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实时荧光定量PCR技术

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千里之行，始于足下。

第 1 页/共 3 页 Real-time PCR for mRNA quantitation

一、原理

实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。实时定量PCR包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq ManTM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1

和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤

一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）

二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)

1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算

在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；朽木易折，金石可镂。

“Ct值”的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多, Ct值越小。

1、 绝对定量的计算

首先利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

表1 Real-time PCR 反应体系

组分 体积/反应 体积/反应 终浓度

2.5×ReaMasterMix /2×SYBR solution 22.5μL 11.25μL 1×

上链引物(5μM) 2.5μL 1.25μL 0.25 μM

下链引物(5μM ) 2.5μL 1.25μL 0.25 μM

cDNA（Rt产物稀释5-10倍） 2.5μL 1.25μL 25ng/反应

去离子水 20μL 10μL

总体积 50μL 25μL

表2 Real-time PCR反应程序

循环 步骤 温度 时光 内容

1× 1 94-95℃ 2分钟 变性

35-45× 2 94-95℃ 20秒 变性

3 50-60℃ 30秒 退火

4 68℃ 40秒 延伸

2、 相对定量的计算

相对定量PCR是指目标基因相对于内参基因的表达量。倘若需要了解一个cDNA样品中目标基因的相对表达量，就需要分离测定目标基因和内参基因的Ct值,然后按照下列公式计千里之行，始于足下。

第 3 页/共 3 页 算目标基因的相对表达量。内参基因通常选用诸如Tubulin、Actin等组成性表达基因。

目标基因的相对表达量=2-[(CtG处理-CtT处理)-(CtG对照-CtT对照)]

CtG处理：目标基因在处理条件下的Ct值

CtT处理：内参基因在处理条件下的Ct值

CtG对照：目标基因在对照条件下的Ct值

CtT对照：内参基因在对照条件下的Ct值

四、注重事项

1、反转录（Rt）

反转录取的RNA 必须经过DNA酶充足消化。因为双链DNA的存在会结合一定量的荧光染料，从而影响荧光信号的强弱。

2、引物设计

引物设计要求特异性强，没有引物二聚体的形成，并且扩增产物的长度在100bp-300bp之间。

3、荧光定量PCR反应用的离心管要求透光性好，需要定购实时荧光定量PCR专用离心管。

4、不同的荧光定量PCR试剂盒要尽量选用与之相相宜的荧光定量PCR仪。

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实时荧光定量pcr检测核酸的原理

实时荧光定量pcr检测核酸的原理

实时荧光定量pcr检测核酸的原理

实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。

RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。

RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。

RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。首先，需要从待检测样品中提取出核酸。然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。

RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。此外，RT-qPCR还可以通过荧光信号的相对强度来定量PCR扩增产物的数量，从而实现定量分析。

实时荧光定量PCR原理与分析方法

实时荧光定量PCR原理与分析方法

实时荧光定量PCR原理与分析方法

实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。

实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。

SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。SYBR

Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。

探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。

无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。

实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术

动物医学进展,2005,26(12):972101ProgressinVeterinaryMedicine

专论与讲座

实时荧光定量PCR技术3

蒋春燕,王泰健,王　琴3,范学政

(中国兽医药品监察所,北京100081)

中图分类号:Q503文献标识码:B文章编号:100725038(2005)1220097205

摘　要:荧光定量PCR技术是一种目前国内

外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始

点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强

度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性

关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因

定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表

达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速

检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。

它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实

现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具

体的试验选择合适的定量方式,从而得到更

准确的试验结果。提高荧光定量PCR技术

的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指

特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2+

浓度、引物和探针浓度、循环数等。

关键词:荧光定量PCR;基因定量;检测技术

随着基因诊断技术的不断发展和成熟,基因诊

断在临床中的地位显得更为重要。自从1983年

Mullis发明聚合酶链式反应(polymerasechainre2

action,PCR)以来,PCR技术作为一种重要的基因

诊断方法,以其迅速、简便、灵敏等优点很快成为科

研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应

用中遇到了一些难题,一是不能准确定量,二是容易

交叉污染,产生假阳性。为克服上述不足,人们采取

了许多方法,如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降

解法等,但均不能得到满意的结果,直到近年来荧光

共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytrans2

fer,FRET)技术用于PCR定量后,上述问题才得到

较好的解决。1992年Higuchi等首次提出了采用动

态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析,为解决传统PCR的难题提出了新的思

实时荧光定量pcr的原理

实时荧光定量pcr的原理

实时荧光定量pcr的原理

实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。

实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。

首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。

其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。

最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。

总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。