HPLC

色谱增加柱效、提高灵敏度的小窍门1、提高柱温;2、减小柱内径;3、缩短检测器响应时间;4、减小柱外体积;5、使用超纯硅胶;6、使用高能量氘灯;7、使用中孔透光氘灯;8、改变流动相pH ;9、改变有机相% ;10、改变键合相 ;11、改变有机添加剂 ;12、改变流动相配比方式。

造成色谱峰拖尾的原因及解决办法一、造成色谱峰( 不对称)拖尾的原因1.色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷;2.柱头有污染;3.样品超载;4.样品溶剂不合适;5.柱外效应;6.化学或二次保留(硅羟基)效应;7.缓冲容量不足或不合适;8.重金属污染。

二、如何解决峰形拖尾的问题A. 与化学有关的拖尾问题1.流动相中，加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺;2.如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺);3.降低进样量至<1μg。

B. 与色谱柱有关的拖尾问题1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗;正向柱可用甲醇冲洗;2.使用保护柱。

C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1.进样体积过大，(通常≤25μL);2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm，内径为0.007”);3.检测器流通池的体积过大。

一.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?原因可能有：1泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理;2比例阀失效，更换比例阀即可。

3泵密封垫损坏，更换密封垫即可。

4溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法;5系统检漏，找出漏点，密封即可。

6梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

二.请问HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法"1样品量不足：解决办法为增加样品量2样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器4检测器衰减太多：调整衰减即可。

5检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数6检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。

7检测池中有气泡：解决办法为排气。

8记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。

9流动相流量不合适：调整流速即可。

10检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

三.液相色谱仪色谱柱使用及维护每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!------ 一定得做!新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。

并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。

卡套柱的安装(不加预柱)1.将卡套架套入柱芯2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套(见下图)3.将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片4.将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端6.连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。

不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。

卡套柱的安装(加预柱)1.将卡套架套入柱芯2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯(见下图)3.将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片4.将"子弹头"预柱放入卡套片内5.将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。

请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。

由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。

硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。

如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡如何平衡色谱柱?平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡)色谱柱的再生进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

表1建议用来冲洗的溶剂体积注意：在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围3.避免流动相组成及极性的剧烈变化4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中6.压力升高是需要更换预柱的信号HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。

对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。

清洗方法;①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗;⑧用10%稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。

如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。

除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。

对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。

对内径为4.6mm 的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。

可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：a.由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。

用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

c.含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。

最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

d.流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。

e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能HPLC的常用术语第一部分色谱曲线1、romatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图(ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。

2、(色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。

此主题相关图片如下：此主题相关图片如下：3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线(图1 中的CD)。

4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。

5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离(图 1 中的KL)。