2E8细胞增殖法测定白介素-7生物学活性的建立与应用

人白介素-7重组蛋白的原核表达、纯化及活性测定汤建才;龙凤;李丹;王永生【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2015(000)023【摘要】Objective:To acquire recombinant human interleukin 7 prokaryotic expressing plasmid,fusion protein is expressed,purified and identified. Methods:The hIL - 7 gene was inserted into the prokaryotic expressing vector pET - 32a( + )to acquire pET32 - hIL - 7 and transformed into BL21(DE3)cells. IPTG induced the expression of fusion protein Trx - IL - 7. The induced product was washed,dissolved and purified by affinity chromatogarphy under renaturing condition. IL - 7 was identified by Western blot,and the biologic activity was detected by proliferation of IL - 7 dependence cell 2E8. Results:The recombinant plasmid pET32 / rhlL - 7 has been constructed correctly. The recombinant hlL - 7 was gained after gradient dialysis,enzyme digestion and purified,which has the right immunology specificity and biologic activity. Conclusion:The recombinant human interleukin - 7 with biologic activity has been acquired,which lay the foundation for the further study of function of IL - 7.%目的：构建重组质粒 pET32a - hIL -7，诱导表达，纯化并鉴定目的蛋白。

CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选目的筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。

方法采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。

结果CCK-8检测人PBMC 增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。

结论CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。

本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。

[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density，culture period，concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8）on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOV A was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows：for PBMC，cell density was 2.5×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h；and for splenocyte，cell density was 5.0×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive，convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.[Key words] CCK-8；PBMC；Lymphocyte proliferation；Orthogonal test檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。

细胞增殖及细胞活力检测方法1.细胞计数法细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一、该方法通过显微镜观察细胞密度和数量来判断细胞的增殖情况。

首先，将培养皿中的细胞样本取出，使用显微镜观察细胞的形态和数量，然后用显微镜同时观察已知数量的细胞，计算出单位面积或体积中的细胞数量，最后通过比较细胞数量的变化来评估细胞的增殖情况。

2.三(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐(MTT)法MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。

MTT是一种黄色噻唑盐，可以通过还原作用转化为紫色的甲氧基-4-硝基苯胺（formazan），这个转化过程是仅在活细胞中发生的。

首先，将MTT溶液加入细胞培养皿中，细胞内的活细胞色素（还原酶）可以将MTT转化为紫色的formazan。

然后，用溶剂将formazan溶解，测量溶液的吸光度，就可以通过测量吸光度的变化来评估细胞的活力。

3.荧光素酶体积法（ATP法）ATP法是一种用于检测细胞的能量代谢水平的方法。

ATP是细胞内的能量分子，在细胞进行代谢活动时会不断产生。

将细胞样品加入含有高能底物的反应溶液中，ATP酶将底物中的ATP转化为体积比较大的荧光素酶（luciferin）。

接下来，荧光素酶与荧光素生成一个反应产生的发光，发光强度与ATP浓度成正比。

通过测量发光强度来评估细胞的活力。

4.分子探针染色法分子探针是一种与特定分子结合的荧光标记物质，可以通过显微镜观察细胞中特定分子的分布和浓度。

常用的分子探针有细胞核染色剂（如DAPI），线粒体染色剂（如JC-1），胞质钙染色剂（如Fluo-3）等。

将细胞与特定分子探针共同孵育，根据分子探针的荧光强度和分布情况，可以评估细胞内特定分子的含量和活动水平，从而间接评估细胞的增殖和活力。

5.流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞的物理和化学性质，通过细胞悬浮液在液体流动中的传递和分析的技术。

通过染色、抗体标记、荧光探针等方法，可以区分和分析细胞的不同类型和状态。

GMP级重组人白介素7（冻干粉）
Recombinant Human IL-7（interleukin-7）
作用机理：
IL-7 是一种对 T、B、NK 细胞的生长、存活及分化重要的细胞因子。

IL-7 和肝细胞生长因子（HGF）形成的异二聚体是前祖 B 细胞生长刺激因子。

在小鼠基因敲除的研究表明，IL-7 在淋巴细胞的生存起着至关重要的作用。

IL-7 刺激多能干细胞向淋巴系祖细胞分化。

规格参数：
货号：TL-506 规格：10ug/50ug
产品信息：
表达宿主：CHO细胞
生物活性：2×105 IU/mg
纯度：>98%
内毒素：<2EU/mg
纯化方式：层析纯化
性状：白色疏松体
保存温度：2-8℃
有效期：24 个月
生产厂家：同立海源生物
使用说明：
稀释后置于-20℃保存期 6 个月，-80℃保存期 12 个月。

适用范围：
T 细胞，B 细胞，NK 细胞的激活扩增
相关产品推荐：
Human IL-2、Human IL-15、Human IL-12、Human IL-6、Human IL-18、Human IL-21、Human IFN-γ、Human GM-CSF、Human EGF、NK细胞培养试剂盒。

一、名词解释（每个2.5分，共10分）1、生物药物：是利用生物体生物组织及其成分综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和现代药学的原理与方法进行加工，制造而成的一大类预防、诊断、治疗制品。

2、细胞因子：是由免疫细胞分泌的、在体内含量极低、具有多种生物学活性的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白的统称。

3、最大作用强度：指药物达到最大反应的能力。

即药物效应达到的最大高度，此时，剂量再增大效应也不再增加。

药物出现最大疗效，而不出现中毒的剂量称极量，出现中毒的最小剂量称最小中毒量。

4、生物学效价测定：以动物体内试验或体外细胞培养法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。

二、填空（每个1分，共15分）1、常见的药物有三大类，生物药物进一步可分成4大类即（基因工程药物）、（基因药物）、（天然生化药物）、合成或半合成的生物药物2、药物的基本作用包括：（兴奋作用）、（抑制作用）；药物作用的两重性包括：（药效作用）、（不良作用).3、制药车间设备包括（生产专门设施区）、（质量控制区）和贮存区。

4、成品质量标准分为（外控质量标准）和（内控质量标准）。

5、药物非临床研究质量管理规范简称（GLP）和药物临床试验质量管理规范简称（GCP）6、创新药物有（原始创新）药物和（模仿创新）药物三、选择（每个2分，共20分）1、生物技术药物主要讨论的内容不包括：（D）A．生物技术药物的临床前研究与临床评价B．生物技术药物的生产工艺与生产管理C．生物技术药物的质量控制与安全性评价D．各类生物技术药物的来源，结构、性质、作用、用途和运输方式、贮存。

2、以下哪种在国内不属于新药（C）A、未曾在中国境内上市销售的药品B、已上市的药品改变剂型C、增加药物不良反应D、改变给药途径，3、国家食品药品监督管理局对下列哪项申请不可以实行特殊审批（C）A、未在国内上市销售的从植物中提取的有效成份及其制剂B、未在国内外获准上市的化学原料药及其制剂、生物制品；C、治疗艾滋病、恶性肿瘤、罕见病等疾病且尚无临床治疗优势的药物；D、治疗尚无有效治疗手段的疾病的新药4、下列哪项是新药研究的起始和基础（B）A、已有的化学药物B、先导化合物C、超分子化合物D、新化学实体5、下列哪项不属于新药开发的途径（D）A、药物筛选B、合理药物设计C、组合化学与药物设计D、药物分子合成6、治疗用生物制品注册分类不包括哪个（D）A、基因治疗、体细胞治疗及其制品B、含未经批准菌种制备的微生态制品C、由已上市销售生物制品组成新的复方制品D、采用转基因技术制备的制品7、下列不是跨膜信号转导有四种机制的是(C)A．脂溶性药物通过细胞膜，作用于胞内受体B．配体与跨膜受体结合，使胞内酶产生变构活性调节C．通过抗原-抗体进行信号转导D．通过G-蛋白偶联的受体进行信号转导8、下列不是机体对药物作用的影响的是：（B）A.药动学性质对药物达到受体部位浓度的影响B.配体浓度的不同对药物作用的影响C.受体数目与功能改变对药物作用的影响D.受体远侧反应成分的改变对药物作用的影响9、洁净区的环境监测不包括（D）A.空气悬浮粒子标准监测B.微生物限度监测C人员监测 D．湿度监测10、I型干扰素（酸稳定型干扰素）不包括：（C）A.α－干扰素B.β－干扰素C.干扰素-rD.干扰素ω四、判断（每个2分，共20分）1、纯化过程的质量控制真核细胞表达的制品反复多次使用，要求纯度达98%以上。

MTT比色法*本实验要严格无菌操作，遵守细胞间操作流程。

操作流程及步骤：1、配制MTT溶液[1-7]。

以96孔板实验操作计算用量96孔板：高糖：60孔*180=10800ulMTT：60孔*20ul=1200ul2、先将原有培养液弃去，用PBS洗洗两次[8-9]。

3、将配制好的MTT溶液每孔200ul加入96孔板中，孵箱孵育3-4小时。

4、弃MTT液，MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。

将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走[10]。

5、每孔加入150ulDMSO，摇床10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

6、测OD值，酶标液设置波长范围：490nm-----492nm 510nm-----562nm[11]。

7、终点法----波长492----选择样本范围----读取----原始数据----输出----保存。

心得体会及注意事项：1、配制MTT溶液要避光。

2、MTT浓度网上查得5mg/ml。

3、经过0.22um微孔滤膜滤过。

4、血清和双抗会影响MTT染色效果，故培养液用不含血清和双抗的高糖。

5、计算配制溶液剂量，有时枪不准或损失较多，每板多加1ml高糖。

6、96孔板最外层不用所以总计孔数为60孔。

7、高糖180ul+MTT20ul(每孔)）。

8、操作过程要防止吹落细胞，加液延碧缓慢加入。

9、PBS液要高压灭菌过的。

10、有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。

11、96孔板底部要洁净，否则OD值不准。

目的及原理MTT实验目的：细胞增殖及细胞活性测定。

MTT实验原理：为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

白细胞介素（IL-2）检测及临床意义
一、概述
白细胞介素-2 (IL-2)又称T细胞生长因子。

主要由T细胞产生。

是在淋巴细胞增殖分化过程中重要的细胞生长因子，生理作用有刺激T细胞生长、诱导细胞毒作用和对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用等
二、检测方法
IL-2主要检测方法为生物素亲合素系统的双抗体夹心ELISA 法。

三、临床意义
1、IL-2可提高人体对病毒、细菌、真菌和原虫等感染的免疫应答，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK 细胞)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。

2、IL-2 还可以增加抗体和干扰素 (IFN)等细胞因子的分泌，在机体免疫应答中具有非常重要的作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。

3、IL-2的表达异常与临床多种疾病有密切关系，尽管外周血、尿液中IL-2 水平，或激活淋巴细胞上清液中IL-2水平的异常没有疾病特异性，但是可作为相关疾病的辅助诊断、预后及疗效观察提供可靠数据。

4、IL-2升高：肿瘤、心血管病、肝病等疾病时均可使 IL-2 水平升高，在器官移植后早期排斥反应时也出现IL-2表达升高。

5、IL-2降低：在多种原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病时均可伴有 IL-2 水平降低，如 SLE、麻风和艾滋病等。

检测细胞增殖能力的方法细胞增殖能力是生物学和医学研究中极为重要的指标，它反映了细胞的生长、繁殖和生命活力。

本文将详细介绍几种常用的检测细胞增殖能力的方法，以供研究者参考。

一、MTT法MTT法（甲基噻唑基四唑法）是一种经典的检测细胞增殖的方法。

其原理是利用活细胞内的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为蓝紫色的甲臜，甲臜的量与活细胞数成正比。

具体步骤如下：1.将细胞接种于96孔板中；2.加入MTT溶液，培养一定时间；3.弃去上清，加入DMSO溶解甲臜；4.使用酶标仪测定吸光度，判断细胞增殖能力。

二、CCK-8法CCK-8法（细胞计数试剂盒-8）与MTT法类似，但操作更简便，毒性更低。

CCK-8试剂在细胞内被还原后生成橙色的甲臜，通过测定吸光度可以评估细胞增殖能力。

三、EdU法EdU法（5-乙炯基-2"-脱氧尿嘧啶法）是一种新兴的细胞增殖检测方法。

EdU是胸腺嘧啶类似物，可以代替胸腺嘧啶插入到DNA中。

通过荧光显微镜或流式细胞仪检测EdU标记的DNA，可以评估细胞增殖情况。

四、Brdu法Brdu法（5-溴脱氧尿嘧啶法）与EdU法类似，也是一种检测细胞增殖的经典方法。

Brdu在细胞周期中代替胸腺嘧啶插入DNA，通过免疫荧光或免疫组化方法检测Brdu标记的DNA，从而评估细胞增殖能力。

五、细胞计数法细胞计数法是最直接的检测细胞增殖能力的方法。

通过细胞计数板或流式细胞仪对细胞进行计数，可以直接得到细胞数量，从而判断细胞增殖能力。

六、其他方法除了以上几种方法外，还有其他检测细胞增殖能力的方法，如：1.克隆形成实验：通过测定细胞克隆的形成数量来评估细胞增殖能力；2.细胞周期分析：利用流式细胞仪检测细胞周期各阶段的细胞比例，间接反映细胞增殖能力；3.报告基因法：通过构建带有报告基因的细胞株，检测报告基因的表达水平来评估细胞增殖能力。

综上所述，检测细胞增殖能力的方法多种多样，研究者可以根据实验需求和条件选择合适的方法。

细胞因子生物学活性检测细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。

由于许多细胞因子cDNA 克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。

目前检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2维持活化T细胞的增殖，IFN能保护病毒对正常细胞的感染，TNF-α选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。

一、白细胞介素1(IK-1)生物学活性测定白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。

目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。

ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性(一) 原理小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。

根据加入IL-1后增殖水平(３H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。

(二) 操作步骤取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为1.5×10７／ml↓细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔培养板中加100μl(1.5×10６细胞)↓加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品100μl／孔(ConA终浓度为1.5μg／ml)↓37℃ CO２孵箱 66h每孔加３H-TdR 0.5μci孵箱 6h多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上↓烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数计算:1. 从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位2. 也可用刺激指数(SI)表示实验组cpmSI＝──────×100％对照组cpm(三) 试剂和器材1. 10％ FCS RPMI1640，96孔培养板，孵箱2. 标准IL-1，ConA3. ３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯4. 9999型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪5. β液闪计数仪(四) 注意事项1. 不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。

CCK8细胞增值检测实验简介全⼼全意就为医⽣服务，⼀⼼⼀意只为造福医⽣CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞活性和增殖检测是医学研究中常⽤的实验技术，其原理是该试剂中含有WST-8，它在电⼦载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸⼆甲酯（1-Methoxy PMS）的作⽤下被细胞中的脱氢酶还原为具有⾼度⽔溶性的黄⾊甲瓒产物（Formazan dye）。

⽣成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正⽐。

因此可利⽤这⼀特性直接进⾏细胞增殖和毒性分析。

以下是CCK-8检测的具体步骤：细胞活性检测1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。

将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。

2. 向每孔加⼊10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中⽣成⽓泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4⼩时。

4. ⽤酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加⼊ 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

在24⼩时内吸光度不会发⽣变化。

细胞增殖 -毒性检测1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养 24⼩时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。

2. 向培养板加⼊10 ml不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育⼀段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48⼩时 )。

4. 向每孔加⼊10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中⽣成⽓泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4⼩时。

6. ⽤酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加⼊ 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

细胞增殖、活化、杀伤检测方法解释说明以及概述1. 引言1.1 概述细胞增殖、活化和杀伤是细胞生物学研究中的重要课题。

随着科技的不断进步，人们对细胞行为的了解也越来越深入。

在许多领域，如医学、生物工程和药物研发等，准确检测细胞的增殖、活化和杀伤情况至关重要。

细胞增殖是指细胞数量的增加过程，在生理和病理状态下都会发生。

了解细胞增殖速度不仅可以帮助我们了解细胞生长的规律，还可以评估某些疾病如癌症的发展程度。

因此，开发可靠且准确测量细胞增殖的方法是非常关键的。

细胞活化是指刺激后细胞内代谢水平的提高。

对于一些需要评估生物材料耐受性或测试新药剂对细胞外治疗效果时，准确测定细胞是否被有效激活至关重要。

细胞杀伤是通过某种方式使得部分或全部细胞死亡。

在免疫学、毒理学等领域中，准确检测细胞杀伤效果可以帮助我们评估药物或其他物质对细胞的影响程度。

为了解决这些问题，科学家们开发了多种方法来检测细胞的增殖、活化和杀伤情况。

本文的目的是对这些方法进行详细的解释说明，并概述它们各自的优势和局限性。

1.2 文章结构本文按照以下结构展开：首先是引言部分，介绍了文章涉及的主题和目的；接下来将分别详细介绍细胞增殖、活化和杀伤检测方法；最后对各种方法进行比较，总结研究结果并展望未来的研究方向。

1.3 目的本文的目的是提供一个全面而清晰的概述，使读者能够了解不同的细胞增殖、活化和杀伤检测方法。

通过详细讨论每种方法的原理、应用范围以及其优缺点，读者可以选择适合自己研究目标和实验条件的最佳技术。

此外，本文还将对未来的研究方向进行展望，以促进该领域更深入且有针对性的探索和发展。

2. 细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞通过分裂和繁殖产生新的细胞的过程。

在许多研究领域，如药物筛选、癌症治疗和组织工程等，准确评估细胞增殖能力至关重要。

本节将介绍几种常用的细胞增殖检测方法。

2.1 细胞计数法细胞计数法是最传统也是最常用的一种细胞增殖检测方法之一。

该方法通过显微镜下观察并手动计数已经增殖的细胞数量来评估细胞的增长情况。

白细胞介素的定义及分类一、白细胞介素的定义白细胞介素（）简称白介素，是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。

由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。

现在是指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子。

白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。

白细胞介素的生理学特点1、产生细胞与作用细胞多样有些白介素可由 2 种以上免疫细胞产生；一种白介素可对多种细胞发挥作用。

2、合成分泌快，大多为近距离发挥作用，降解快。

3、分子质量小，生物学作用强白介素多为小分子糖蛋白，体内含量极微，但发挥作用很显著。

白细胞介素命名及分类名称的由来关于免疫反应的表达和调节，有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等许多因子参与，其生物活性各有不同（例如巨噬细胞活化，促进T 细胞繁殖等）。

在研究这些因子的过程中，研究者各以自己测得的活性进行命名，十几年报道了近百种因子。

后来借助分子生物学技术进行比较研究发现，以往许多以生物活性命名的因子实际上是具有多效性的同一物质。

为了避免命名的混乱，1979 年第二届国际淋巴因子专题会将免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子统一命名为白细胞介素（），在名称后加阿拉伯数字编号以示区别，例如1、2…，新确定的因子依次命名。

二、分类白细胞介素是非常重要的细胞因子家族，目前发现了35 种白细胞介素，分别命名为1—35。

其功能复杂，成网络，复杂重叠。

几类白细胞介素简介人白细胞介素1 p （ 1 B ）人1 p为1家族的成员之一，1家族包括1a、1 p、1、18 及1F5至F10。

所有家族成员都具有12p链，p三叶草构像。

1 a和1 p为不同基因的产物，虽其氨基酸序列只有大约25%勺同一性，但它们识别相同的细胞表面受体。

多种细胞在应答刺激如炎性因子、感染或微生物内毒素等时，产生这两种蛋白质。

这些细胞因子可以增强内皮细胞表达粘附分子，从而使白血细胞迁移至感染位点，重建下丘脑体温调节中心导致体温升高，表现为发热症状。

1.在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。

将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5%CO 2）。

2.向每孔加入10μL CCK 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数）。

3.将培养板在培养箱内孵育1-4h 。

4.用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

5.若暂时不测定OD 值，可以向每孔中加入10μL 0.1M 的HCl 溶液或者1%w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24h 内测定，吸光度不会发生变化。

2.细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配置100μL 的细胞悬液。

将培养板在培养箱预培养24h （37℃，5%CO 2）。

2.向培养板加入1-10μL 不同浓度的待测物质。

3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48h ）。

4.向每孔加入10μL CCK 溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数）。

5.将培养板在培养箱内孵育1-4h 。

6.用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

7.若暂时不测定OD 值，可以向每孔中加入10μL 0.1M 的HCl 溶液或者1%w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24h 内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测Cell Counting Kit-8（CCK8）使用方法储存条件-20℃避光保存两年有效，4℃避光保存一年有效。

介绍Cell C ounting K it-8简称C CK8(或W ST-8)试剂盒(Biorigin,BN15201)，是一种基于W ST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8工作原理：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan ）。

细胞增殖检测(CCK-8检测法)r最佳实验条件的确定林春丽;王旭;李世明;姚丽娜【摘要】在培养基的研发及生产中,促细胞增殖的能力是鉴定培养基质量优劣的一项重要指标,其检测方法也是至关重要的.近年来,各研究院和生物实验室普遍采用快速细胞增殖检测的方法,如CCK-8染色法.本文通过一系列实验分析影响细胞增殖检测结果的因素,以及这些因素的影响范围,从而确定最佳的实验条件.【期刊名称】《国外畜牧学-猪与禽》【年(卷),期】2017(037)005【总页数】3页(P88-90)【关键词】CCK-8试剂;细胞增殖;OD值【作者】林春丽;王旭;李世明;姚丽娜【作者单位】内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109;内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109;内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109;内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109【正文语种】中文【中图分类】Q343.6细胞增殖检测原理：CCK-8试剂中含有W ST-8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜染料，生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比，在波长为450 nm～ 490 nm条件下，利用酶标仪测定其吸光度，O D值越高证明活细胞数越多，供试品的细胞增殖能力就越强。

CCK-8检测法的操作步骤：细胞接种→细胞培养→添加CCK-8试剂→孵育→测定吸光度，其优点是：试剂不需要溶解，重现性好，操作简单，灵敏度高。

本实验通过改变细胞增殖检测的条件(细胞贴壁率、孵育时间)来检测已知结果的两批样品血清，通过已知的检测结果与实际检测结果对比，来确定影响CCK-8检测的因素，以及控制范围。

2.1 样品血清样品血清分别为胎牛血清和新生牛血清。

依据《中华人民共和国药典》2010版的细胞增殖检测法检测，结果为胎牛血清细胞增殖能力明显优于新生牛血清。

细胞活性检测方法以及操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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IL-2生物学活性检测（MTT）（一）原理白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。

CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。

本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。

检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。

（二）材料（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4℃避光保存。

（3）IL-2标准品。

（4）PHA（200ug/ml）。

（三）方法（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37孵育48小时。

度，5% CO2③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。

（2）IL-2生物活性测定①CTLL-2细胞制备：取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。

②加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。

同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。

另设培养液对照孔孵育40小时。

（100ul细胞+100ul培养液）。

37℃，5% CO2③MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。

目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。

一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。

另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。

显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。

如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。

所以最直接的证据应该采用方法一。

用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。

若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。

但更为常用的方法是BrdU检测法。

用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。

细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。

Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。

比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。

而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。

1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。

BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。

有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。