同源克隆结合RACE技术扩增基因全长

RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS的克隆与表达分析张冬敏;田奇琳;杨曼曼;林玉玲;赖钟雄【摘要】以龙眼‘红核子’LCc悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织为基本材料,按照龙眼体细胞胚胎同步化方法诱导获得龙眼体胚不同阶段材料,并以龙眼体细胞胚胎发生不同阶段混合材料作为试验材料,采用RT PCR结合RACE技术分离并克隆龙眼中编码同源异型结构域蛋白的转录因子WUSCHEL(简称DlWUS)的cDNA全长及DNA序列,并进行序列分析与表达分析.结果表明:DlWUS的cDNA全长1 110 bp,开放阅读框(ORF)858 bp,共编码285个氨基酸(GenBank登录号为KM017506),DlWUS的DNA包含2个内含子.序列分析表明,DlWUS是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,亚细胞定位于细胞核,具跨膜结构和Homeodomain超级家族的保守结构域以及WUS转录因子家族特有的WUS box和EAR-like结构域,推测该目的基因确实为WUS转录因子.系统进化分析显示,龙眼DlWUS与脐橙WUS归为一个分支,亲缘关系较近.实时荧光定量PCR分析结果表明,在龙眼体细胞胚胎发生整个过程中,DlWUS均有表达,但仅在球形胚时期表达量较高,说明DlWUS 可能主要在球形胚阶段发挥作用,并且在一定浓度范围内,外源施加IAA和GA3能够促进DlWUS基因的表达,而外源施加SA则抑制DlWUS基因的表达.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2015(035)005【总页数】8页(P890-897)【关键词】龙眼;体细胞胚胎发生;WUSCHEL;实时荧光定量PCR【作者】张冬敏;田奇琳;杨曼曼;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q789体细胞胚胎发生是植物体外再生的一种有效方法,目前已经有许多经济作物利用体细胞胚胎发生来获得体外再生植株,并且因为体细胞胚胎发生的生长发育过程类似于合子胚,所以也常常作为研究高等植物合子胚生长发育的模式材料。

RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。

目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。

因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。

第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

山东大学2020—2021学年第1学期
《现代分子生物学》考试试卷（A卷）
院/系年级专业姓名学号
考生答题须知
1．所有题目答题答案必须做在考点发给的答题纸上，做在本试题册上无效。

请考生务必在答题纸上写清题号。

2．评卷时不评阅本试题册，答题如有做在本试题册上而影响成绩的，后果由考生自己负责。

3．答题时一律使用蓝、黑色墨水笔或圆珠笔作答（画图可用铅笔），用其它笔答题不给分。

4．答题时不准使用涂改液等具有明显标记的涂改用品。

山东大学2020—2021学年第1学期《现代分子生物学》考试试卷（A卷）
标准答案。

RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。

完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。

末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。

编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。

2）节约了实验所花费的经费和时间。

3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。

实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。

此方法会产生较少的错误条带。

此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。

使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。

编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。

如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

表4中给出了所有引物的相互关系。

重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。

另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。

并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。

这样可以使用降落PCR。

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

RACE引物设计原则用于RACE引物设计的原则引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们这实验预期想的目的产物。

以下是结合一些网上的资料和我们在多次实验中总结出的引物设计的原则。

兼并引物的设计用兼并引物扩增，一般是我们想克隆的物种中没有我们想要克隆的目的基因的信息，但在其它物种中是存在的，我们就可以将其它物种该基因的序列进行序列同源性比较，同源性高的区域就是兼并引物设计的侯选区；或是假如这些基因的核酸序列的同源性不高，没有合适的选择区域，则我们可以用将其它物种该基因的序列翻译成氨基酸序列，然后进行序列同源性比较，同源性高的区域一般是保守区，再用保守区氨基酸对应的核酸序列设计兼并引物，但兼并引物兼并度（即单条引物上各兼并碱基之和的乘积）应小于1000 ，且兼并引物的3’端应尽量减少兼并性，并使3’端最后6个碱基的G或C的含量大于50%，以提高特异性；此外，假如我们只知道氨基酸序列，则可根据不同物种密码子的偏好性来设计引物。

有部分碱基序列的引物设计对于用差异显示(Differential Display Reverse Tranion ,DDRT)或者抑制减法杂交（Suppressive Subtractive Hybridization ，SSH）、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断，要克隆全长cDNA，或者用同源序列克隆其他物种中的同源基因，3'端的扩增一般都不成问题，难就难在5'端的片断扩增。

利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端，不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦，而且能得到全长的cDNA 5'端。

只要少至25个碱基的已知序列即可克隆出全长的cDNA[4]。

如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中，且是多基因家族的一个成员，则应先上网进行BLAST(/BLAST)，为了提高扩增的特异性，应选择没有同源性的区域设计引物。

RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究施志仪;程千千;宋佳坤【摘要】采用同源克隆和RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)β-actin 基因cDNA全长,序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基凶cDNA全长1322 bp,其包括的137 bp的5'端非翻译区,57 bp的3'端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1128 bp开放阅读框.与其他物种比对,该基因具极高的保守性.同时也利用同源克隆技术获得了两伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区,该序列长768 bp,编码256个氨基酸,也具较高的保守性,与其他物种的相似性在70%以上.以β-actin作为内参基因,对Sox2基因在西伯利哑鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测,发现Sox2基因在不同组织中均有表达.其中,在肝、胰、肾、脑4个组织中表达量差距不大,均处于相对较低的水平,在肌肉组织中表达量最高,达到了肝脏的10.4倍.同时Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均有表达,但表达也具明显的时间差异性.在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低,在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量较高,且在心脏形成期达到最高点.本研究为量化西伯利亚鲟发育分化过程中相关基因提供了坚实的参照工具,增加了后续试验的可信度,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox2在侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中的作用提供基础参考依据.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2010(017)006【总页数】10页(P1173-1182)【关键词】西伯利亚鲟;β-actin;cDNA全长克隆;Sox2;内参基因【作者】施志仪;程千千;宋佳坤【作者单位】上海海洋大学,水产与生命科学学院,上海,201306;上海海洋大学,水产与生命科学学院,上海,201306;上海海洋大学,水产与生命科学学院,上海,201306【正文语种】中文【中图分类】Q786%S917西伯利亚鲟(Acipenser baerii)隶属鲟形目(Acipenseriformes)、鲟科(Acipenseridae)、鲟属(Acipense),为软骨硬鳞鱼,分布于西伯利亚河流和湖泊。

5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。

其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。

原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。

方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。

方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'这个接头引物。

在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。

为什么？？MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV 就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。

这个就是RACE的核心原理。

具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。

SMART™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下问题1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。

上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。

所以这个引物的设计是非常巧妙的。

不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。

2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。

答曰，可以。

clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。

东北白桦COMT1基因克隆及其植物表达载体构建摘要：采用同源克隆法结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆东北白桦（Betula platyphylla）咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（COMT）基因COMT1，测序结果显示东北白桦COMT1 cDNA序列全长1 367 bp（GenBank登录号：KC292201），其中完整编码区长度1 095 bp，编码365个氨基酸。

利用Gateway技术分别构建了东北白桦COMT1植物过量表达和反义表达载体。

关键词：东北白桦（Betula platyphylla）；咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（COMT）；克隆；载体构建木质素（Lignin）是酚类多聚体，其在植物体内的含量仅次于纤维素[1，2]。

因聚合前单体（香豆醇、松柏醇、芥子醇）不同，木质素可分为紫丁香基木质素（S型木质素）、愈创木基木质素（G型木质素）和对-羟基苯基木质素（H型木质素）3种。

裸子植物木质素主要为G型，双子叶植物主要含G型和S型木质素，单子叶植物则含G型、S型和H型木质素[3]。

木质素的生物合成分为3个阶段：光合同化产物形成苯丙氨酸，苯丙氨酸代谢生成木质素单体以及单体聚合形成不同类型的木质素。

木质素单体合成途径中存在多种代谢关键酶类，如苯丙氨酸氨解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），阿魏酸-5-羟基化酶（Ferulate 5-hydroxylase，F5H），咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT），咖啡酰辅酶-A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoAO-methyltransferase，CCoAOMT）和肉桂酰CoA还原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）等，该途径也是目前木质素调控研究的重点[4，5]。

COMT催化咖啡酸、5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，参与S型木质素的合成，裸子植物中COMT只催化咖啡酸[6]。

RACE技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。

但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。

cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的c DNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。

病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5 '端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落P CR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。

甜荞半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因的克隆和序列结构分析摘要：同源克隆结合RACE（Ropid amplification of cDNA ends）技术，从甜荞（Fagopyrum esculentum）花芽中克隆到了半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因cDNA序列（GenBank登录号为JN605352）。

结果表明，其cDNA全长1 298 bp，包括1个编码362个氨基酸共1 089 bp的开放阅读框（Open reading frame，ORF）。

其蛋白与拟南芥中木瓜蛋白酶GCP1的同源性最高，属半胱氨酸蛋白酶家族中的木瓜蛋白酶亚家族，有1个由22个氨基酸残基组成的信号肽、1个由100个氨基酸残基组成的前体肽和1个由Cys149-His285-Asn305木瓜蛋白酶家族保守的催化三联体活性位点。

关键词：甜荞（Fagopyrum esculentum）；半胱氨酸蛋白酶；FaRDL基因；克隆半胱氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的各种生理生化过程[1]。

许多研究表明，木瓜蛋白酶（Papain）是半胱氨酸蛋白酶中一个大的亚家族，主要参与植物对逆境胁迫的响应、疾病防御、抵制衰老以及细胞的程序性死亡过程[2，3]。

甜荞（Fagopyrum esculentum）是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）药食同源的经济作物，有很高的营养价值和保健功效，市场开发前景广阔。

我国甜荞种质资源丰富，主要在我国西北部干旱瘠薄地种植，但其资源的开发和利用与其他甜荞主要生产国仍有较大的差距[4，5]。

本研究探讨了甜荞木瓜蛋白酶的结构和功能，对深入研究这一旱区杂粮作物的生产应用有着重要的理论意义和生产价值。

1 材料与方法1.1 材料2011年4月选取温室干旱处理的甜荞品种北早生的新鲜花芽作为受试材料。

1.2 总RNA的提取和cDNA的合成用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取甜荞花芽总RNA，并用M-MLuV逆转录酶[宝生物工程（大连）有限公司]合成第一链cDNA，反应体系和操作均按说明书进行。

应用3'RACE技术扩增仿刺参C型凝集素基因及实验条件的优化李莹;韩璐璐【摘要】The express sequence tag (EST) of C-type leetin of Apostichopus japonicus from GenBank was obtained. Based on this sequence, we utilize software of primer 5. 0 to design a pair of RACE primer. After the PCR reaction, the cDNA sequence of C-type leetin of Apostichopus japonicus was obtained. Based on part of the known partial cDNA sequence,gene specific primers (GSPF) was designed which work together with universal primers (UPM). The 3' cDNA end of C-type leetin in Apostichopus japonicus was successfully cloned. At the same time, we optimized this experiment and an amplified fragment of 670 bp in length which overlapped the known C-type leetin sequence by 417 bp was obtained subsequently. The result showed that this sequence was consistent with expected aim gene.%从GenBank上调取刺参C型凝集素(C-type Lectin)基因序列EST,根据此序列设计RACE引物,采用PCR扩增技术得到了仿刺参C-type Lectin基因序列(EST),根据这段EST序列设计1个基因特异引物(GSPF),与通用引物(UPM)扩增,成功地克隆到了该基因的3’末端序列.同时,对仿刺参C型凝集素基因3’克隆的实验条件进行了优化.该扩增片段长度为670 bp,与已知序列重叠部分为417 bp.经测序和比对发现该段序列与预期的目标基因的序列一致.【期刊名称】《辽宁师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(035)002【总页数】6页(P246-251)【关键词】仿刺参;C型凝集素;3'RACE技术【作者】李莹;韩璐璐【作者单位】辽阳职业技术学院,辽宁辽阳111004;辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连116081【正文语种】中文【中图分类】Q781RACE（rapid－amplification of cDNA ends）是基于PCR技术基础上，由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法［1-2］.经典的RACE技术是由Frohman et al.于1988年发明的［3］.经过长期的改进，此种方法可以从低丰度的转录本中快速有效的对基因末端进行扩增［4］. 仿刺参（Apostichopus japonicus）隶属于棘皮动物门，海参纲，刺参科，仿刺参属［5］.当环境不适时有排脏现象［6］.再生力很强，损伤或被切割后都能再生［7］.仿刺参是我国20多种食用海参中质量最好的一种.伴随着养殖规模的逐年扩大，也出现了一些影响产业发展的瓶颈问题，其中种质质量退化、养殖病害频发等问题已经引起业内诸多学者的关注［8］.目前，刺参的研究大多为常规育种、养殖等，关于其基因功能及蛋白差异表达的研究报道较少.刺参虽然本身不具有特异性免疫系统，但是对于细菌等入侵微生物又具有防御功能，这归功于非特异性免疫系统［9］.而这一功能的发挥与模式识别受体——C型凝集素的存在有着密切的联系. C型凝集素基因作为免疫相关基因一直备受人们的关注.不论是在具有特异性免疫的高等脊椎动物中，还是在只含有非特异性免疫的无脊椎动物中，它对机体的稳态保持和调节都起到了重要的作用［10］.但是它在不同物种之间比对，核苷酸序列差异性比较大，同科同属之间的相似度也不高，这也影响了对仿刺参中C型凝集素的研究.因此获得中国仿刺参中C型凝集素基因序列全长尤为重要.本文以仿刺参C型凝集素基因EST为参考序列，通过3’RACE技术，克隆了中国仿刺参的C型凝集素基因3’末端序列，为进一步得到该基因的全长及深入分析该基因的功能，了解该基因在刺参免疫过程中的作用打下基础.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验材料实验所用的仿刺参都是采自大连棒棰岛集团刺参原种场，在实验室18℃条件下，夜晚打氧，饥饿处理2d后解剖.1.1.2 菌株与质粒大肠杆菌为菌株DH5α，所用质粒为pMD19－Tvector，均由宝生物工程（大连）有限公司提供.1.1.3 酶和试剂 Taq酶、反转录酶（M－Mlv）、连接酶、引物合成、Oligo d （T）等均为宝生物工程（大连）有限公司出品.进口琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒由天根生化科技（北京）有限公司提供.总RNA提取试剂Trizol由Invitrogen公司提供.1.2 方法1.2.1 总RNA的提取按照Trizol试剂盒的使用说明，提取中国仿刺参呼吸树组织中的总RNA，用RNase－Free DNase I除去污染的DNA［11］.用紫外分光光度计检测其纯度并计算浓度，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性.1.2.2 cDNA 模板的获得整个过程在冰上操作.配制体系：RNA－free水（8μL）；oligodT（2μL）；Total RNA（2μL）.在PCR仪上按70℃，10min条件进行.取出后冰上急冻2min；继续加入RNase Inhibiter（0.5μL）；5×primer（引物）buffer（4μL）；dNTP（RNA 专用1μL）；RNA－free水（2μL）；LMV反转录酶（0.5μL）共计20μL.在PCR仪上按42℃60min；70℃15min；4℃ 保存条件进行反转录［12］.1.2.3 C型凝集素基因的扩增根据NCBI上登录的仿刺参C型凝集素的部分mRNA序列，设计特异性引物GSPF和GSPR（表1）提取C型凝集素基因.反应的扩增条件为：94℃5min 35个循环；94℃45s；54℃1min；72℃1min；72℃5min（4℃保存）.在一个RNaes－free的PCR管中加入以下体系：RNA－free水（12.8μL）；Buffer（2μL）；dNTP（2μL）；上游引物（1μL）；下游引物（1μL）；cDNA模板（1μL）；Taq聚合酶（0.2μL天根Tac酶），总计25μL 反应体系.1.2.4 C型凝集素基因3’末端快速扩增实验方法及条件优化按照TaKaRa code：D314试剂盒，3’－Full RACE Core Set Ver.2.0的使用说明进行.（1）反转录成带有3’接头的cDNA：RNA模板（1μL）；3’RACE Adaptor（1μL）；5×M －MLV Buffer（2μL）；dNTP Mixture（1μL）；RNase Inhibitor（0.25μL）；Reverse Transcriptase M－MLV（RNase H－）（0.25μL）；Rnase FreedH2O（4.5μL），总计10μL反应体系.（2）3’RACE PCR反应体系如下：上述（1）中的反转录液（2μL）；1×cDNA Dilution BufferⅡ（8μL）；C417－1（2μL）；3’RACE Outer Primer（2μL）；10×LA PCR BufferⅡ（Mg2＋Free）（4μL）；MgCl2（3μL）；TaKaRa LA Taq（0.25μL）；dH2O （28.75μL），总反应体系为50μL.基因特异性反应引物为GSPF，通用引物为UPM.反应条件为：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃1min、30Cycles；72℃10min.4℃保存.表1 中国仿刺参C型凝集素引物序列Table 1 The sequence of sea cucumber （Apostichopus japonicus）引物序列（5’－3’）方向GSPF CAGAGGGCTACCCAAAGAG 上游GSPR CATCAGAACCATCCGTCCA 下游UPM TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 下游1.2.5 载体的连接将上述试验中得到的PCR产物进行凝胶电泳，之后切胶回收（上海捷瑞生物工程有限公司提供试剂盒），回收完电泳看回收效果.条带单一则连载体，反应体系为：4μL回收产物，1μL载体，5μL solution.16℃培养过夜. 1.2.6 转菌制冰，倒平板（用固体培养基），从－80℃冰箱取出感受肽，冰上缓慢解冻.无菌操作台上，在1.5mL离心管中加入10μL连接反应产物，30～40μL感受肽DH5α（Takara）.轻摇，冰上50min，每10min轻摇1次；42℃水浴加热，90s.迅速置于冰上3～5min（不可摇动）；无菌台上，加1mL LB液体培养基（不含AMP），混匀后37℃震荡培养1h，120r／min；将培养液涂于平板上，涂匀，37℃培养过夜（不超过16h）.待出现明显而又没有互相重叠的单菌落时拿出平板.于4℃数小时，使蓝白斑分明；向100mL液体培养基中加入60μLAMP混匀后分装于离心管中，用枪头挑取单菌落白斑于10μL培养基的离心管中；菌液PCR，反应条件为：94℃3min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，72℃5min.4℃保存.反应体系为：去离子水（8μL）；10×buffer（2μL）；d NTP （3.2μL）；通用引物p1（0.8μL）；通用引物p2（0.8μL）；酶（0.2μL）；模板（5μL）.总体积为20μL.吸取1μL保存菌种（AO2）.加入1mL LB＋AMP培养液.摇菌过夜1∶1 000（取10μL菌＋5mL培养基）封口.通用引物购于大连宝生物公司.1.2.7 提质粒（天根试剂盒），测序.2 结果2.1 RNA完整性的检测降RNA溶于适量的DEPC水中，稀释100倍，利用紫外分光光度计测得A260＝0.20，RNA浓度＝1 600ng／μL.纯度检测，RNA溶液的A260／A280＝2.01，说明无蛋白质和其他杂质的污染.1.2%琼脂糖凝胶电泳检测完整性（图1），可以看出28S、18S和5.8S3条条带清晰无明显拖尾，表明总RNA无降解，可用于后续试验.2.2 仿刺参C型凝集素基因部分cDNA序列扩增利用RT－PCR技术扩增得到一条417bp左右的片段（图2），由图2可见PCR 条带特异性好，条带清晰，适合进行下一步克隆.由于条带清晰，直接送给宝生物公司测序.2.3 仿刺参C型凝集素基因3’端cDNA序列扩增结果从已经获得的仿刺参C型凝集素基因部分cDNA序列设计3条基因特异性引物，进行3’末端扩增.3’RACE扩增后得到目的片段670bp左右（图3），得到目的片段后进行转菌测序.图1 呼吸树组织中总RNA的凝胶电泳图Fig.1 The gram of gel electrophoresis （RNA in the tissue of respiratory trees）图2 中国仿刺参中C型凝集素EST凝胶电泳图Fig.2 The gram of gel electrophoresis（the EST of C－type lectins in sea cucumber）图3 中国仿刺参C型凝集素3’RACE PCR产物Fig.3 The gram of gel electrophoresis（the 3’RACE of C－type lectins in sea cucumber）2.4 3’RACE产物序列测定结果及序列分析3’RACE的目的条带经过扩增、纯化和克隆后，挑取阳性克隆质粒测序.测序结果发现，一共得到670bp的基因片段（图4）.经过ORF在线预测，我们得到372bp的开放阅读框区域（图4，划线部分），其中加框的第41位的ATG是起始密码子，417位的TGA是终止密码子.核苷酸序列尾部包含9bp的poly A尾巴和一个特征性序列AATAAA.预测此开放阅读框编码123个氨基酸.在线预测蛋白结构域，我们得到了CLECT超家族结构域（图5A），说明此段序列属于C型凝集素家族成员，同源性比对分析显示，与海胆的C型凝集素相似度仅仅达到48%（图5B），与其他物种的比较同源性则更低.在不同的物种当中，C型凝集素基因的结构差异很大.图4 仿刺参中C型凝集素3’RACE cDNA序列Fig.4 The 3’RACE cDNA sequence of C－type lectins in sea cucumbers图5 仿刺参中C－型凝集素结构结构域（A）及C型凝集素BLAST比对结果（B）Fig.5 The domain of C－type lectins in sea cucumber（A）and the result of BLAST （B）3 讨论3’RACE是以Oligo－dT和一个接头组成的接头引物（adaptor primer，AP）进行RNA反转录，得到加接头的第1链cDNA，然后利用基因特异引物（gene specific primer，GSP）和含有部分接头序列的通用引物（universal Amplication Primer，UAP）分别作为上、下游引物，通过PCR反应获得未知序列［13-16］.3’RACE采用PCR扩增技术后测序得到一段EST序列，根据这段EST序列设计2个基因特异引物（GSP和NGSP），分别与通用引物（UPM）和巢式通用引物（NUP）共同扩增，但由于本实验采用槽式PCR，因此比较容易得到了所要结果.mRNA自然存在的同聚尾，不需要加尾反应，难度较少，其关键问题是RNA的质量和反转录第一链的长短.该方法关键在于引物设计和PCR条件的优化，同时要考虑所需分离基因mRNA在组织中的丰度［17-20］.本实验选择C 型凝集素基因表达较高的呼吸树组织做实验材料，设计的引物也是尽可能符合优化参数，取得理想效果.在目前的研究当中，仿刺参已经成为中国大陆及沿海地区重要的渔业资源.仿刺参具有巨大的消费市场，目前人们更加注重胶原蛋白的补充，而仿刺参又成为不二之选.除此之外，仿刺参还含有大量的对人体免疫力提高相关的多肽，因此，研究仿刺参的免疫系统及其组成也成了如今研究的热点问题.本文就免疫相关基因C型凝集素进行探讨，得到的带有poly A尾的基因序列，进行SMART预测，已经能够预测出其具有CRD结构域，此结构域为C型凝集素的功能区，为今后的研究奠定了基础.本实验从循环条件，退火温度和引物浓度3个方面对3’RACE实验技术进行了优化，成功地获得了仿刺参中C型凝集素的3’端.首先，变性温度通常为94℃左右，主要取决于扩增片段的长度和（G＋C）比例，达不到变性温度致使变性不完全，是导致PCR失败的常见原因.变性时间一般为30～60s，时间太长不但没有必要反而会因降低酶的活性而影响产量和反应特异性.常用PCR一般为20～40个周期，随着周期次数增加，TaqDNA聚合酶活性降低，聚合时间延长，引物或单核苷酸减少等原因，会造成反应后期容易发生错误碱基掺入.所以在满足产物得率的前提下，应尽量减少周期次数.其次，PCR反应的特异性取决于复性过程中引物与模板的结合，所以退火温度对特异性扩增是非常重要的，退火温度一般位于40～60℃之间.在PCR反应中引物浓度也是影响特异性扩增的一个重要因素，反应中引物浓度在0.2～1μmol的范围内产物累积量基本相同.低于0.2μmol会影响产量，有时甚者无扩增条带产生.但如果过高，则既不经济，又会出现非特异性条带.本实验建议在做扩增反应的时候，一定要考虑好引物浓度对结果的影响.复性的温度越高，其扩增的特异性越高，反之亦然.所以在做PCR反应时，要根据实验所选用的引物确定合适的退火温度，确保实验的准确性.首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1～2℃内进行选择.一般退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往同计算得到的Tm值有较大的差距.参考文献：［1］王锋超，高京生，粟永萍.由EST到全长cDNA—RACE及相关技术进展［J］.生命的化学，2002，22（3）：294－297.［2］沈元月.RACE技术研究进展与展望［J］.生物技术通报，2008（S1）：131－134.［3］FROHMAN M A，DUSH M K，MARTIN G R.Rapid production of full length cDNAs fromrare transcripts：amplification using a single gene specific oligonucleotide primer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，85：8998－9002.［4］韩婧.RACE技术及其研究进展［J］.沧州师范高等专科学校学报，2005，2（21）：91－99.［5］HU MY，LI Q，LI L.Effect of salinity and temperature on salinity tolerance of the sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.The Japanese Society of Fisheries Science，2010，76：267－273.［6］CHEN JX.Present status and prospects of sea cucumber industry in China［M］∥LOVATELLI A，CONAND C，PURCELL S，et al.Advances in sea cucumber aquaculture and management.Rome：Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome，2004：25－38.［7］AHMED H O，KATOW T，KATOW H.Spatiotemporal expression pattern of gonad－stimulating substance－like peptide of the sea cucumber，Apostichopus japonicus［J］.Develop Growth Differ，2011，53：639－652.［8］ZHAO Y，MA H，ZHANG W，et al.E ffects of dietaryβ－glucan on the growth，immune responses and resistance of sea cucumber，Apostichopus japonicus against Vibrio splendidus infection［J］.Aquaculture，2011，315：269－274.［9］YANG A F，ZHOU Z，DONG Y，et al.Expression of immune－related genes in embryos and larvae of sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2010，29：839－845.［10］KOUZUMI N，IMAMURA M，KADOTANI T，et al.The lipopolysaccharide－binding protein participating in hemocyte nodule formation in the silkworm Bombyx mori is a novel member of the C－type lectin superfamily with two different tandem carbohydraterecogniton domains［J］.FEBS Lett，1999，443：139－143.［11］YANG A F，ZHOU Z，HE C B，et al.Analysis of expressed sequence tags from body wall，intestine and respiratory tree of sea cucumber （Apostichopus japonicus）［J］.Aquaculture，2009，296：193－199. ［12］侯林，姜丽娟，孙文静，等.中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化［J］.辽宁师范大学学报：自然科学版，2006，29（4）：466－469.［13］赵献芝，李静，李琴.RACE技术在动物基因克隆中的应用［J］.上海畜牧兽医通讯，2009（4）：50－51.［14］李关荣，鲁成，夏庆友，等.cDNA末端快速扩增技术（RACE）的优化与改良［J］.生命科学研究，2003，7（3）：189－197.［15］明洪，黄秉仁.RACE：cDNA末端快速扩增技术进展［J］.生物工程进展，1997，17（5）：7－13.［16］肖海霞，托乎提·阿及德，田可川，等.用RACE 技术扩增驴DGAT1基因3’端及序列分析［J］.科学研究，2011（20）：1－5.［17］李秋莉，高晓蓉，袁晓东，等.一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3’末端序列［J］.遗传，2002，24（2）：179－181.［18］刘永斌，王峰，田春英，等.用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3’端序列［J］.生物技术，2006，12，16（6）：47－50.［19］骆宁，金凤燮，鱼红闪.RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3’末端的快速扩增［J］.大连工业大学学报，2010，29（3）：171－174.［20］孔凡晶，马有志，陈孝，等.差异显示和 RACE技术的发展与应用［J］.生物技术通报，2003（1）：13－16.。