曲霉多糖的提取及其抑菌活性研究

曲霉多糖的提取及其抑菌活性研究

李大军;宋丹丹

【摘 要】本文通过单因素实验和正交实验对3种曲霉多糖的提取工艺进行优化,并对3种曲霉多糖的抑菌作用进行了研究.结果表明:3种曲霉多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和青霉都有一定的抑制作用；红曲霉的MIC值分别为金黄葡萄球菌6.0 mg/mL,大肠杆菌3.0 mg/mL,沙门氏菌12.0 mg/mL,青霉6.0

mg/mL;黑曲霉的MIC值分别为金黄葡萄球菌1.5 mg/mL,大肠杆菌3.0 mg/mL,沙门氏菌6.0 mg/mL,青霉6.0 mg/mL;米曲霉的MIC值分别为金黄葡萄球菌6.0mg/mL,大肠杆菌3.0mg/mL,沙门氏菌12.0 mg/mL,青霉12.0 mg/mL;对根霉具有微弱的抑制作用.3种曲霉多糖在不同条件下的抑菌作用吴有一定的稳定性.

【期刊名称】《西南农业学报》

【年(卷),期】2013(026)004

【总页数】7页(P1479-1485)

【关键词】曲霉多糖;正交实验;超声;细菌;霉菌;抑菌活性

【作 者】李大军;宋丹丹

【作者单位】吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春130118;吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春130118

【正文语种】中 文

【中图分类】Q949.32

红曲霉(Monascus anka)属真菌门，真子囊菌亚纲，曲霉科。研究发现红曲中存在大量的红曲多糖，该多糖的理化性能很好，急性毒性试验LD50表明安全可靠［1～2］。黑曲霉(Aspergillus niger)是真菌曲霉属中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，其成分中具有的生理活性日益受到关注［3］。米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种好气性真菌，主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处［4］。近年来，国内外大量研究证实多糖具有多种生理活性。其中曲霉多糖具有降低血糖、增强免疫功能、抑菌和抗病毒等作用［5～7］。作者在此对3种曲霉多糖超声提取多糖得率的影响因素进行研究，分别确定了3种曲霉多糖的最佳超声提取工艺［8～10］。近年来，对这几种霉菌多糖生物活性的研究报道较少，本文初步研究了曲霉多糖的抑菌活性，为进一步探索曲霉多糖的结构及生物活性提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

红曲霉菌种、黑曲霉菌种、米曲霉菌种、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、青霉、根霉由吉林农业大学食品安全教研室提供。玉米粉;豆粕;麸皮;0．22μm微孔滤膜;8000MW透析膜;马铃薯。

1．2 3种曲霉多糖提取及抑菌方法

1．2．1 曲霉多糖提取流程 米曲霉、黑曲霉、红曲霉→固态发酵基质→称重→超声波萃取→离心→上清液(残渣弃去)→浓缩→80%醇析→离心→上清液弃去 → 得沉淀(曲霉多糖粗品)→脱除游离蛋白→透析脱盐→乙醇分级→洗涤→干燥→收集沉淀。

1．2．2 浸提操作方法 分别称取适量的3种曲霉固态发酵基质，按不同固液比分别加入蒸馏水，于不同温度条件下恒温水浴，按不同超声功率浸提不同时间，4000 r/min离心15 min，除废渣沉淀。上清液减压蒸发浓缩至原体积的1/4至1/5，加入4倍无水乙醇，使乙醇浓度为80%，4℃冰箱醇析24 h。4000 r/min离心15 min，去上清，沉淀物依次用无水乙醇和乙醚各洗3次，4000 r/min离心5 min，去上清液。沉淀物80℃恒温干燥至恒重，得到曲霉粗多糖，脱除游离蛋白，乙醇分级后干燥得3种曲霉多糖。

1．2．3 曲霉多糖抑菌活性的测定(滤纸片法)［11～13］ 将经高温灭菌并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或PDA培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。凝固后吸取几种细菌、霉菌的菌悬液20μl至平皿中，用无菌三角涂布棒均匀涂布，待用。用无菌镊子将已在121℃干热灭菌20 min后的小圆滤纸片(直径6

mm)分别浸入装有3种曲霉多糖溶液的无菌小瓶中，无菌生理盐水(阴性对照)中及一定浓度的青霉素溶液(阳性对照)中，浸泡30 min以上，3片滤纸片间隔一定距离贴在平板相应区域。置于恒温培养箱中，细菌在37℃下培养12～16 h;霉菌在28℃左右下培养36～48 h。取出观察并测定抑菌圈的直径，比较抑菌作用的大小。

1．3 正交试验设计

根据单因素实验结果，采用 L9(33)正交表以固液比(A)，提取温度(B)，超声功率(C)3个因素，选取各因素的较优区域3个水平，做正交实验，每次做3个平行，取平均值。

1．4 曲霉多糖在不同条件下的抑菌稳定性

1．4．1 不同pH值对曲霉多糖抑菌活性的影响取质量浓度为12．0 mg/mL的3种曲霉多糖供试液10 mL，用 0．1 mol/L HCl和 0．1 mol/L NaOH 分别配制成 pH 5．0、7．0、9．0 的溶液，放入经 121 ℃，20 min干热灭菌后直径为6

mm的滤纸片，浸泡30 min，比较不同pH对大豆多糖抑菌活性的影响，各重复操作3次。

1．4．2 热处理温度及时间对3种多糖抑菌效力的影响 将3种曲霉多糖分别在80℃处理10 min和1 h、在100℃处理10 min和 1 h、在121℃处理10 min和3 s，后用去离子水配制质量浓度为12．0 mg/mL的溶液，进行抑菌活性实验。观察在不同的热处理温度及时间条件下，3种曲霉多糖的抑菌效果的变化，每组做3个平行。

2 结果与分析

2．1 超声波辅助提取法最佳条件确定

根据上述单因素试验所得结论，以料液比、浸提功率、浸提温度3个因素为对象，设计L9(33)正交设计表进行正交试验进一步确定最佳提取条件。3种曲霉多糖正交实验结果与分析分别见表1～3。

表1 红曲霉多糖超声波提取正交实验Table 1 The orthogonal experiment of

Monascus polysaccharide by ultrasonic extraction试验号因素A固液比 B温度(℃) C功率(W) 提取率(%)1 1(1︰25) 1(75) 1(350)4．71 2 1(1 ︰25) 2(85)

2(400) 5．51 3 1(1 ︰25) 3(95) 3(450) 5．02 4 2(1 ︰30) 1(75) 2(400) 4．55

5 2(1 ︰30) 2(85) 3(450) 5．97 6 2(1 ︰30) 3(95) 1(350) 5．10 7 3(1 ︰35)

1(75) 3(450) 5．58 8 3(1 ︰35) 2(85) 1(350) 5．23 9 3(1 ︰35) 3(95) 2(400)

4．67 k1 5．080 4．947 5．013 k2 5．207 5．570 4．910 k3 5．160

4．930 5．523 R 0．127 0．640 0．613

表2 米曲霉多糖超声波提取正交实验Table 2 The orthogonal experiment of

Aspergillus oryzae polysaccharide by ultrasonic extraction试验号因素A固液比 B温度(℃) C功率(W) 提取率(%)1 1(1︰20) 1(75) 1(350)5．89 2 1(1 ︰20)

2(85) 2(400) 6．98 3 1(1 ︰20) 3(95) 3(450) 6．34 4 2(1 ︰25) 1(75) 2(400)

6．56 5 2(1 ︰25) 2(85) 3(450) 6．10 6 2(1 ︰25) 3(95) 1(350) 5．69 7 3(1 ︰30) 1(75) 3(450) 5．97 8 3(1 ︰30) 2(85) 1(350) 6．42 9 3(1 ︰30) 3(95)

2(400) 6．14 k1 6．403 6．140 6．000 k2 6．117 6．500 6．560 k3 6．177 6．057 6．137 R 0．286 0．443 0．560

表1极差结果分析表明:影响红曲霉多糖超声波提取的各因子对提取结果影响的主次顺序为B＞C＞A，即提取温度＞超声功率＞固液比。最佳条件为A2B2C3，即在提取温度85℃，固液比为1︰30及超声强度450 W的条件下提取效率最高达到 5．97%。

表2极差结果分析表明:影响米曲霉多糖超声波提取的各因子对提取结果影响的主次顺序为C＞B＞A，即超声功率＞提取温度 ＞固液比。最佳条件为A1B2C2，即在提取温度85℃，固液比为1︰25及超声强度400 W的条件下提取效率最高达到 6．98%。

表3极差结果分析表明:影响黑曲霉多糖超声波提取的各因子对提取结果影响的主次顺序为A＞B＞C，即料水比＞提取温度＞超声功率。最佳条件为A2B2C3，即在提取温度75℃，固液比为1︰25及超声强度400 W的条件下提取效率最高达到 5．69%。

表3 黑曲霉多糖超声波提取正交实验Table 3 The orthogonal experiment of

Aspergillus niger polysaccharide by ultrasonic extraction试验号因素A固液比 B温度(℃) C功率(W) 提取率(%)4．95 2 1(1 ︰20) 2(75) 2(350) 5．54 3 1(1

︰20) 3(85) 3(400) 5．38 4 2(1 ︰25) 1(65) 2(350) 5．51 5 2(1 ︰25) 2(75)

3(400) 5．69 6 2(1 ︰25) 3(85) 1(300) 5．33 7 3(1 ︰30) 1(65) 3(400) 5．27

8 3(1 ︰30) 2(75) 1(300) 5．32 9 3(1 ︰30) 3(85) 2(350) 4．81 k1 5．290

5．243 5．200 k2 5．510 5．517 5．287 k3 5．133 5．173 5．447 R 1 1(1︰20) 1(65) 1(300)0．377 0．344 0．247

2．2 高效液相、紫外及红外图谱分析提取物

2．2．1 高效液相色谱分析 从图1(a，b)中可以看出，曲霉多糖的出峰时间远远早于单糖、双糖的标准样品，所以超声提取的产物中不含上述单糖和双糖成分，说明精制后的各样品较纯。

2．2．2 红外光谱分析 3种曲霉多糖红外光谱如图2所示，在3650～3400，3000～2800，2000～1650，1300～1200，1200～1000 cm－1等处均有多糖的特征吸收峰。3650～3400 cm－1之间3610 cm－1处的强吸收峰，是形成分子间氢键缔合的－OH伸缩振动;3000～2800 cm－1之间2900 cm－1处为 －CH2的伸缩振动引起的吸收;2000～1650 cm－1之间1670 cm－1处的强吸收峰为C=O的伸缩振动;1300～1200 cm－1之间1250 cm－1左右，是 C-H的变形振动峰;1200～1000 cm－1之间较宽的吸收属于吡喃环结构的C－O吸收，986

cm－1处的C-H伸缩吸收峰为多肽链β构型的特征吸收。