B9304光合菌之培养及代谢产物CoQ10之开发

产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究辅酶Q10(CoQ10)作为细胞有氧呼吸链中的一个重要递氢体,广泛应用于医药和食品行业。

近年来,CoQ1o作为一种辅助药物,在治疗心脏衰竭方面,使用比例逐年增加,因此对CoQ1o的需求也不断增长。

对产CoQ1o微生物的开发利用也愈发重要。

本文以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)为出发菌,研究了该菌的诱变选育、培养基优化和补料分批发酵工艺。

1.对比皂化法、超声波破碎法、反复冻融法、酸热法和酸热辅助超声法对CoQ1o提取效果的影响,确定了酸热辅助超声破胞方法的可行性。

并通过单因素实验、正交法实验确定其最佳提取工艺条件。

酸热辅助超声法提取类球红细菌中CoQ1o最优的提取条件是加入300μL的盐酸、80 ℃、400w超声处理20min。

此时,CoQ1o得率为3.738mg/g。

2.以自然筛选获得的R.spl-11为出发菌株,经过紫外-LiCl、NTG结合VK3、NaN3和PHB 复合抗性诱变,获得一株遗传性状良好的CoQ1o高产菌株,其产量为71.23mg/L,比出发菌株提高了132.17%。

通过单因素实验对R.sp3-7菌株发酵条件进行优化,得到最优条件为：32℃、初始pH为7.0、接种量8%及装液量为40mL/250mL, CoQ10产量为82.70mg/L。

3.对R.sp3-7生产CoQ1o的发酵培养基进行优化,首先通过单因素筛选确定了培养基最佳碳源、氮源和需添加的金属离子。

通过Plackett-Burman设计对培养基中的9种成分进行筛选,获得影响发酵的3个重要成分：葡萄糖、玉米浆干粉和硫酸镁,再采用Box-Behnken响应面试验对上述三种成分进行优化,获得最佳浓度：葡萄糖36.9g/L、玉米浆干粉5.3g/L、MgSO4 14.4g/L。

优化后CoQ1o产量达到135.20mg/L,比优化前提高了68.62%。

4.在5L发酵罐中考察了pH、溶氧(DO)水平对CoQ1o合成的影响,结果发现CoQ1o合成的最适pH为6.8。

2009年第28卷第5期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·855·化工进展大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程研究进展王智文，马向辉，陈洵，赵学明，陈涛（天津大学化工学院，天津 300072）摘要：随着对CoQ生物合成途径及其调控机制的深入研究，利用代谢工程的方法定向地改良菌种，优化CoQ10的代谢途径，成为提高CoQ10发酵水平的新思路。

本文总结了重组大肠杆菌生产CoQ10过程中其代谢途径及其途径修饰的研究进展，分析了生产CoQ10的代谢工程限制因素，提出了利用重组大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程策略。

关键词：辅酶Q10；十异戊二烯焦磷酸合成酶；代谢通量；代谢工程中图分类号：Q 819 文献标识码：A 文章编号：1000–6613（2009）05–0855–09Progress of metabolic engineering for production of CoQ10 byEscherichia coliWANG Zhiwen，MA Xianghui，CHEN Xun，ZHAO Xueming，CHEN Tao(School of Chemical Engineering & Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）Abstract：As the knowledge of the biosynthetic enzymes and of regulatory mechanisms modulating CoQ production increases，many novel strategies arise for the production of CoQ10.Most strategies are focused on metabolic engineering of CoQ10 production and optimization of its metabolic pathways in hosts. The progress of metabolic pathways and modification of cellular pathways are summarized and the critical factors are analyzed for the CoQ10 production in recombinant Escherichia coli by metabolic engineering. The metabolic engineering strategies to improve and/or engineer CoQ10 production in recombinant Escherichia coli are presented in light of the current knowledge of the biosynthesis of this molecule.Key words：CoQ10; decaprenyl diphosphate synthase (DPS); metabolic flux; metabolic engineeringCoQ10（2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊二烯基苯醌，Coenzyme Q10，CoQ10），是一种脂溶性的醌类化合物，Q表示一族醌类化合物，10表示侧链异戊二烯的数目。

高产辅酶Q10光合细菌的筛选及鉴定光合细菌（Photosynthetic bacteria，PSB）是一大类能利用光能作为能源进行不放氧光合作用的原核生物的总称，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，除蓝细菌外，都能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作氢供体兼作碳源，进行不放氧的光合作用以合成自身物质[1]。

光合细菌广泛分布在海洋、湖泊、江河、水田和活性污泥等各个角落，能充分利用光能和各种有机物为其营养源进行自身的营养繁殖[2]。

光合细菌营养丰富，细胞干物质中蛋白质含量超过60%，含有多种维生素，尤其是B族维生素含量极为丰富，VB12、叶酸、泛酸、生物素的含量远高于酵母[3]，在人类生活的多方面都具有极其重要的作用。

光合细菌中辅酶Q10（CoQ10）的产量较高，尤其是红螺菌科细菌。

Yoshida等[4]报道了用Rhodobacter sphaeroides KY - 4113生产CoQ10。

目前日本已实现利用光合细菌工业化发酵生产CoQ10，而国内应用光合细菌发酵生产的技术还未成熟，主要还是用来净化水体、作为生物肥料以及动物饲料添加剂[5～7]。

CoQ10又称泛醌，是一种脂溶性醌类化合物，主要存在于动植物和微生物体内，在细胞内与线粒体内膜结合，作为生物体内细胞呼吸链上的电子递氢体和能量代谢的激活剂，是人体重要的生化辅酶之一。

CoQ10在心血管疾病的治疗中起重要作用，并可提高人体免疫力和治疗人体免疫系统疾病，是一种临床价值很高的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗[8，9]。

因此，筛选高产CoQ10的光合细菌具有积极的现实意义。

我们利用富集培养基从池塘污泥中富集和分离出5株光合细菌，对这5株光合细菌产生的CoQ10进行了定性定量分析，并对CoQ10产量最高的菌株进行了表型特征、生理生化特性及16S rDNA的系统发育分析，为以后提高CoQ10产量提供菌株材料。

I污水处理系统数学模型摘要随着水资源的日益紧缩和水环境污染的愈加严重，污水处理的问题越来越受到人们的关注。

由于污水处理过程具有时变性、非线性和复杂性等鲜明特征，这使得污水处理系统的运行和控制极为复杂。

而采用数学模型，不仅能优化设计、提高设计水平和效率，还可优化已建成污水厂的运行管理，开发新的工艺，这是污水处理设计的本质飞跃，它摆脱了经验设计法，严格遵循理论的推导，使设计的精确性和可靠性显著提高。

数学模型是研究污水处理过程中生化反应动力学的有效方法和手段。

计算机技术的发展使数学模型的快速求解成为可能，使这些数学模型日益显示出他们在工程应用与试验研究中的巨大作用。

对于污水处理，有活性污泥法、生物膜法以及厌氧生物处理法等污水处理工艺，其中以活性污泥法应用最为广泛。

活性污泥法是利用自然界微生物的生命活动来清除污水中有机物和脱氮除磷的一种有效方法。

活性污泥法污水处理过程是一个动态的多变量、强耦合过程，具有时变、高度非线性、不确定性和滞后等特点，过程建模相当困难。

为保证处理过程运行良好和提高出水质量，开发精确、实用的动态模型已成为国内外专家学者普遍关心的问题。

此外，由于污水处理过程是一个复杂的生化反应过程，现场试验不仅时间长且成本很高，因此，研究对污水处理过程的建模和仿真技术具有十分重要的现实意义。

本文在充分了解活性污泥法污水处理过程的现状及工艺流程的基础上，深入分析了现有的几种建模的方法，其中重点分析了ASM1。

ASM1主要适用于污水生物处理的设计和运行模拟，着重于生物处理的基本过程、原理及其动态模拟，包括了碳氧化、硝化和反硝化作用等8种反应过程；包含了异养型和自养型微生物、硝态氮和氨氮等12种物质及5个化学计量系数和14个动力学参数。

ASMI的特点和内容体现在模型的表述方式、污水水质特性参数划分、有机生物固体的组成、化学计量学和动力学参数等四个方面。

关键词：污水处理系统，活性污泥，数学模型，ASM1II Sewage Treatment System Mathematical ModelABSTRACTWith water increasingly tight and increasingly serious water pollution , sewage disposal problems getting people's attention . Because of the distinctive characteristics of variability, nonlinear and complex with time , such as sewage treatment process , which makes the operation and control of wastewater treatment system is extremely complex. The use of mathematical models , not only to optimize the design and improve the level of design and efficiency , but also to optimize the operation of the wastewater treatment plant has been built in the management , development of new technology, which is essentially a leap wastewater treatment design , experience design method to get rid of it , strictly follow derivation theory , the design accuracy and reliability improved significantly. Mathematical model to study effective ways and means of sewage treatment process biochemical reaction kinetics . Rapid development of computer technology makes it possible to solve the mathematical model , these mathematical models increasingly showing their huge role in the study of engineering and test applications.For wastewater treatment, activated sludge , biological membrane and anaerobic biological treatment , such as sewage treatment process , in which the activated sludge method most widely used. Activated sludge process is the use of natural microbial life activities is an effective method to remove organic matter and nutrient removal in wastewater of . Activated sludge wastewater treatment process is a dynamic multi-variable , strong coupling process with time-varying , highly nonlinear , uncertainties and hysteresis characteristics, process modeling quite difficult. To ensure the process runs well and improve water quality, develop accurate , practical dynamic model has become a common concern of experts and scholars at home and abroad . In addition, because the sewage treatment process is a complex biochemical reaction process , the field test not only for a long time and high cost , therefore , research has practical significance for modeling and simulation technology of sewage treatment process. Based on the current situation fully understand the activated sludge wastewater treatment process and the process based on in-depth analysis of several existing modeling method , which focuses on the ASM1. ASM1 mainly used in biological wastewater treatment design and operation of simulation , focusing on the basic biological treatment processes , principles and dynamic simulation , including carbon oxidation , nitrification and denitrification and other 8 kinds of reactions ; contains heterotrophic and self- autotrophic microorganisms, nitrate and ammonia and other 12 kinds of substances andIIIfive stoichiometric coefficients and 14 kinetic parameters . ASMI features and content reflected in four aspects of expression model , effluent quality parameters division, consisting of organic biological solid , stoichiometry and kinetic parameters.KEY WORDS:sewage treatment system,activated sludge,mathematical model, ASMIIV目录1 绪论 (1)1.1 污水处理数学模型的作用 (1)2 污水处理机理 (3)2.1 微生物的生长 (3)2.2 有机物的去除 (4)3 污水处理静态模型 (10)3.1 有机污染物降解动力学模型 (10)3.2 微生物增殖动力学模型 (13)3.3 营养物去除动力学 (16)3.3.1 生物硝化反应动力学 (16)3.3.2 生物反硝化动力学 (19)3.3.3 生物除磷动力学 (21)4 活性污泥数学模型 (22)4.1 活性污泥数学模型概述 (22)4.2 活性污泥1号模型 (23)4.2.1 ASM1简介 (23)4.2.2 模型的理论基础 (23)4.2.3 模型的假设和限定 (24)4.2.4 ASM1的约束条件 (24)4.2.5 ASM1的组分 (25)4.2.6 ASM1的反应过程 (27)4.2.7 ASM1模型中化学计量系数及动力学参数 (28)4.2.8 组分浓度的物料平衡方程 (29)污水处理系统数学模型 11 绪论水是最宝贵的自然资源之一，也是人类赖以生存的必要条件。

海洋微生物的分类及培养地球上约有80%的物种栖息在海水中，其中微生物种类超过百万种，但已经研究和鉴定过的微生物不到总量的5%。

由于海洋环境的特殊性，海洋微生物具有独特的代谢方式，产生许多特殊结构和生理功能的活性物质。

与海洋动植物相比，海洋微生物具有生长周期短、代谢易于控制、菌种可选育的优势，因此可通过大规模发酵实现工业化生产，其开发更具有自然资源的可持续利用性。

在研究早期，Macleod提出将微生物对Na+的生长需要作为海洋物种的限定，虽然这一定义仍被引用，但是部分海洋微生物在进化过程中具有适应陆地（低Na+）环境的潜力。

目前，一般认为分离自海洋环境，正常生长需要海水，并可在低营养、低温条件下生长的微生物可视为严格的海洋微生物，而有些分离自海洋的微生物，其生长不一定需要海水，但可产生不同于陆生微生物的代谢物如含溴、碘的化合物，或拥有某些特殊的生理生化性质如盐耐受性，也被视为海洋微生物[1]。

海洋微生物种类繁多，据统计有200万~2亿种。

可系统的分为病毒、古菌、细菌和真核生物[2、3]。

(1) 古菌是原核微生物的分支，与细菌在形态分化及生化特性上均有区别。

（2）革兰氏阳性菌包括常见的放线菌。

此外，还可分为极端细菌（嗜冷、嗜热、嗜碱、嗜压等）、非极端细菌、放线菌、真菌等。

海洋微生物生存在海水和海泥中，在培养之前需要将其从生存环境中分离。

所有用于分离陆生微生物的方法几乎都可用于海洋微生物的分离。

但是有些海洋微生物的分离需要特殊条件，如需含有海水的培养基和调节水压；深海微生物需在高的静水压下从深海中分离等[4]。

由于海洋极其复杂的营养背景和物理条件在目前的技术条件下大多数海洋微生物都无法在实验室培养，目前只有不足5%的海洋微生物可以培养鉴定，从中发现的活性物质只占总数的1%[5]。

一般是将冷冻保存的菌种接种在斜面培养基上，恒温培养，在培养过程中可以选择静置或使用摇床。

发酵培养基一般包括：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、人工海水及营养成分（如马铃薯浸汁、牛肉浸膏等）。

开题报告食品科学与工程环境废物净化光合菌的筛选及其代谢特性初步研究一、选题的背景与意义光合细菌（Photosynthetic Bacteria,简称PSB），是一类能进行光合作用而不产生氧气的特殊生理类群的原核生物的总称，广泛分布在自然界的水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤中。

光合细菌为革兰氏阴性菌，不能产生芽孢，形态多样，主要有球状、杆状、螺旋状和卵圆形。

现在已知的光合细菌共有着色杆菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状率细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大群共约50个属，而且不断有新种发现。

在不同的自然条件下，光合细菌表现出不同的生理生化功能，如固氮、固碳、脱氢、硫化物氧化等，在自然界的物质循环中其重要作用。

光合细菌本身无毒，含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物必需的维生素、抗病毒活性因子、辅酶Q10以及多种生理活性物质。

这些微生物在其生长过程中能利用许多有机物，并能降解和利用化肥及农药产生的分泌物。

它独特的代谢方式和代谢产物使其能广泛应用于环境污水处理、水产养殖、畜禽养殖和医药等应用领域，具有十分广阔的前景。

随着社会的发展，人们对环境的污染增大，尤其是水环境，各种重金属污染，含氮含磷的有机物使水体富营养化、含硫化合物和亚硝酸盐等污染严重。

而光合细菌在有机废水处理中显示出强力优势，且已被应用于近20种的有机废水的处理，有的已达工业化规模，与传统活性污泥法相比，PSB处理法具有有机质负荷高、设备规模小，动力消耗低，占地面积小、脱氮除磷效果好，耐盐能力强、管理简单，产生的菌体可综合利用，不存在污泥处理问题、前期投资少，见效快等优点。

因此利用PSB处理有机废水越来越受到人们重视。

近年来，养殖业的发展带来了一系列问题，水质环境恶化，养殖病害加剧，消毒剂、化学药剂的大量使用带来的病菌抗药性和药物残留等问题。

PSB以其独特的生化特性和营养功能，在水产养殖、畜禽生产、饲料添加剂等方面被广泛应用。

等离子体作用结合氧限制模型选育辅酶Q10高产菌株本期为您推荐华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家生化工程技术研究中心庄英萍教授研究团队发表在《华东理工大学学报（自然科学版）》上的一篇文章：等离子体作用结合氧限制模型选育辅酶Q10高产菌株。

文章摘要内容如下：辅酶Q10（Coenzyme Q10）是一种广泛存在于生物体细胞膜上的脂溶性化合物，具有抗氧化、清除体内自由基以及促进ATP合成等生理功能。

微生物虽然可以产生辅酶Q10，但野生型菌株其辅酶Q10的天然产量都较低，不能满足工业大规模生产降低成本的目标，需要通过选育高产菌株、优化发酵工艺和提高分离纯化效率等手段最大限度地提高辅酶Q10的产量。

类红球细菌（Rhodobacter sphaeroides）是近年来常用的辅酶Q10生产菌株。

本研究将常温常压等离子体（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变和无水亚硫酸钠构建的氧限制筛选模型相结合，通过建立适合辅酶Q10生产菌株的24孔板高通量快速培养技术，选育类球红细菌耐氧限的高性能突变株。

实验结果表明：该菌株诱变筛选最适的ARTP诱变时间为25s，最佳的氧限制平板上无水亚硫酸钠的质量浓度为0.4g/L，24孔板对于该菌的氧传递最优的装液量为2mL和发酵周期为48h，最终选育出了能够在氧限制条件下菌体生长和辅酶Q10合成效率高的突变菌株Rhodobacter. sphaeroides F5D13。

在5L发酵罐成批培养过程中，该高产菌株表现出了较强的氧亲和力，单位菌体的合成效率比出发菌株提升了18%。

ARTP是由工作气体在外加射频电场作用下，产生温度在25-40℃之间的等离子体射流，其中包含了大量的活性粒子（如电子、离子、激发态原子、分子等），可以在常压下处理微生物，使DNA等遗传物质的分子结构发生改变，研究表明ARTP对活细胞DNA的损伤强度远高于其它诱变源，因此ARTP诱变比传统诱变手段更为高效，目前已成功用于100多种微生物的诱变育种。