第二章 紫外-可见分光光度法在食品检测中的应用

邻-硝基苯酚（ONP）： 黄色，420nm有特异吸 收
“不同豆类乳糖酶活力的研究”
样品处理：红豆、绿豆、花生、黄豆→发芽→取10g →加 20mL预冷的缓冲液A（0.1mol/L磷酸缓冲液，pH为7.0、内 含5%甘油和1mmol/L EDTA），冰浴研磨，5000r/min冷冻 离心10min，收集上清液待测。 反应：0.2mL 5mmol/L ONPG、0.2mL pH4.0的0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液和0.1mL稀释25倍的各种粗酶液，在50℃ 水浴中准确反应15min后加1.0mL 0.2mol/L碳酸钠溶液终止 反应。 测定：紫外分光光度计420nm测反应液的吸光度。 计算：根据产生的ONP的量计算酶活力。酶活力单位定义为： 在规定条件下，每分钟在420nm波长下每增加0.001个吸光 度单位所需的酶量。
第二章 紫外-可见分光光度法 在食品检测中的应用
一、紫外-可见分光光度法简介
1、什么是紫外-可见分光光度法？ 根据物质分子对波长为200-760nm这一范 围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种 定性、定量和结构分析方法。
2、什么是吸收曲线（吸收光谱）？ 描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而 变的函数关系曲线。 具体做法：让不同波长的光通过待测物， 经待测物吸收后，测量其对不同波长光的 吸收程度(吸光度A)，以吸光度A为纵坐标， 辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸 收光谱或吸收曲线。 吸收光谱的产生：运动的分子外层电子→ 吸收外来辐射→产生电子能级跃迁→分子 吸收谱
2）标准对比法： 该法是标准曲线法的简化，即只配制一个 浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度， 求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx 该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律， 且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。
b. 多组分定量方法 由于吸光度具有加和性，因此可以在同一试样中 测定多个组份。 设试样中有两组份X 和Y，将其显色后，分别绘 制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：
5、分光光度法测量条件的选择
（1）检测波长的选择 根据吸收曲线选择
不易有其它物质干扰的、较高的和宽的吸收峰处 的波长
（2）溶剂的选择及处理方法 选择原则：
能完全溶解样品； 在所用的波长范围内有较好的透光性； 纯度为“光谱纯”或经检验其空白符合规定。
处理方法：
蒸馏水煮沸去除气泡； 乙醇去除醛类、苯等杂质； 环己烷、正己烷去除苯； 氯仿防止光和空气破坏； 乙醚去除过氧化物； 烃类吸附除杂
b.光谱解析注意事项 1）确认λmax，并算出logε，初步估计属于何种吸收 带； 2）观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系； 3）pH值的影响 加NaOH红移→酚类化合物，烯醇。 加HCl蓝移→苯胺类化合物。 4）识别未知物分子中可能具有的生色团、助色团并估 计共轭程度。
(5)定量基础：朗伯-比尔定律和吸光度加和性 朗伯-比尔定律： 当一束光强度为I0的单色光通过浓度为c、 厚度为L的溶液时，溶液对光的吸收度与与溶液 浓度及液层厚度成正比，公式表示为：A=KLc
粗酶液制备：
称取经研磨的样品5g，置于100 mL容量瓶中。 测中性蛋白酶则加pH7.5的磷酸盐缓冲液50 mL 在25℃浸提1h, 测酸性蛋白酶则加pH 3. 0的乳酸 -乳酸钠缓冲液50 mL在25℃浸提1h, 测碱性蛋白 酶则加pH10.5的硼砂氢氧化钠缓冲液50mL在 25℃浸提1h，浸提完成后用相应的缓冲液定容 至100mL，然后取滤液进行酶活力测定。
注意事项：
粗酶液制备时根据目标酶的性质选择缓冲液、温度、 时间等条件； 酶和底物的反应条件也要恰当； 一般以检测产物变化量居多。
二、紫外-可见分光光度法 在食品检测中的应用
（一）、食品酶分析 1、-半乳糖苷酶（乳糖酶） 以ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为 底物测定-半乳糖苷酶活力。
通用型微量池
遮光板
专用超微量比色皿
微量池架
玻璃吸收池和石英池的辨别？
吸收池的配对？
（2）紫外可见分光光度计的类型和使用： a）开机预热 1）. 单光束分光光度计：
可定量分析； 不能自动扫描吸收曲线。
b）波长设置 c）设置测试模式 d）调零 e）测样品，读数
752型紫外-可见分光光度计
2). 双光束分光光度计：
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制。
试管号
减少误差； 可进行波长扫描，绘制 吸收曲线。
a）接通电源、打开开关，打开 样品室，预热10min b）打开软件
c）选择测试模式，设置波长
d）空白液调零
TU-1901紫外可见分光光度计
e）测试样品
3). 双波长分光光度计： 通过切光器使两束不同波长的光交替通过 吸收池，测得吸光度差ΔA。
a）可测多组份试样、混浊试样； b）不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空 白溶液等产生的误差)； c）通过波长的选择方便地校正背景吸收，消除吸 收光谱重叠的干扰； d）克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。
2、蛋白酶活力测定 中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶 制备粗酶液时所用缓冲液的pH值不同 常用方法：福林-酚法
福林-酚法
原理:福林-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合试 剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合 物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合 物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基 酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此， 蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋 白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸 的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
试剂和溶液
乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 0.4mol/L碳酸钠溶液 0.4mol/L的三氯醋酸液 10.00mg/ml酪素溶液 100μ g/ml酪氨酸标准溶液 福林-酚试剂
摩尔吸收系数ε ： 1mol/L浓度的溶液，液层厚度为1cm时的吸 收度。 强吸收：ε ＞104； 中等强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104； 弱吸收： ε ＜102； 摩尔吸收系数不能直接测得？
(8)吸光度加和性：
在多组分共存的溶液体系中，体系的总吸 收度等于各组分吸收度之和，在任意波长 下，共存的多组分中各组分遵守朗伯-比尔 定律。这是多组分定量的基础。 A总=A1+A2+……+Ai
（2）定性分析方法： ♥与标准品、标准谱图对比 ♥对比吸收光谱特征数据 ♥对比吸收度的比值
（3）紫外-可见光谱定性分析的局限？
有机化合物紫外吸收光谱反映结构中生色团和助 色团的特性，不完全反映分子特性：紫外吸收光 谱只有2～3个较宽的吸收峰，具有相同生色团的 不同分子结构，有时在较大分子中不影响生色团 的紫外吸收峰，导致不同分子结构产生相同的紫 外吸收光谱——紫外吸收光谱相同，两种化合物 有时不一定相同。 例如：甲苯与乙苯：谱图基本相同
3、吸收曲线对物质定性、定量的基础及方法？ （1）定性基础：吸收曲线上的λ max、Baidu Nhomakorabea min、 肩峰以及整个吸收光谱的形状，决定于物质的性 质，其特征随物质结构而异，所以它是物质定性 的依据。（P171） 不同物质为什么会在特定的波长产生吸收峰？
——不同物质的结构不同或者说其 分子能级的能量(各种能级能量总和) 或能量间隔各异，因此不同物质将 选择性地吸收不同波长或能量的外来 辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。 （P164-166:电子跃迁的种类）
操作过程：即先将酶和底物（酪蛋白）在 一定条件下反应一段时间，然后终止反应， 再取一定量的反应液和福林酚试剂发生显 色反应，最后用分光光度法检测生成的呈 色物质的量。
GB/T23527-2009 ：蛋白酶活性的测定
所需仪器和设备
分析天平：精度0.0001g 恒温水浴：精度±0.2℃ 计时表 分光光度计 沸水浴器 振荡混合器 pH计: 精度0.01pH单位
（3）参比溶液的选择
1）. 溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体 干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多 为蒸馏水）为参比； 2）. 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处 有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）； 3）. 试样参比：如在测定波长处显色剂无吸收而试 样基体有吸收，且试样基体不与显色剂反应时， 可以试样作参比（不能加显色剂）； 4）.褪色参比：显色剂和被测试样均有颜色，则在 一份试液中先加掩蔽剂，再按测定方法加入显色 剂等其它试剂作为参比。
（4）吸光度读数范围的选择
改变被测液浓度使吸光度在0.16～0.80范围内 （5）显色反应条件的选择
显色剂用量 溶液的酸度 温度 显色时间 干扰组成的去除
二、紫外-可见分光光度法 在食品检测中的应用
（一）、食品酶分析 一般步骤：
粗酶液制备→反应→终止反应→ （显色）→检测→计算
例
1.00×10-3mol· L-1 的K2Cr2O7 溶液及 1.00×10-4 mol· L-1 的KMnO4 溶液在 450nm 波长处的吸光度分别为0.200 及0， 而在530nm 波长处的吸光度分别为0.050 及0.420。今测得两者混合溶液在450nm 和530nm 波长处的吸光度为0.380 和0.710。 试计算该混合溶液中K2Cr2O7和KMnO4 浓 度。（吸收池厚度为10.0mm)。
(6)朗伯-比尔定律中需注意的几个问题： K称为吸收系数，在单色光波长、浓度、溶 剂、温度一定时，K为常数，K常用摩尔吸 收系数ε 表示； 朗伯-比尔定律只适用于单色光、溶液，仪 器分光系统和待测液状态都会影响定量准 确性；
(7)朗伯-比尔定律的偏离及其原因？ 根据朗伯-比尔定律，在同一条件下进行测 定，A-c曲线应为通过原点的直线，但实际 工作中直线常常发生弯曲，这称为朗伯-比 尔定律的偏离。 原因： 吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质 不均匀引起；吸光物质不稳定引起。
（4）紫外光谱用于有机化合物结构辅助解析
a.可获得的结构信息 1）200～800nm 无吸收峰。脂肪族碳氢化合物、胺、醇、 卤代烃等，不含双键或环状共轭体系，且无醛、酮或溴、 碘等基团。 2） 270～350 nm有弱吸收峰（ε=10～100）而无其它强吸 收峰则说明仅含非共轭的具有n 电子的生色团发生的 n→π* 跃迁（R带） 3） 250～300 nm 有中等强度的吸收峰（ε=200～2000）, 芳环的特征吸收（具有精细结构的B带）。 4） 210～350 nm有强吸收峰（ε≥104），表明含有两个双 键的共轭体系（K）带。共轭二烯：K带（∼230 nm）； α,β-不饱和醛酮：K带∼230 nm，260nm～350 nm有强 吸收峰——3～5个双键的共轭体系。
c.
4、紫外-可见分光光度计的构成、类型和使用
（1）构成：光源、单色器、吸收池、检测器、 信号处理器、显示器
可见光源：碘钨灯、钨灯：320-2500nm 紫外光源：氢灯、氘灯、汞灯：150-400nm
玻璃吸收池：仅用于可见光区 石英池：可用于紫外光区和可见光区
短光程微量比色皿
标准比色皿
2950
型
4).多通道分光光度计
光源 透镜 吸收池 光栅 光电二极管阵列 检测器
可光谱扫描、光度测量、 定量测量、时间扫描； 扫描速度快；
TU-1800SPC 紫外-可见分光光度计
5)新型分光光度计展示
适于多种形状 吸收池
光度计PhotoLab Spektral 便携性
DR2700型便携式分光光度计

=ε 1bc+ ε 2bc+……+ ε ibc
(9)定量分析方法：
a、单组分定量方法 1）标准曲线法 ������ 先通过全波段扫描，根据吸收曲线特 征选择入射波长； ������ 配制该物质不同浓度的标准溶液，测 定其在入射波长处对应吸光值； ������ 得到标准曲线后，通过标准曲线法测 定待测试样的浓度。