeae (NG ).Methods :Using a technique kn own as suppressive subtractive hybridization to construct and screen thelibrary which contains the differential genes between antimicrobial resistance strain and standard strain of NG,and then ,the antimicrobial resistance related genes were cloned.R esults :Antimicrobial resistance of NG subtractive library with high subtractive efficiency was set up success fully.T he am plified library contained 2500positive clones.T he 47clones that hybridized only to the subtracted probe were strong candidates for differential genes of antimicrobial resis 2tance NG .Conclusion :T he constructed DNA subtractive library of antimicrobial resistance NGis a highly efficient one and lays s olid foundation for screening and cloning relational genes of drug resistance of NG .[K ey w ords ] Neisseria gonorrhoeae ;antimicrobial resistence ;genes 淋病奈瑟菌对抗生素曾经十分敏感,由于淋病奈瑟菌的变异和适应,以及抗生素的广泛不规则使用,淋病奈瑟菌逐步产生对抗生素的耐药性1。
为较全面的探索淋病奈瑟菌对抗生素耐药性的分子基础,我们首先采用抑制性消减杂交技术对淋病奈瑟菌耐药的机制从基因组水平上进行研究。
1 材料和方法1.1 细菌菌株 淋病奈瑟菌WH O 标准参考菌株A (WH O -A )和RS M292C4菌株由Hafizah 博士惠赠。
RS M292C4菌株为一临床分离耐药菌株,分离自南非德班ST D 诊所就诊的一名重复感染男性急性尿道炎患者。
淋病奈瑟菌菌株分离、鉴定的方法按文献方法进行2。
两株淋病奈瑟菌均不产生β-内酰胺酶,不含有质粒,它们的最小抑菌浓度见表1。
表1 细菌菌株及其最小抑菌浓度(MIC ,μg Πml )WH O -A RS M292C4青霉素 0.008>4.0四环素 0.25 4.0头孢曲松<0.00050.004环丙沙星0.01616.0大观霉素1282561.2 主要生化试剂 PCR -Select Bacterial G en ome Subtraction 试剂盒为Clontech 公司产品,Rsa I 等限制性内切酶为R oche 公司产品,p GE M -T easy 线性化质粒载体为Prom oga 公司产品,Megaprimer DNA labelling sys 2tems 和dCTP -32P 为Amersham 公司产品。
测序采用Pharmarcia Biotech 公司的A LFT M DNA Sequencer 系统。
1.3 细菌培养及抗药性测定 细菌株培养采用G C 琼脂平板(Oxiod ,England )含10%Is oVitale X (Becton Dickin 2s on ,C ockeysville ,M D ),37℃6%C O 2培养24小时。
抗生素敏感性实验采用平板稀释法测定最小抑菌浓度(MIC )2。
1.4 细菌染色体DNA 的制备 将淋病奈瑟菌菌株转种于G C 琼脂平板,6%C O 2、37℃培养24小时后,收集菌苔于1.5ml 无菌离心管内,以CT AB ΠNaCl 法抽提细菌染色体DNA ,测定基因组DNA 浓度3。
1.5 抑制性消减杂交4 以WH O -A 参考标准菌株基因组DNA 为参照(driver ),RS M292C4菌株基因组DNA 为样本(tester )。
(1)基因组DNA 经RsaI 酶切后与两种接头连接:将样本与参照基因组DNA 2μg 与30单位Rsa I 及酶切缓冲液组成总体积40μl 反应体系,37℃8小时后,用M inE lute K it 提纯,并溶于5μl 水中。
以1.8μl 水稀释1.2μl 样本基因组DNA 后,分为两组,分别444China J Lepr Skin Dis.Oct 2003,V ol.19,N o.5图1 细菌基因组DNA 质量分析 A 、特异性扩增NspA 基因:2%琼脂糖凝胶电泳可见分子量为380bp 的特异性条带。
Lane 1:Marker XI V (R oche );Lane 2:RS M292C4;Lane 3:WH O -A 。
B 、纯化基因组DNA (1%琼脂糖凝胶电泳)Lane 1:Marker II ;Lane 2:RS M292C4;Lane 3:WH O -A 。
图2 S outhen blot 分析消减的有效性 A 、以非消减杂交T esterPCR 产物(T -U )为探针;B 、以消减杂交T ester PCR 产物为探针(T -S )。
Lane1为Rsa I 酶切Driver DNA ;Lane2为Rsa I 酶切Driver DNA 。
与接头adaptor1或adaptor2R 连接,16℃反应过夜后进行连接效率检测。
(Adaptor1:5’CT AA T ACG ACT C AC 2T A T AGGG CT CG AG CGG CCG CCCGGG C AGG T 3’,3’GG C 2CCG T CC A5’;Adaptor2R :5’CT AA T ACG ACT C AC 2T A T AGGG C AG CCTGG T CG CGG CCG ACCT 3’,3’G CCG 2G CT CC A5’);(2)两次消减杂交:在鉴定连接效率满意后,将连接有接头1和接头2R 的RS M292C4基因组DNA 1μl 分别与2μl RsaI 酶切WH O -A 参照基因组DNA 在63℃杂交6小时后,立即将两组经过第一次消减杂交的体系混合,另加变性的参照基因组DNA 2μl 63℃杂交过夜。
加100μl 稀释缓冲液,置68℃7min 后,-20℃贮存;(3)两次抑制PCR (巢式PCR )及抑制效率检测:取1μl 稀释后的第2次杂交产物,在50advantage cDNA 聚合酶作用下,以adaptor1、adaptor2R 的外侧序列为5’和3’引物(PCR Primer 1:5’CT AA T ACG ACT C AC 2T A T AGGG C 3’,进行第一次PCR 扩增。
取1μl 第一次PCR 产物经1:40稀释后取1μl ,在50advantage cDNA 聚合酶作用下,以adaptor1、adaptor2R 的内侧序列Nested Primer1、Nested Primer2R 分别为5’和3’引物(Nested Primer1:5’T CG AG CGG CCG CCCGGG C AGG T 3’;Nested Primer2R :5’AG CG TGG T CG CGG CCG AGG T 3’;)进行第二次PCR 扩增,并进行PCR 产物消减效率检测。
1.6 DNA 消减文库的构建、扩增 取2μl PCR 产物及1μl p GE M -T easy 线性化质粒载体,在4单位T 4连接酶的作用下,按1:1摩尔比例建立10μl 反应体系,4℃反应过夜后,进行消减文库消减效率的鉴定。
采用Megaprimer DNA labelling systems (Amersham ),按说明书操作,以dCTP -32P (Amersham )分别标记经参照DNA 消减杂交和非消减杂交的driver 第2次抑制PCR 产物,制成探针,对RsaI 酶切的tester 和driver DNA 进行S outhen blot 分析,具体方法参照文献。
取2μl 上述连接反应产物加入含β-巯基乙醇的50μl 感受态大肠杆菌T OP10F ’中,经水浴、热休克,另加250μl S OC 液,37℃300rpm 摇菌1小时,取200μl 菌液涂布于含50ng Πml 氨苄青霉素的LB ΠX -gal ΠIPTG 培养板上,37℃培养18小时。
1.7 细菌基因组DNA 消减文库的初步筛选、克隆鉴定 记数培养板中直径大于1mm 的白色及蓝色菌落数,随机挑取白色菌落,加入含氨苄青霉素LB 培养基的96培养板孔中,37℃振摇培养过夜,提取质粒,以nested primer 1和nested primer 2R 为引物进行PCR 扩增,分析插入片段。
