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浅谈心肌细胞培养技术及其进展作者：陈阜绪宋洁来源：《医学信息》2016年第23期摘要：细胞培养技术是生物医学研究中最常用和最重要的技术之一，本文就心肌细胞的经典培养模型和新进展作一综述。
关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。
因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。
在体细胞研究存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。
细胞培养（cell culture）是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。
可以说，细胞培养技术是生物医学研究中最基础最重要的技术之一。
本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。
1经典心肌细胞培养模型鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌细胞（adult cardiomyocyte，ACM）两种。
ICM培养技术是由Harary等在1960年建立的[1]，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法[2]。
ICM主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d内的乳鼠心室肌细胞最常用。
心脏内皮细胞的分离概述说明以及解释1. 引言1.1 概述心脏内皮细胞是构成心脏血管系统的重要组成部分，具有维持血管结构稳定、调节血压和参与免疫反应等多种功能。
因此，研究心脏内皮细胞的分离方法对于心血管疾病的诊断、治疗以及药物筛选等方面具有重要意义。
本文旨在概述并解释心脏内皮细胞的分离方法，包括定义和功能介绍、分离方法的概述以及它们之间的优劣比较。
此外，我们还将详细讨论心脏内皮细胞分离过程中的步骤和操作技巧，如材料准备、操作环境要求、细胞分离酶选择与使用方法以及培养基配制与使用注意事项等。
在实验结果和数据解读部分，我们将介绍心脏内皮细胞分离后效率和纯度评估指标，并展示实验结果并进行详尽解读。
此外，我们还会将结果与预期进行比较，并探讨其与现有研究进展之间的联系。
最后，在结论与未来展望部分，我们将总结心脏内皮细胞分离方法的优缺点，并探讨其在心脏内皮细胞研究中的潜在应用前景。
同时，我们还会提出该领域研究进一步发展的方向和探索的方向。
通过本文的阐述，希望能够为研究人员提供有关心脏内皮细胞分离方法的全面指导，促进对心脏内皮细胞功能和相关疾病机制的深入理解，并为相关治疗方法的开发和改进提供新思路。
2. 心脏内皮细胞的分离：心脏内皮细胞是一种位于血管内壁上的细胞，其主要功能包括调节血管张力、维持心脏功能和参与免疫反应等。
在很多研究中都需要对心脏内皮细胞进行分离以便进一步的实验操作和研究。
本部分将概述心脏内皮细胞的定义和功能，并对常用的心脏内皮细胞分离方法进行简要介绍，并对这些方法进行优劣比较。
2.1 心脏内皮细胞的定义和功能：心脏内皮细胞是一种存在于血管壁以及相关组织中的特化上皮细胞，其具有重要的生理功能。
首先，它们构成了血管内壁，起到隔离并调控外部环境与体液之间物质交换的作用。
其次，心脏内皮细胞可以通过释放各种生物活性物质来参与调节血管张力，因此在血压控制和循环系统平衡方面发挥着关键作用。
此外，它们还可以通过分泌细胞外基质和参与免疫反应等方式对心脏功能进行支持和调节。
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2021,46(8)两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较曹卉1，王薇2，肖敬川1，黄邓高1，高元慧1，朱丹1（1.中南大学湘雅医学院附属海口医院中心实验室，海口570208；2.中南大学湘雅医学院附属海口医院皮肤科，海口570208）[摘要]目的：作为理想的种子细胞，成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。
本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method ，ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method ，EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts ，HFF)，以探讨两种方法的优缺点。
方法：ITCM 是将剪碎的皮肤组织置0.1%II 型胶原酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15min ，待组织块贴壁于培养皿后进行培养。
EDM 是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，将真皮组织再次于4℃下用0.1%II 型胶原酶消化过夜，然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压，用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网，对得到的细胞悬液进行培养。
ITCM 与EDM 均采用两种酶进行消化，但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同，最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。
本研究利用ITCM 和EDM 分离、培养HFF ，观察ITCM 组和EDM 组HFF 的原代至第3代(Passage 0~Passage 3，P0~P3)的细胞形态；染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度；绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。
采取120mJ/cm 2的中波紫外线(medium-wave ultraviolet ，UVB)照射P3ITCM 组和EDM 组HFF ，建立光损伤模型。
成肌细胞原代培养及临床应用前景邱裕佳;王伟【摘要】成肌细胞(Myoblast)是肌组织中静止的单核细胞,肌纤维肌膜与基底膜之间,是肌细胞的前体细胞,在肌肉损伤修复过程中发挥重要作用.随着分子及细胞生物学的发展成肌细胞的特性逐渐被人们认识,如取材方便、来源广泛、体外增殖分化能力强、能与受体肌细胞融合并共享基因产物、移植后不会无限增殖或形成肿瘤、自体成肌细胞移植没有伦理争议等,因而成肌细胞被视为优良的种子细胞被应用于多种系统相关疾病的研究和治疗中.文章针对成肌细胞的原代分离、纯化、影响其增殖及分化因素、成肌细胞的临床应用前景等方面作以概述.%Myoblast,mononuclear quiescent cells in muscle tissue,located between sarcolemma and basement membrane,the precursor cell of muscle cell,plays an important role in the repair process of damaged muscle.With the development of molecular biology and cell biology,pecu-liarities of myoblast were further discovered,such as easy accessibility,wide source,strong ability of proliferation and differentiation in vitro,fusion with receptor muscle cells and share gene products,without unlimited proliferation and tumor formationafter implantation,autologous myoblast transplantation would not cause ethical controversy.Therefore myoblast is regarded as excellent seed cells to be used in the study and treatment of many kinds of system related diseases.This article provides a summary concentrate on the primary myoblast isolation,purification,factors affecting the proliferation and differentiation,and the prospects of the clinical application.【期刊名称】《生物骨科材料与临床研究》【年(卷),期】2017(014)002【总页数】4页(P72-75)【关键词】成肌细胞;原代培养;细胞治疗【作者】邱裕佳;王伟【作者单位】锦州医科大学研究生院辽宁锦州121000;锦州医科大学骨外科学研究所辽宁锦州121000;锦州医科大学辽宁省医学组织工程重点实验室辽宁锦州121000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1成肌细胞是骨骼肌中具有增殖分化潜能的成体干细胞，由Muaor（1961年）首次从青蛙骨骼肌纤维中分离出来。
两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较目的比较体外分离培养成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法。
方法滑膜组织来自关节镜清洗术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法分离培养FLS。
采用倒置相差显微镜以及流式细胞术对第3～4代FLS 进行鉴定。
结果2种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。
传代可使FLS 达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜观察均符合FLS的形态结构特征，流式细胞术检测示CD44以及CD90呈强阳性，CD55呈弱阳性。
组织块法培养法FLS成功率较高，细胞游出时间较早，细胞损伤小。
结论组织块培养法适合于FLS的培养，第3～4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。
[Abstract] Objective To compare the isolated methods for fibroblast-like synoviocytes (FLS). Methods Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by digestive enzyme culture and tissue culture. The 3～4 generation FLS were identified by morphology and flow cytometry. Results These two methods could culture FLS successfully, tissue culture method was better than the digestive enzyme culture method. FLS showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope. CD44 and CD90 were strong positive, and CD55 was weak positive in the FLS cell surface. Tissue culture method had higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. Conclusion Tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from synovium tissue. And purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.[Key words] Fibroblast-like synoviocyte; Cell culture; Separate training; Rheumatoid arthritis類风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病[1]。
乳鼠心肌细胞培养经验谈1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：胰酶＋胶原酶II混合消化的方法,并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。
还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2。
5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。
经验一：总结来说:1。
0.08%胶原酶II＋0。
125%胰酶等比混合后消化2.消化前后一定要轻柔吹打3.重悬时要充分吹打,动作轻柔（100次）4。
种板密度要合适5.当然血清,板都要进口，别图便宜6.别忘了检查CO2温箱的情况2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧,或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。
经验二:1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的,活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的,再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。
2：胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了，处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5％血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。
离心1000转4分钟.3：四季清的胎牛血清,180元一瓶，很便宜，进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱，我建议用进口的。
我们用的是15%的浓度。
（注意:终止液和培养液浓度是不同的，终止液没必要用那么高浓度，有点浪费）,我们用高糖的DMEM，感觉不错。
在这里我感觉最重要的培养液的PH 值，尽量在7。
2—7。
4之间,刚开始我们还有仪器测，后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调，大部是高，没有低的。
人羊膜间充质干细胞培养方法的改进崔冬冰;范安然;何志旭【摘要】目的：建立一种高效分离培养人羊膜间充质干细胞的方法。
方法：分别用酶消化法、传统组织块贴壁法和改进的组织块贴壁法分离出hAMSCs，观察3种方法所获得hAMSCs细胞形态、获得时间，流式细胞学检测其免疫表型；并用不同的诱导体系将hAMSCs向成骨细胞、成神经细胞进行诱导分化，鉴定其分化潜能。
结果：改进的组织块贴壁法获得hAMSCs细胞的纯度更高，传代次数更多，相同的培养时间里，获得的细胞数量是酶消化法的3~4倍，是传统组织块贴壁法的1~2倍；hAMSCs细胞高表达CD73、CD90、CD44和CD105，不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；茜素红染色和神经元特异性烯醇化酶检测证实hAMSCs细胞可诱导分化为成骨细胞和神经细胞。
结论：改进的hAMSCs分离培养方法可获得较大数量细胞，且保留了向神经细胞或成骨细胞可分化潜能。
%[ Abstract]Objective:To investigate and improve the method of human amnion mesenchymal stem cellsseparation and culture( hAMSCs). Methods:The hAMSCs were established with the methods oftrypsin,collagenase II,traditional and improved tissueattachment,respectively. The cell morphology and the growth time of hAMSCs were observed,and the immunophenotype were also detected with flow cytometry. In addition,hAMSCs were induced to differentiate into osteoblast and neuroblast with dif-ferent system and the derived osteoblast and neuroblast were identified then. Results:The hAMSCs obtained with the improved separation method obtain higher purity and can be passaged more times, and the quantity of obtained hAMSCs can bereached up to 3~4 times of enzyme digestion,and 1~2 times of traditional tissue attachment method within the same culture time;furthermore,the obtained hAMSCs highly express CD73,CD90,CD44 and CD105 while did not express CD11b,CD19,CD34, CD45 and HLA-DR;the alizarin staining and neuron-specific enolase detection demonstrated that hAMSCs could be induced into osteoblast and neuroblast. Conclusions:The methods of hAMSCs sepa-ration and culture are improved and will provide the basis for the research and application of hAMSC.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2016(041)004【总页数】5页(P414-417,426)【关键词】人羊膜间充质干细胞;细胞培养;鉴定;诱导【作者】崔冬冰;范安然;何志旭【作者单位】贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R329.3间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞，来源广泛，可从多个器官或组织中分离获得，因具有低免疫原性等特点，而成为细胞疗法的主要种子细胞，有着广阔的应用前景[1]。
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
Ⅱ型胶原酶消化分离法和组织块直接培养法体外培养人软骨细胞的效果蒋红;杨明辉;蔡燕;贾艾敏;邱亚;赵明才【期刊名称】《医疗装备》【年(卷),期】2017(030)007【摘要】目的比较Ⅱ型胶原酶消化分离法和组织块直接培养法体外培养人软骨细胞的效果.方法取人外伤性截肢及原发性骨关节炎患者的膝关节软骨,无菌条件下将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块,分别采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块直接培养法分离培养人关节软骨细胞,进行原代及传代培养,观察软骨细胞的生长情况.结果采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养可获得较多软骨细胞,细胞形态典型,增殖较快.组织块直接培养法获得的软骨细胞数量较少,增殖慢.结论两种不同方法培养后,均可获得人软骨细胞的生长,Ⅱ型胶原酶消化分离培养法明显优于组织块直接培养法.【总页数】4页(P31-34)【作者】蒋红;杨明辉;蔡燕;贾艾敏;邱亚;赵明才【作者单位】川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充 637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充 637000;川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充 637000;川北医学院附属医院检验科四川南充 637000;川北医学院附属医院检验科四川南充 637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充 637000;川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充 637000;川北医学院附属医院医学研究中心四川南充 637000;川北医学院附属医院检验科四川南充 637000【正文语种】中文【中图分类】R684【相关文献】1.胶原酶I消化联合筛网过滤法用于人与小鼠着床窗口期子宫内膜原代培养的效果比较 [J], 王昕荣;张宁;郝翠芳2.人妊娠子宫平滑肌细胞培养消化法与组织块法效果比较 [J], 李夏;陈诚;常青3.Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞 [J], 李树文;武海军;银和平;白明;杜志才4.Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞 [J], 闫虎;苏友新;林学义;陈宝军;周必洪;张庆5.Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞 [J], 王凤明;胡涛;周学东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响郭吉安;余丕军;王露萍;石莹莹;柳逸;陈炜【摘要】背景:目前真皮成纤维细胞研究应用广泛、需求量大、分离方法多,但是用于细胞分离培养的酶消化法尚未有对比研究.目的:比较两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞的细胞产量、形态、迁移、增殖4个方面的差异.方法:分别使用中性蛋白酶+胶原酶或胰蛋白酶分离消化真皮成纤维细胞,并进行细胞计数,原代培养并观察细胞形态学差异,采用细胞划痕实验观察细胞迁移能力并使用CCK-8检测细胞增殖活力.结果与结论:①采用中性蛋白酶+胶原酶消化的成纤维细胞在接种后六七天后融合,通过胰蛋白酶消化分离的成纤维细胞在八九天后融合,两种酶消化法都可获得真皮成纤维细胞;②与胰蛋白酶消化组相比,中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量显著增加;③划痕实验结果显示,胰蛋白酶消化的真皮成纤维细胞迁移速度较中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞显著减慢;④两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞生长曲线均显示细胞数与培养时间呈正相关关系,在第3,4和5天,中性蛋白酶+胶原酶组的成纤维细胞的吸光度均显着高于胰蛋白酶组细胞的吸光度;⑤结果表明,与胰蛋白酶消化相比,用中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞产量、迁移、增殖能力均更高;提示中性蛋白酶+胶原酶消化法优于胰蛋白酶消化法.%BACKGROUND: Dermal fibroblasts are widely used and demanded, and there are various isolation methods, but no comparative studies on enzyme digestion methods are reported. OBJECTIVE: To compare the cell count, morphology, migration and proliferation of human dermal fibroblasts isolated by two enzyme digestion methods. METHODS: Human dermal fibroblasts were isolated using either dispase-collagenase or trypsin, and their cell yield and viability were assessed by morphology, cell count and proliferation curve by cellcounting-kit 8 assay. The ability of migration was observed by cell scratch test. RESULTS AND CONCLUSION: The fibroblasts digested with dispase-collagenase were fused at 6-7 days after inoculation, and the cells isolated by trypsin digestion were fused at 8-9 days after inoculation. Fibroblasts could be obtained by both two digestion methods. The production in the dispase-collagenase group was significantly higher than that in the trypsin group. The migration rate in the dispase-collagenase group was significantly faster than that in the trypsin group. The growth cures of the human dermal fibroblasts in the two groups revealed that the cell count was positively correlated with time, and the absorbance values of the dermal fibroblasts in the dispase-collagenase group were significantly higher than those in the trypsin group at 3, 4 and 5 days after incubation. To conclude, the cell yields, migration and proliferation of dermal fibroblasts digested with dispase-collagenase are significantly higher than those of the cells digested by trypsin, indicating that dispase-collagenase digestion results in better isolation and viability of dermal fibroblasts from the dermis.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)008【总页数】6页(P1205-1210)【关键词】真皮成纤维细胞;细胞培养;组织工程;中性蛋白酶;胶原酶;胰蛋白酶;消化;组织构建;培养【作者】郭吉安;余丕军;王露萍;石莹莹;柳逸;陈炜【作者单位】江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科,上海市 200235;江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科,上海市 200235;江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科,上海市 200235;江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科,上海市 200235;江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科,上海市200235;江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科,上海市 200235【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言 Introduction成纤维细胞是结缔组织中主要的细胞成分，和其他的结缔组织一样来源于中胚层，又称为纤维母细胞。
[1] 。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。
在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。
本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。
1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。
动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。
DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。
转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。
放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。
中国组织工程研究 第20卷 第50期 2016–12–02出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 2, 2016 Vol.20, No.50·研究原著·www.CRTER .org李沙，女，1986年生，河北省邯郸县人，汉族，河北医科大学在读硕士，主要从事心血管病研究。
通讯作者：李树仁，博士，教授，主任医师，硕士生导师，河北省人民医院心内一科，河北省石家庄市 050051中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)50-07565-06 稿件接受：2016-10-17实验组：1 mm 3的组织块经0.25%胰酶/0.02% EDTA 消化后直接培养。
对照组：1 mm 3的组织块经0.25%胰酶/0.02%EDTA 消化，过筛网去除体积>1 μm 3的组织块。
1.观察第1代细胞生长状况；2.免疫荧光鉴定第1代心肌干细胞；3.计数第1代细胞中心肌干细胞百分比；4.流式细胞术分析心肌干细胞百分比。
原代培养10 d 后进行传代，选第1代细胞，收集指标。
40只1 d 龄大鼠随机分两组，取心脏酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较李 沙，李树仁，郝清卿，杨玲玲，张倩辉，马玉龙，张跃华，邓文浩(河北医科大学附属河北省人民医院心内一科，河北省石家庄市 050051)引用本文：李沙，李树仁，郝清卿，杨玲玲，张倩辉，马玉龙，张跃华，邓文浩. 酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较[J].中国组织工程研究，2016，20(50):7565-7570.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.017 ORCID: 0000-0002-0031-2819(李树仁)文章快速阅读：文题释义：心肌干细胞：成年哺乳动物心脏内存在心肌干细胞巢，在心房和心尖部位分布较多，心肌干细胞除存在于心肌干细胞巢外，也有少数分散在心肌中，心脏受到损伤刺激后，能够迅速向损伤部位迁移、分化产生心肌细胞。
心肌干细胞的主要生物学特性包括：①克隆能力；②有多能性和能够自我更新；③能够分化为成熟的心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等心脏结构细胞；④可在损伤心肌局部激活、迁移。
免疫细胞化学：又称免疫组织化学，其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，经过化学的呈色反应后，用显微镜或电子显微镜观察。
摘要背景：目前国内动物研究中提取心肌干细胞方法不统一，分离培养及提纯未形成规范化的流程。
目的：探讨酶消化法和组织块法培养大鼠心肌干细胞的差异。
方法：取清洁级1 d 龄SD 大鼠心脏组织，分为组织块组与酶消化组，分别使用酶消化法和组织块法体外培养心肌干细胞。
结果与结论：酶消化法和组织块法均能培养出心肌干细胞，但组织块组培养的细胞中心肌干细胞比例显著高于酶消化组。
提示在心肌干细胞培养过程中，组织块法优于酶消化法。
关键词：干细胞；培养；心肌干细胞；细胞培养；免疫荧光；流式细胞术；免疫组化；C-kit +心肌干细胞；河北省自然科学基金主题词：细胞培养技术；心肌；组织工程基金资助：河北省自然科学基金项目(C2015307019)Enzyme digestion method versus tissue block method in the culture of cardiac stem cellsLi Sha, Li Shu-ren, Hao Qing-qing, Yang Ling-ling, Zhang Qian-hui, Ma Yu-long, Zhang Yue-hua,Deng Wen-hao (Department of Cardiology, Hebei General Hospital Affiliated to Hebei Medical University,在心肌干细胞培养过程中，组织块法优于酶消化法Li Sha, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, Hebei General Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, ChinaCorresponding author:Li Shu-ren, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Cardiology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: At present, various methods of extracting cardiac stem cells have been reported in China, but the processes of isolation, culture and purification are not yet standardized.OBJECTIVE: To explore the difference in the culture of rat cardiac stem cells using enzyme digestion method and tissue block method.METHODS: Cardiac stem cells from Sprague-Dawley rats, clean grade, 1 day of age, were extracted and cultured in vitro using the enzyme digestion method (control group) or tissue block method (experimental group).RESULTS AND CONCLUSION: Both of the two methods could produce cardiac stem cells, but the proportion of cultured cells in the experimental group was significantly higher than that in the control group, indicating the tissue block method is superior to the enzyme digestion method in the culture of cardiac stem cells.Subject headings: Cell Culture Techniques; Myocardium; Tissue EngineeringFunding: the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. C2015307019Cite this article: Li S, Li SR, Hao QQ, Yang LL, Zhang QH, Ma YL, Zhang YH, Deng WH.Enzyme digestion method versus tissue block method in the culture of cardiac stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7565-7570.0 引言Introduction心肌干细胞是一定条件下能够分化为各种心肌细胞的未分化细胞，且c-kit+细胞是心肌组织中含量最多的干细胞类型。
近年来，心肌干细胞Ⅰ期临床试验，二者均证实心肌干细胞移植治疗心肌梗死是安全可行的[1-2]，且急性心肌梗死患者在接受移植心肌干细胞后，心肌梗死面积减少、心功能得以改善，2年随访结束时，患者也未出现严重不良反应[1]。
与此同时Doppler等[3]报道心肌干细胞的主要生物学特性包括克隆能力；能够分化为成熟的心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等心脏结构细胞。
可见，心肌细胞为心肌梗死后缺血性心力衰竭的治疗开辟了新的途径。
但是，目前国内动物研究中发现心肌干细胞提取方法不统一[4-6]，心脏中存在心肌干细胞数量极少，心肌干细胞的分离培养及提纯仍未形成规范化的流程[7]。
因此，找到一种能够简单高效获取心肌干细胞的方法显得尤为迫切。
作者拟就心肌干细胞常用的组织块和酶消化培养法是否存在差别进行探讨。
1材料和方法Materials and methods1.1 设计随机对照细胞学研究。
1.2 时间及地点实验于2015年3月至2016年3月在河北医科大学附属河北省人民医院实验室完成。
1.3 材料实验动物：40只清洁级出生1 d龄SD大鼠，由河北医科大学动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2008-1-03。
主要试剂和仪器：IMDM培养基购自gibco公司；胎牛血清购自wesent公司；青霉素、链霉素由河北省人民医院提供；胰蛋白酶购自北京索来宝公司；抗c-kit抗体购自abcam公司；DAPI溶液购自北京索来宝公司；FITC 标记的链亲和素购自Life Technologies公司；100目不锈钢筛网购自上海易佰聚生物公司；生物安全柜购自Heal 公司；倒置显微镜购自Olympus公司；荧光显微镜购自德国Leica公司)；超净工作台购自日本Sanyo公司；5810R型台式多功能高速冷冻离心机购自eppendorf AG公司；细胞培养箱购自德国Heraeus公司。
1.4 方法1.4.1 组织块法取清洁级1 d龄SD大鼠，皮肤消毒后直接开胸取心脏，含1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的PBS洗2次，去除包膜及其他组织。
眼科剪剪切至小于1 mm3，吸管反复吹打分散组织细胞，PBS洗2次，弃上清，加入无钙镁0.25%胰酶/0.02% EDTA，37 ℃震荡消化10 min，1 000 r/min离心5 min。
弃上清，加入含10%胎牛血清的IMDM培养液，37 ℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度下培养。
裸眼观察培养液颜色，每2或3 d更换培养液1次。
倒置显微镜下每日观察细胞形态和贴壁生长[8]。
