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酒曲中根霉的分离纯化及酶活性研究

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JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本科毕业论文（设计）题目：酒曲中根霉的分离纯化及酶活性研究二0一三年五月目录摘要 (I)Abstract (II)前言 (1)1材料与方法 (2)1.1材料 (2)1.1.1实验酒曲 (2)1.1.2 培养基 (2)1.1.3 试剂与仪器 (2)1.2方法 (2)1.2.1 根霉的分离与纯化 (2)1.2.2根霉的生化特性研究 (2)（1）麸皮曲的制备 (3)（2）粗酶液的提取 (3)（3）糖化酶活力测定 (3)2 根曲试饭发酵特性的研究 (3)2.1 酒酿样品的制备 (3)2.2 糖化酶活力的测定 (3)2.3酒精度的测定 (3)2.4酒酿的感官品质评定 (3)3 结果与分析 (3)3.1 葡萄糖标准曲线的制作 (4)3.2 根霉的分离纯化 (4)3.3 根霉的生化特性研究 (4)3.3.1麸皮曲糖化酶活力 (4)3.3.2霉曲试饭发酵特性的研究 (5)3.4 结论分析 (6)4 小结与讨论 (7)参考文献 (8)致谢 (9)摘要本文对两种不同来源酒曲中的根霉进行了分离、纯化，得到了一株产糖化酶能力较高的根霉，通过发酵试验对该根霉菌产糖化酶的相关理化性质进行了初步分析鉴定。

来获得糖化酶活性达到最大的时间所用的时间，给酒曲发酵提供实验依据，提高出酒率，实验采用马丁孟加拉红培养基对浓缩甜酒药和安琪酒曲中酒曲的根霉进行分离，得到浓缩甜酒药酒曲1株霉，。

将这株根霉接入糯米饭中进行发酵，测定酒酿的糖化酶活力、酒精度，并对酒酿进行了感官评定，在发酵过程中，糖化酶活力在第3d达到最大，后逐渐减弱，酒精度在第4d达到最大，后趋于平缓。

关键词：根霉；分离；糖化酶活力；酒精度AbstractWith the separation and purification and the identification of glucoamylase activity to rhizopus,get the time that the glucoamylase activity reaching maxium,which provides experiment evidence for fermentation to increase the alcohol rate. By Martin Bengal medium for separation of rhizopus from concentrated ligueurs drugs and Angel koji,get 1 strain of rhizopus from concentrated ligueurs drugs,and the glucoamylase activity was 2636.625mg/h•g.Put these strains of rhizopus access glutinous rice to get fermented,determination of fermented rice glucoamylase activity, alcohol, and the fermented rice sensory evaluation.In the fermentation process, the glucoamylase activity reaches to the maximum on the 3rd day, then gradually weakened, alcohol reaches to the maximum on the 4th day, and then began to flatten.Key words: Rhizopus; separation; glucoamylase activity；alcohol0前言甜酒酿是我国的传统发酵食品其制造方法属黄酒范畴。

它富含葡萄糖及多种氨基酸(维生素和有机酸成分),可谓营养丰富,滋味甘美,是一种滋补食品,深受人民群众的喜爱[1]-[2],甜酒酿主要是以糯米为原料,添加一定量的甜酒曲,利用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物将糊化后的淀粉糖化,将蛋白质水解成氨基酸,然后酒药中的酵母菌利用糖化产物进行生长和繁殖，并通过糖酵解途径将糖转化成酒精而制成的低度酒。

糯米甜酒含有丰富的碳水化合物、多种氨基酸、脂肪、维生素、有机酸，微量元素等人体不可缺少的成分[3]。

其味甘性温，入脾肾肺经，具有温胃健脾、益气止泻、生津止汗的作用。

米酒香味的主要来源于各种微生物的混合发酵,各菌种间的相互作用、组成比例及其代谢协调关系、代谢产物等,对米酒的质量和风味都有着直接影响。

但是菌种质量不稳定,菌群复杂,并且各种微生物受温度、湿度以及季节和气候的影响较大,各种微生物所占比例容易出现变动。

甜酒曲是决定甜酒产品质量的关键[4]，目前市售的甜酒曲大多含有多种微生物，有根霉、毛霉、犁头霉和酵母菌等。

由于采用自然培养的方法制曲，菌种质量不易稳定，易带进有害杂菌，使酒酿酸苦，酒曲糖化和发酵力低，发酵时间长，生产受到季节影响，不能适应大罐发酵高速度的要求。

本实验对酒曲中的根霉进行分离纯化及特性的研究，为酒曲优势菌群的构建, 降低生产成本，提高出酒率，给发酵生产提供直接或间接的依据，也可为开发更有价值的甜酒菌株提供实验依据。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验酒曲安琪酒曲，浓缩甜酒药1.1.2 培养基马丁孟加拉红培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基: 其做法是称取100g马铃薯，洗净去皮切碎，加水500ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加5-100g葡萄糖和7.5-10g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml，121℃灭菌20分钟左右，后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

发酵培养基：将麸皮和水按质量比1:1.2 混合，装入三角瓶中，121℃灭菌30min。

1.1.3试剂与仪器试剂：DNS: 酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中.1.33%淀粉（现配现用）：往100g蒸馏水中加入1.33g淀粉混合而成，室温保存仪器：恒温水浴锅，生化培养箱，无菌操作台，分光光度计，高压灭菌锅,酒精计，温度计，蒸馏装置1.2 方法1.2.1根霉的分离与纯化[5]取曲样0. 5g放入无菌研钵中,用5mL无菌水磨成糊状,梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10–5,分别取10-3、10-4、10–5中的0. 1mL接种于马丁孟加拉红 - 链霉素培养基，28℃培养48h，检查菌落出现情况。

由于根霉菌丝颜色与基质相似，不易看出，宜移至光亮处观察，确认后作一记号，用接种针挖掘一小块菌丝移植于另一平板培养基上。

从长有单菌落的平板中选取典型的霉菌菌落转接到平板中，28℃培养48h后，进一步挑取单菌落转接和镜检，多次分离纯化根霉。

将分离到的根霉转接到PDA斜面上培养，待长好后置于4℃冰箱中保存。

1.2.2根霉的生化特性研究1.2.2.1麸皮曲的制备：麸皮和水按1:1.2的比例混合，搅匀、润料后分装入三角瓶中，121℃灭菌 30min 后，将分离得到的根霉斜面培养物分别接于三角瓶麸皮培养基中，置于 28℃恒温培养箱中培养 3d 。

将成熟的麸皮曲 40℃干燥备用。

1.2.2.2粗酶液提取[4]：取1克鲜曲加20ml 蒸馏水,40℃水浴1小时,并间隔4~~5分钟搅拌一次,然后用纱布过滤得粗酶液。

1.2.2.3糖化酶活力测定[5]取1ml 1.33%可溶性淀粉溶液60℃预热5min ,加入1ml 酶液(粗酶液稀释100倍)60℃反应10min 立即加入1.5ml DNS 试剂。

沸水溶液15min ,冷却后加入21.5ml 蒸馏水,摇匀后在500nm 处测定吸光度。

酶活力单位(L /g ):上述条件下每分钟催化形成1umol 还原糖所需酶量为1个酶活力单位。

酶活力的定义：1g 干曲，40℃、pH4.6、1h 内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数（mg /h ·g 干曲）。

计算公式如下：糖化酶活力（mg/h ·g 干曲）=tM NV C ***式中：C 为由葡萄糖标准曲线查得的葡萄糖含量，mg /mL ；V 为糖化原液总体积，mL ；N 为酶液稀释倍数；M 为干曲质量，g ；t 为糖化时间，h1.2.2根霉发酵试验1.2.2.1根霉发酵样品的制备用分离的根霉制成的麸皮曲，将麸曲按 0.7%的比例接种到煮熟的糯米饭上，在 28℃发酵生产糯米酒，发酵 5天后，每隔24小时取样，测定发酵样品的糖化酶活力、酒精度。

1.2.2.2 糖化酶活力的测定参照麸皮曲糖化酶活力的方法测定。

1.2.2.3 酒精度的测定酒精度的测定选用酒精计法[3]用一洁净干燥的100m l 容量瓶准确量取100ml 样品于500ml 蒸馏瓶中，加几颗玻璃珠，连上冷凝器，进行加热蒸馏，后收集馏岀液，将馏岀液倒入洁净干燥的100ml 量筒中，放入酒精计，同时插入温度计，平衡5min ，水平观测，读取酒精度值，同时记录温度，根据测得的酒精度和温度，查表换算成20℃的酒精度 1.2.2.4 酒酿的感官品质评定将实验制得的酒酿在5d 后对其色泽、气味、滋味、清亮度等进行感官评定[6]。

2. 结果与分析2.1 葡萄糖标准曲线的制作[7]准确称取葡萄糖2g( 105℃干燥到恒重, 8h可) , 用蒸馏水溶解后置1000mL容量瓶中定容。

取六支编号的试管,在每支试管中按表用移液管加入葡萄糖原液和蒸馏水, 再在各试管中立即加入 1.5mL DNS摇匀, 用蒸馏水定容至25ml，于沸水浴中加热5min, 用自来水冷至室温,在540nm波长下依次测消光值。

以标准葡萄糖为横坐标, 以吸光值做纵坐标, 划制标准曲线。

见图1图1葡萄糖标准曲线2.2 根霉的分离与纯化在马丁孟加拉红平板上经过多次分离纯化后，从浓缩甜酒药中分离出一株根霉，安琪酒曲中未分离出（可能由于存放时间过长）。

2.3 根霉的生化特性研究2.3.1 麸皮曲糖化酶活力将分离到的根霉接种到麸皮培养基中，经培养后麸皮曲的糖化酶活力为2636.625mg/h·g，糖化酶活力较高，表明这株根霉菌具有较强的糖化能力。

2.3.2 根霉酒曲发酵特性的研究将分离到得根霉菌株制备的麸皮曲接种到煮熟的糯米饭上，定温定时进行培养，对培养得到的酒酿分别测定糖化酶活力、酒精度，以研究该菌株的发酵特性。

2.3.2.1在不同时段下的糖化酶活力吸光度实验结果见表2，图2表2时间d 吸光度OD500糖化酶活力mg/h·g1d 0.1709 1151.6252d 0.3358 2337.753d 0.5178 3647.254d 0.4025 2817.725d 0.2657 1833.642.3.2.2 不同时段下酒精度的变化实验结果见表3，图31d 2.34 24.2 1.732d 3.78 24.2 3.293d 5.12 22.4 4.754d 6.42 21.8 6.182.3.2.3 将实验制得的酒酿于5d后对其色泽、气味、滋味、清亮度等进行感官评定，实验结果见表4表4色泽气味滋味清凉度淡黄色微酸较甜清凉2.4 结论分析图2可知，从浓缩甜酒药中分离出的根霉在第1天酶活力较弱，随着时间的增加，糖化酶活力呈增强趋势，在第3天的时候活性最强，说明根霉在第3天发酵能力最强，而后逐渐减弱。

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传统酒曲中高产乳酸根霉菌株的选育及发酵条件优化

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传统酒曲中高产乳酸根霉菌株的选育及发酵条件优化乳酸是世界三大有机酸之一,被广泛应用于各工业中,如食品、化工、医药、环保等。

微生物发酵法是工业化生产乳酸的主要方法,目前,用于发酵产乳酸主要有乳酸细菌及根霉菌。

用于发酵产乳酸的根霉菌中多见报道的为米根霉,偶见报道的只有华根霉和少根根霉,但它们产乳酸量较低,离开发应用还有较大差距。

因此,筛选出新的有潜力并满足未来工业生产应用的乳酸高产根霉菌种有着重大意义。

据此本文从以下4个阶段展开了研究工作。

由于传统酒曲中有着丰富的种质资源,于是本文选择酒曲为分离源,从中分离出60株霉菌单菌落。

经过高锰酸钾-溴化钾平板初筛,摇瓶发酵复筛,获得一株乳酸产量高达52.33 g/L的霉菌菌株G10。

通过PDA平板培养及玻片培养法观察菌落形态及其个体形态,结合18SrDNA基因测序方法对菌株G10进行鉴定,确定分离到的霉菌菌株G10为根霉属小孢根霉(Rhizopus microsporus)。

首先以致死率为依据设定诱变条件,对G10进行紫外诱变,经筛选后得到突变菌株Z2,产酸量达66.99 g/L。

再对Z2进行DES二次诱变,得遗传稳定的突变菌株D11,产酸量达73.29 g/L,比出发菌株高出40.05%。

通过单因素试验和正交试验对D11的发酵条件进行了优化,所得最佳培养基组成为:葡萄糖120 g/L,(NH4)2SO4 4 g/L,KH2PO4 0.4 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,ZnSO4·7H2O 0.4 g/L,CaCO3 50.0 g/L。

最佳培养条件为:装液量50 mL/250 mL,接种量10%,温度32℃,转速200 r/min。

经优化后D11产酸量达80.91 g/L。

以玉米芯为载体,固定化小孢根霉D11发酵产乳酸,对载体参数及发酵条件进行了探讨,所得的最佳培养基配比为:玉米芯添加量2 g/L,玉米芯粉碎粒度40目,葡萄糖120 g/L,(NH4)2SO4 2 g/L,KH2PO4 0.3 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,ZnSO4·7H2O0.3 g/L,CaCO3 60 g/L。

根霉淀粉酶的分离纯化及部分性质研究

根霉淀粉酶的分离纯化及部分性质研究


１ 部分仪 器与药ｇ ： ４紫外分光 光度 计， 冻离心机， ． １ ．７ ５ 冷 分部
收集 器， 板状 电泳槽 ， 电泳仪 ， Ｅ Ｅ Ｄ Ａ 一纤维 素， ｐ ａ ｅ － ０ Ｓ ｈｄ ｓ １０ ｅ Ｇ
（ｈｘ ａｉ公 司） Ｐ ａｍ ｃ ａ ， 低分子标准蛋 白（ 上海生物化学研究所） ， 牛血 清白蛋白 ，Ｅ Ｄ ＮＮＮ，’ Ｔ ＭＥ （ ，，。 一四甲基 乙二胺） Ｎ 等
关键词 ： 根霉 ； 淀粉酶 ； 纯 提
中 图分 类号 ： ２ １１；Ｓ ６ ． Ｔ ６ ． Ｔ ２ １１ Ｓ ２ ５ 文 献 标 识 码 ： Ｂ
淀粉酶是能催化淀粉水转化成葡萄糖 、麦芽糖及其他低 聚糖 的一类酶 的总称 。在淀粉糖工业和食 品工业 中被广泛利
１ ．２２ 测定 操作 ： 稀释 １ ．２ ． ２． 取 ０ ０倍 的酶液 ０１ Ｌ 加入 ０９ ．ｍ ， ． ｍＬ 水， 加入 ５ Ｌ考 马斯亮 兰， ｍ 盖塞 ， 将试 管溶液纵向倒转混合 ， 放
置 ２ ｉ 后 ， ５ ５ ｍ 波 长 下 比色 ｍｎ 在 ９ｎ
用。根霉是酒 曲中主要糖化菌 ， 高产糖化酶 ， 有关糖化酶 的分
离纯化报道较 多。 而全 面研究酒 曲根霉淀粉酶 系报道较少 ， 本 文报导了获得电泳 单一 的根霉糖化酶 和液化酶 的方法 ，并对 其亚基结构和分子量等方面进行 了研究 。
析 至 Ｂ Ｃ 检验无 ｓ ４ 离子为止， ａ Ｏ２ － 聚乙二醇 一 Ｏ Ｏ ６ Ｏ 包埋浓缩
１ ． 葡 聚糖 凝 胶 Ｇ １０层 析 ．４ ２ 一０
１ ．． 制 备 ： 葡聚糖凝 胶用蒸馏 水泡胀一 天，装填一根 ． ４１ ２ 将
１ ．２１ 牛 血 清 白蛋 白 （ ００ ／ ）标 准 曲线 ：称 取 ．２ ． ２． １０ ｇ ｍＥ １００ ｍ ０ ． ｇ牛血清 白蛋 白， ０ 溶解 于 １０ ０ ｍＬ蒸馏 水 中 ， 配成 标准 蛋 白质溶液， ６ １ｍＬ刻度试管 ， 取 支 ０ 编号 ， 按表 １ 数据配置牛
传统酒曲中根霉和酵母菌株的分离鉴定及产品研究

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传统酒曲中根霉和酵母菌株的分离鉴定及产品研究郑国斌;周立学;覃先武;姚鸿【摘要】Traditional distiller’s yeast contains a large amount of Rhizopus and varieties of other microbes. Rice wine made by traditional distill-er’s yeast has mellow taste and moderate sweetness. However, the quality of microbial species in traditional distiller’s yeast is not stable and uniform. Accordingly, in this study, we made isolation and identification of traditional quality distiller’s yeast and obtained a quality Rhizopus strain R4 and a yeast strain Y7 suitable for mixed growth, then R4 and Y7 were used for starter-making through mixed culture, which could achieve the quality of traditional distiller’s yeast and make the production more simple and scientific.%传统酒曲中除大量根霉外，其他的微生物种类繁多，生产的米酒清香醇厚，甜度适中。

但菌种质量不稳定，不均匀。

为此，研究将优质的传统酒曲进行分离鉴定，从中找到1株优良米根霉R4，1株能混合生长的酿酒酵母Y7，混合培养制曲，达到传统酒曲的品质，使生产更简单更科学。

甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定

甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定

酿酒科技 2019 年第 1 期（总第 295 期）·LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2019 No.1(Tol.295)
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DOI：10.13746/j.njkj.2018177
甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定
周金虎 1，陈茂彬 1，毛志海 2，方尚玲 1
糯米酒，又称江米酒、甜酒、酒酿、醪糟，主要原 料是糯米，酿制工艺简单，口味香甜醇美，乙醇含量 极少，主要含有糖、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质 等营养成分，适宜各类人群食用，因此深受人们喜 爱。不同的甜酒曲酿制的米酒口感风格迥异[1]。
目前市场上销售的甜酒曲共分为传统土曲、现 代工业化生产的甜酒曲、纯种的根霉曲 3 类，质量 参差不齐[2]。现代工业化生产的甜酒曲主要含有酵 母 菌 和 根 霉 ，而 纯 种 的 根 霉 曲 中 就 只 有 单 一 的 根 霉，传统土曲是由根霉、毛菌、细菌、酵母菌等多种 微生物及米粉、辣蓼草等中草药制作而成，酿制的
米酒芳香独特，口感香醇，但甜度不够，主要是因为 土曲在培养的过程中有多种微生物共同生长，但却 没有糖化力较强的菌株，而根霉菌的特性之一就是 有较强的糖化酶活力 。 [3] 由此可见，甜酒曲都需要 有较强糖化力的根霉菌。甜酒曲的质量直接影响 米酒的品质及产量，因此研究甜酒曲中的根霉菌具 有十分重要的现实意义。鉴于此，本研究着重从 4 种不同的甜酒曲中筛选出糖化力较强的根霉菌，并 通过 18S rDNA 分子生物学进行鉴定，以期与同行 共同探讨学习。
基金项目： “十三五”国家重点研发计划项目中的重点课题子课题（2016YFD0400500）：传统酿造食品风味与品质调控及新型酿造技术创制。 收稿日期：2018-06-12 作者简介：周金虎(1993-)，男，湖北枣阳人，在读硕士研究生，研究方向为酿酒技术及微生物。 通讯作者：方尚玲，博士，教授，研究方向为工业微生物，E-mail：1425176720@。 优先数字出版时间：2018-08-28；地址：/kcms/detail/52.1051.TS.20180828.1021.003.html。