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水质粪大肠菌群的测定

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现行两种水质粪大肠菌群测定方法的比较

现行两种水质粪大肠菌群测定方法的比较

现行两种水质粪大肠菌群测定方法的比较作者：马旭东赵锋来源：《绿色科技》2015年第10期摘要：指出了由国家环境保护总局主持修订的第三版地表水环境质量标准《地表水环境质量标准》（GB3838—2002）2002年4月发布，其中粪大肠菌群也被列为24项基本项目之一。

然而直到2007年3月才由国家环境保护总局发布了行业标准《水质粪大肠菌群的测定多管发酵发和滤膜法》（HJ/T347-2007）（以下简称“行业标准”）。

之前环境监测部门一直都是在使用卫生部发布的《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T5750.12-2006）（以下简称“国家标准”）。

主要通过对这两个标准的异同点的比较，探究了将这两种方法的优点用在实际的环境监测工作中。

关键词：地表水环境质量标准；粪大肠菌群；环境监测中图分类号：X832文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2015）10-0216-021 概述大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌，粪大肠菌群则是大肠菌群的一部分主要来自于粪便，因此粪大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。

国家标准和行业标准中都对粪大肠菌群的检测（多管发酵法）作出了比较详细的规定，现就其两个标准中的异同作出如下探讨。

2 相同点适用范围相同：行业标准和国家标准都适用于地表水、地下水和污水中的粪大肠菌群的检测。

原理相同：多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。

实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠菌群密度和卫生质量的一种方法。

如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。

不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。

酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证

酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证

酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证摘要：本文对《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法》HJ1001 -2018、《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750-2006进行了方法验证，以评价该两种检测方法是否适用于水中粪大肠菌群的检测工作，以确保该方法能够满足水中粪大肠菌群的测定。

关键词：粪大肠菌群；质控样品。

引言：试样与固定底物酶底物法（DST）采用大肠菌群能产生β—半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色的原理，来判断水样中是否含耐热大肠菌群，大肠菌群的培养温度是44.5℃。

1.测定方法与参数（注：方法为酶底物法法，参数为质控样品）2.仪器与设备2.1恒温培养箱2.2冰箱2.3高压蒸汽灭菌锅2.4烘箱2.5量筒2.6吸管2.7程控定量封口机2.8 51孔或97孔定量盘2.9无菌水样瓶（100mL）2.10阳性比色盘2.11干热灭菌器3培养基和试剂3.1无菌水3.2科立德（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基。

4.样品的采集和保存4.1采样前准备：4.1.1采样瓶：高压灭菌瓶。

4.2样品采样及注意事项4.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，无论在什么条件下采样时，均要小心开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染。

4.2.2在采集江，河湖，库，地表水时，可握住瓶子底部直接将采样瓶插入水中，约距水面10-15厘米时，瓶口朝来水方向，使水样灌入瓶内。

如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直至充满水样为止。

采样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。

采样后，采样瓶内上不应留有一些空隙，一边检验前充分混匀水样。

4.2.3从自来水龙头采集样品时，不要选用漏水的水龙头，采水前可先将水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌或用75﹪酒精溶液消毒水龙头，然后将水龙头打开，放水数分钟后除去水管中的滞流杂质。

采水时控制水流速度小心接入瓶内。

4.2.4在同一采样点进行分层采样时，应自上向下进行，以免不同层次的干扰；同一采样点与理化检测项目同时采样时，应先采集细菌等检验样品，否则样品可能被污染，采样前，不得用水样刷洗采样瓶。

多管发酵法测定水质中粪大肠菌群 方法验证11

多管发酵法测定水质中粪大肠菌群 方法验证11

检测分析方法验证报告报告编号:xxxxxxxx方法名称：xxxxxxxxx验证人员：xxx xxx审核人员：xxx验证日期：xxxx年xx月xx日xxxxxx有限公司水质粪大肠菌群的测定多管发酵法一、方法依据本方法依据《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法》（HJ 347.2-2018）用多管发酵法测定水中粪大肠菌群，适用于地表水、地下水、生活污水以及工业废水的粪大肠菌群测定。

本方法的检出限为，12管法为3CFU/L；15管法为20MPN/L。

二、方法原理将待测样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产酸能够使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产气则由倒管指示。

将初发酵中产酸产气的试管进行复发酵接种，44.5℃复发酵培养，复发酵培养基中的胆盐三号能够抑制革兰氏阳性菌生长，最后产气的细菌确定为粪大肠菌群。

通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。

样品采集时可加入硫代硫酸钠溶液消除活性氯对样品的干扰，或加入乙二胺四乙酸二钠溶液消除重金属离子对样品的干扰。

参加验证的人员情况登记表使用仪器情况登记表使用试剂及溶剂登记表三、分析步骤3.1样品稀释及接种3.1.1 15管法3.1.1.1本次15管法选用的待检样品为xx水源水，其接种量分别为10mL、1mL、0.1mL、,在5支装有已灭菌的5mL三倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，按无菌操作要求各加入样品10mL，在5支装有已灭菌的10mL单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，按无菌操作要求各加入样品1mL，在5支装有已灭菌的10mL单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，按无菌操作要求各加入1：10稀释样品1mL。

在做10倍梯度稀释时，按无菌操作吸取10mL充分混匀的待稀释样品，加入到盛有90mL 无菌水的三角瓶中。

3.1.1.2阳性试验：挑取一粒大肠埃希氏菌（ATCC 25922）磁珠置于BHI液体培养液中，24h培养，使之菌悬液浓度在109CFU/mL，用无菌生理盐水按照10倍系列稀释法，稀释至10-7至10-8。

水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 征求意见稿

水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 征求意见稿

水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法征求意见稿
为了保证水质安全，控制疫情传播，本文介绍一种快速测定水质中总大肠菌群和粪大肠菌群的纸片快速法。

一、原理
本方法采用四氯化钴染色，将水样中的大肠杆菌转化为深蓝色紫色的水溶液中的杆菌，然后用过滤纸吸取样品中大肠杆菌杆菌的胞外成分，与专门的涂层结合，形成深紫色的杆菌珠，并进行定量比色分析。

二、材料和方法
1. 带有蓝色涂层的滤纸一支
2. 四氯化钴溶液
3. 水样
方法：
1. 取一片纸片，将其放入含有四氯化钴溶液的水样中，搅拌均匀。

等待5分钟。

2. 用净水彻底清洗纸片，并在滤纸周围波动，使大肠菌群在水中更容易分散。

3. 在处理好的样品中取一滴，用滤纸吸取。

4. 将纸片放入合适的容器中(如管子或托盘)，等待5分钟，直到纸片上形成紫色的结晶。

5. 用比色板或显微镜进行分析测量。

三、结果
根据纸片上杆菌珠的形成特征，可以快速测定水样中的大肠杆菌群和粪大肠菌群含量。

四、注意事项
1. 纸片处理过程中要严格保持无菌，避免外源菌污染。

2. 样品选择要具有代表性，尽量选取水流清澈，色泽透明，入口甜润的水源，避免河流污染或废水回流。

3. 纸片使用后应当严格清洗，避免杆菌珠继续生长。

4. 此方法仅适用于快速初步筛查水质安全，不适用于作为严格的水质监测标准。

方法验证水质的粪大肠菌群

方法验证水质的粪大肠菌群

方法验证报告测试方法：HJ 347.2-2018测试项目：水质粪大肠菌群编写：日期：审核：日期：批准：日期：水质粪大肠菌群的方法验证1.目的确认所采用的方法适合于在本实验室进行对水质的粪大肠菌群的测定，照此方法检测和检验条件进行水样的粪大肠菌群检测，能保证检验结果的准确、可靠。

2.原理和范围2.1原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。

44℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。

通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。

2.2范围本法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。

3.主要仪器3.1 净化工作台。

3.2 立式高压蒸汽灭菌器。

3.3恒温恒湿培养箱。

3.4电热恒温鼓风干燥箱。

3.5电子天平。

3.6酒精灯、试管架、试管（带塞子）、平皿、小倒管、三角烧瓶（带塞子）、刻度吸管、采样瓶、接种环。

4.主要试剂乳糖蛋白胨培养液、EC培养液。

5.检验步骤5.1样品稀释与接种5.1.1 15管法将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品0.1ml。

对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml 、1ml 、0.1ml 。

当样品接种量小于1ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。

按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品，注入盛有90ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成1：10稀释样品。

酶底物法与多管发酵法和纸片法测定水中粪大肠菌群方法比较

酶底物法与多管发酵法和纸片法测定水中粪大肠菌群方法比较

酶底物法与多管发酵法和纸片法测定水中粪大肠菌群方法比较背景介绍随着人口的不断加添和城市化的进程，水诘责题也越来越受到关注。

其中水中粪大肠菌群是判定水质是否达标的指标之一、因此，快速、精准地测定水中粪大肠菌群已成为保障公共卫生和水环境安全的紧要工作。

在测定水中粪大肠菌群时，目前紧要有三种方法：酶底物法、多管发酵法和纸片法。

本文将对这三种方法进行比较，以便选择适合的方法进行水质检测。

酶底物法酶底物法是利用粪大肠菌群分泌的β—D—半乳糖苷酶对其底物苯基—β—D—半乳苷（X—Gal）水解，产生可见的蓝色色素。

实在试验步骤如下：1.接受分光光度计，读取X—Gal水解产生的蓝色产物的吸取值。

吸取值越高，表明样品中粪大肠菌群的数量越多。

该方法具有快速、精准等优点，但存在确定的局限性，比如无法区分大肠杆菌和其他肠道菌，仅仅只能检测粪生源的水体样品。

多管发酵法多管发酵法是利用粪大肠菌群在固体培育基中进行培育，利用二氧化碳生成的压力变化判定粪大肠菌群的数量。

实在试验步骤如下：1.将含有气管的玻璃管一端紧贴于固体培育基上。

2.向不同的玻璃管中分别加入不同的水样，并进行固体培育。

3.通过察看玻璃管顶端气泡的产生和数量，判定样品中粪大肠菌群的数量。

该方法不仅可以检测含有粪便的水产品中的粪大肠菌群，而且适用范围广，可以检测非点源污染和净化污水等水产品中的粪大肠菌群，但操作多而杂、时间较长。

纸片法纸片法是将覆盖了0.5～1.0 ml水体样品的纤维素纸分别带入含有荧光素β—D—葡萄糖苷（MUG）的细菌培育基中，然后在黑暗中孵育后，通过紫外线灯照射MUG荧光显带样品，察看荧光显带情况，得出粪大肠菌群数量。

实在试验步骤如下：1.制备含有MUG的培育基。

2.将确定数量的水样加入到带有MUG的培育基中并进行培育。

3.在黑暗中察看培育基上产生的荧光显带情况，得出样品中粪大肠菌群的数量。

该方法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也有局限性，例如无法检测混合大肠杆菌和其他的大肠杆菌感染和污染的水样。

水质粪大肠菌群的测定

水质粪大肠菌群的测定

14 测定步骤
• 1. 水样接种量的选择
• 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度 确定水样接种量。每个样品至少用三个不 同的水样量接种。同一接种水样量要有五 管。
• 相对未受污染的水样接种量为10ml、1 ml、 0.1 ml。受污染水样接种量根据污染程度接 种1 ml、0.1 ml、0.01 ml、或0.1 ml、 0.01 ml、0.001 ml等。
• 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于 含有 玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌 器中，115℃高压灭菌器中灭菌20min，灭 菌后pH应为。
13 培养基的存放
• 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放 在大气湿度低，温度低于30摄氏度的 暗处，存放时应避免阳光直接照射， 并且要避免杂菌倾入和液体蒸发。当 培养液颜色变化，或体积变化明显时 应废弃不用。
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单倍乳糖蛋白胨培养液：
• 将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节 溶液pH 为，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃ 高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备 用。
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三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：
将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为，再加入1.
而定。 轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转移到EC培养液中。
9 培养基及试剂
• 本标准所用试剂除另有说明，均为符合国 家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新 制备的去离子水。
接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接种时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。
示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验 接种1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。

水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法HJ 347.1-2018

水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法HJ 347.1-2018

中华人民共和国国家环境保护标准HJ 347.1-2018部分代替HJ/T 347-2007水质粪大肠菌群的测定滤膜法Water quality—Determination of fecal coliform—Membrane filtration（发布稿）本电子版为发布稿。

请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。

2018-12-26 发布2019-06-01 实施生态环境部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3术语和定义 (1)4方法原理 (1)5干扰和消除 (1)6试剂和材料 (2)7仪器和设备 (2)8样品 (3)9分析步骤 (3)10结果计算与表示 (5)11精密度和准确度 (6)12质量保证和质量控制 (6)13废物处理 (7)14注意事项 (7)附录A（资料性附录）粪大肠菌群检验记录及报告格式 (8)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水中粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。

本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的滤膜法。

本标准是对《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T 347-2007）滤膜法部分的修订。

本标准首次发布于2007年，原起草单位为中国环境监测总站。

本次为第一次修订。

本次修订的主要内容如下：——完善了方法原理的表述；——增加了检出限；——增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节；自本标准实施之日起，《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T347-2007）废止。

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。

本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。

本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、铁岭市环境保护监测站和沈阳市疾病预防控制中心。

水中粪大肠菌群测定方法的比较研究分析

水中粪大肠菌群测定方法的比较研究分析

水中粪大肠菌群测定方法的比较研究分析湖南衡阳421200摘要:多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法是目前国内测定水中粪大肠菌群的常用标准方法。

分别从方法的检出限、方法操作、准确度和方法间的一致性四个方面对水中粪大肠菌群的测定进行了对比研究，总结出各方法的适用范围和优缺点，为分析人员根据实际条件和水样类型选择最佳方法提供参考。

关键词:粪大肠菌群;酶底物法;多管发酵法;滤膜法;纸片快速法粪大肠菌群是在 44．5℃ 温度下能生长并发酵乳糖产酸，产气，需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来自粪便。

粪大肠菌群又称耐热大肠菌群，可以指示水体是否遭受粪便污染，直接指示生活污水的污染，间接反映肠道致病菌的污染风险，是水质检验中非常重要的卫生指标。

目前，国内测定水中粪大肠菌群的标准分析方法有多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法。

多管发酵法早在 1985 年就列入了《生活饮用水标准检验方法》( GB 5750 －85) ，至今已经沿用了三十多年，是行业内公认的粪大肠菌群测定的经典方法，卫生、水利、环保等行业均有多管发酵法的方法标准。

美国公共卫生协会( APHA) 出版的《水和废水标准检验方法》( 20 版) 中方法 9221E 也采用的是多管发酵法; 滤膜法采用直接计数特征菌落的方式，不同于其它三种方法采用 MPN 法计数，其应用广泛性仅次于多管发酵法，美国 APHA 方法9222D和ISO9308 － 1: 2014采用的是滤膜法; 纸片快速法在西方发达国家采用较少，主要在一些发展中国家使用，环保部在 2015 年发布了测定水中粪大肠菌群的纸片快速法; 酶底物法利用粪大肠菌群在邻硝基苯－β － D －吡喃半乳糖苷培养基上培养产生β － D －半乳糖苷酶，该酶可以分解色源底物释放出黄色的邻硝基苯酚，通过颜色变化定性，MPN 法定量。

我国没有酶底物法测定粪大肠菌群的现行国家和行业标准，美国APHA 方法 9221 E、ISO 9380 － 2: 2012 和 GB5750． 12 －2006均将酶底物法列入标准，但仅限测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌。

水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法

水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法

水质粪大肠菌群的测定滤膜法1. 适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。

本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。

2. 原理滤膜是一种微孔性薄膜。

将水样注入已灭菌的放油滤膜的率其中，经过抽虑，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。

3. 培养基与试剂3.1 MF-C培养基成份：A 胰胨10gB 多胨5gC 酵母浸膏3gD 氯化钠5gE 乳糖12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)G 琼脂15gH 苯胺蓝0.2gI 蒸馏水1000mL制法：在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。

制好的培养基应存放于2～10℃，不超过96h。

本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。

3.2 EC培养基成份：A 胰蛋白胨20gB 乳糖5gC 3号胆盐或混合胆盐1.5gD 磷酸氢二钾4gE 磷酸二氢钾1.5gF 氯化钠5gG 蒸馏水1000mL制法：将上述成份溶解于蒸馏水中，分装到带有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，最终pH为6.9±0.2。

4. 仪器隔水式恒温培养箱或恒温水浴。

塑料培养皿：60mm×15mm或50mm×12mm。

其他仪器同总大肠菌群滤膜法。

5. 步骤准备工作：5.1 滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。

前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。

水环境监测中粪大肠菌群测定的质量保证与质量控制

水环境监测中粪大肠菌群测定的质量保证与质量控制
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水环境监测中粪大肠菌群测定的质量保证与质量控制
张绍华 李 育彬 ｚ （ １ 、 辽宁省环境监测 实验 中心， 辽宁 沈 阳 １ １ ０ １ ６ １ ２ 、 沈阳军区工程环境质量监督站 ， 辽 宁 沈阳 １ １ ０ １ ６ Nhomakorabea１ ）
摘
要： 结合 水环境 中粪大肠茵群 的监 测实践 ， 从监测技 术人 员、 实验 室仪器设备 、 供应品质量 、 检测 能力水平及质量控制等监 测过
程 的质 量 保 证 方 法做 了一 些 探 讨 。
关键词 ： 粪大肠 茵群 ； 监测 ； 质量控制 ； 质量保证 在地表水环境质量标准 中粪大肠菌群监 测是 １ ０ ９项地 表水监 表 １精密度判断值 的计算
测因子中唯一一项微生物监测指标 ， 目前 ， 采用的测 定方 法是《 水质 粪大肠菌群的测定多个发酵法和滤膜法》 （ Ｈ Ｊ ／ Ｔ ３ ４ ７ — ２ ０ ０ ７ ） ，由于该 方法 中对监测结果 的影响 因素较多 ， 因此 加强粪大肠 菌群监 测的质 量控制与质量保证是 十分必要 的。本文就水 中粪大肠茵群的监测 ， 从监测技术人员 、 实验室仪 器设备 、 供应品质量 、 检测能力水 平及 质
１ ． ２对采样人员的要求 。采样人员一定要严格按照采样 的操作 步骤及质量保证和质量控制技术规定进行采样。 ２实验室内部的质量保证【 １ 取待测水样 中的 １ ０ ％， 做双样分析。当对数值 的差值大于 ３ ． ２ ７ ２ ． １ 实验室仪器设备 的质量保证 （ 精密度判据 ） 时， 表示 试验的精度 已失控 （ 用… Ｕ’ 表示 ） ， 须 废弃 ａ ． 粪大肠菌群监测过程中所用 的温湿度计 、 天平 、 ｐ Ｈ计 、 恒温培 自上一次精 密度 检查之后 的双样试 验结果 ，并找 出原因加 以纠正 养箱等仪器设 备每年至少 由有资质 的部 门按照 国家标 准检定或校 后 ， 方 可继续监测水样 ； 当对数值 的差值小 于 ３ ． ２ ７ Ｒ（ 精密度判据 ） 验一次 ， 并将检 定或校验 结果存档 。ｂ ． 高压蒸 汽灭菌器如果容积超 时 ， 表示试验结果可 以接受（ 用“ Ａ” 表示 ） 。 监测人 员要定期用最新获 过５ ０ Ｌ ， 应按特种设 备进行安全管理 。每次使用时要记录温度 、 气压 得 的 １ ５ 对双样试验数据计算 出最新的精密度判据值 ３ ． ２ ７ ， 用以 和灭菌时间 。应能提供均匀的高达 １ ２ １ ℃的高压灭菌温度 ， 每月可 比较和检查控制精 密度 的程度 。 用芽孢试条和芽孢悬浮液或特制的热变色滤纸条检查灭菌效果 。 ３ ． ３稀释试验 的质量控制。对例行监测 ， 应取 １ ０ ％的阳性水做完 ２ ． ２实验室供应 品的质量 保证 成 试验 ， 如果饮用水的水样没有 阳性 结果 ， 则至少每季度 对一个 阳 ２ ． ２ ． １ 配制 的培养基质量控制 。 ａ ． 测定粪大肠 菌的培养基 中含有 性水源水样做完成试验。 乳糖 成分 ， 所 以高压灭 菌时温度 一定要控制 在 １ １ ５ ℃以下 ， 如果 压 对受 细菌 污染严重 的水体样 品 ， 如果在初发 酵试 验 中未发现产 力 温度 过高培养基 中的乳糖极 易分解 ， 造 成培养基养分不 足 ， 从 而 气 ， 则 应将其继续 培养到 ４ ８ ｈ ， 然后再进一 步证实 有无大肠 菌类 细 影 响粪 大肠菌生长。ｂ ． 每批培养基在使用前 ， 需经无菌试验 ， 阳性和 菌 。 阴性对 照培养试验 ， 符合要求后方可使用 。 ｃ ． 配制好的培养基不宜放 ３ － ４滤膜试验的质量控制 置过 久 ， 以 少 配 勤配 为宜 。 ａ ． 对每一类 型水样 的检验 ， 监测人员 至少 要每月取 一 已知 阳性 ２ ． ２ ． ２ 玻璃器皿的质量控制 ｏ ａ ． 玻璃器皿应采用硼硅玻璃制品。 ｂ ． 的水样核实菌落 ， 要对 同一 阳性水样在 同一滤膜上就典 型菌落进行 玻璃器皿洗涤后 ， 应沥干后再用。对新购置 的玻璃器皿 ， 应先在 ２ ％ 计数 ， 以核实滤膜上 的菌落 ， 并 比较各监测人员的操作。ｂ ． 核实粪大 盐酸 中浸泡 数小时 ， 然后用 自来水 冲洗 干净 ， 再 用蒸馏水 冲洗 １ － ２ 肠菌群时 ， 要从滤膜挑取 至少 １ Ｏ个典型的蓝色或蓝绿色单个菌落 ， 次， 沥干后再用 。ｃ ． 玻璃器 皿的灭菌通常使用高压蒸 汽灭菌或干热 接种 于 胆汁 一七 叶苷 一叠 氮化 物琼 脂 培养 基上 ，经 ４ ４ ． ５ ℃培 养 灭菌 ， 无论采用哪种 方法 ， 都应严格按照操作规程进行 ， 以免玻璃器 ２ ４ ｈ ， 检查有无产气 ， 如有气体产生 ， 即证实 为粪大肠菌 。 皿因骤 冷或压力不均而爆裂。 ４ 结 果 与 分 析 ３ 粪大肠菌群监测的实验室质量控制方法圜 ａ ． 微生物检 验需 要实验人员 具有 熟练 的操作 技能 、 专业知识 及 粪大肠菌群监测 的质 量控制方法通 常采用无菌性检 测和精密 丰 富的实际经验 ， 以便 对结果作 出正确 的判 断 ； ｂ ． 培养 基高温 灭菌 度检验法。 对例行监测 ， 要做稀 释试验和滤膜试验 的质量控制 ， 以确 时 ， 要控制好灭菌温度 ， 避免温度过高造成乳糖分解 ， 从而影响粪大 保监测结果 的准确性 。 肠菌群的生长 ； 每批培养基在使用 前 ， 需经无菌检验 ， 符合要求后方 ３ ． １ 无菌性检验。 每次试验 时， 要以无菌水为水样 ， 检查培养基 、 可使用 。选择符合要求 的玻璃器皿。ｃ ． 细菌学监测质量控制方法采 滤膜 、 稀释水 、 冲洗用水 、 玻璃 器皿及其 他器具的无菌性 。如检查结 用无菌性检测和精密度检验法 ， 可 以对试验条件 、 实验设备 、 试验用 果表明有杂菌污染 ， 则相应的做灭 菌处 理 ， 处理后进行无菌性检验 ， 器皿 、 培养基 、 实验用 水及操作人员 等各方 面进行 质量控制 ， 以确保 直至符合要求后方可使用 。 细菌监测数据的质量 。对例行监测 ， 要做稀释试验和滤膜试验 的质 ３ ． ２ 精 密度检验 。在 同类 同批水样 中， 选 出最先 的 １ ５个阳性水 量 控制 ， 以确保 监测结果 的准确性 。 样 由同一实验人员做平行双样分析 ， 以求得该实验室的精密度判断 参考 文献

多管发酵法测定水质 粪大肠菌群应注意的问题

多管发酵法测定水质 粪大肠菌群应注意的问题

LOW CARBON WORLD2020/12节能环保多管发酵法测定水质粪大肠菌群应注意的问题庄小玲（漳州市漳浦环境监测站，福建漳州363200）【摘要】《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法渊HJ347.2—2018）》是检测粪大肠菌群的常用标准方法。

本文从恒温培养箱校准确认、培养基制备、样品采集、样品保存和样品分析等实验全过程中应注意的问题提出个人的几点体会,供大家探讨。

【关键词】粪大肠菌群；多管发酵法；实验分析【中图分类号】X832【文献标识码】A【文章编号］2095-2066（2020）12-0019-02粪大肠菌群是指在44.5益下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群，主要来源于人畜的粪便。

通过对粪大肠菌群的测定，可以了解水体受粪便污染的程度。

粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法、滤膜法、酶底物法、纸片快速法。

目前环境监测机构一般主要采用行业标准《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法（HJ347.2—2018）》多管发酵法测定粪大肠菌群，该标准方法于2018年12月26日通过生态环境部批准，自2019年6月1日起实施叫本文从恒温培养箱校准确认、培养基制备、样品采集、样品保存和样品分析等实验全过程中应注意的问题提出个人的几点体会,供大家探讨。

1恒温培养箱校准确认多管发酵法测定粪大肠菌群标准方法中仪器设备规定恒温培养箱的允许温度偏差37±0.5益、44±0.5益。

笔者实验室委托市计量所对恒温培养箱37.0益、44.5益两个温度进行校准（依据国家质量监督检验检疫总局发布的JJF1101—2003 环境试验设备温度、湿度校准规范）,校准结果如表1所示，计量所对恒温培养箱9个校准点进行校准，校准证书给出温度偏差和温度均匀度两个参数。

温度偏差反映的是恒温培养箱设备显示温度与中心点n次测量的平均值的差值，可以通过改变设定值温度,使之被修正;均匀度反映的是各校准点测得的最高温度和最低温度之差的算术平均值，可以对恒温培养箱局部限制使用。

水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定原始记录

水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定原始记录
有限公司
年 月 日颁布
- -J177 水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定原始记录 第 页共 页
项目编号
温度（℃）
湿度(%RH)
分析方法 水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 HJ 755-2015[检出限：20MPN/L]
仪器名称
检测仪器
恒温培养箱 恒温培养箱
压力蒸汽灭菌器
仪器型号
仪器编号
备注
葡萄球菌，粪大肠菌群阳性对照为大肠埃希氏菌，阴性对照为产气肠杆菌。
[＋阳性 －阴性]
检测：
复核：
日期：
年月日
测定样品信息[样品种类：废水 地表水 其他
]
样品编号 样品接种量 Q
ห้องสมุดไป่ตู้样品
样品包装 密封良好 其他
总大肠菌群 阳性对照 阴性对照
粪大肠菌群 样品 阳性对照 阴性对照
空白 对照
mL×5
mL×5
mL×5
MPN 值 M -
(MPN/100mL)
报告值 C -
(MPN/L)
空白对照为纯水，总大肠菌群阳性对照为大肠埃希氏菌，阴性对照为金黄色
公式：
式中：
C 100 M Q
C：水样总大肠菌群或粪大肠菌群
浓度（MPN/L）；
M：查 MPN 表得到的 MPN 值
(MPN/100mL)；
Q：实际水样最大接种量(mL)；
100：为 10×10mL,其中,10 将 MPN 值
的单位 MPN/100mL 转换为 MPN/L,
10mL 为 MPN 最大接种量。

水质总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数监测技术规范

水质总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数监测技术规范

水质总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数监测技术规范1 范围本文件规定了水中总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数的术语和定义、采样技术要求、分析技术要求、质量控制要求、监测记录、注意事项等技术内容。

本文件适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数的监测。

2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 14848 地下水质量标准GB 3838 地表水环境质量标准HJ 1000 水质细菌总数的测定平皿计数法HJ 1001 水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法HJ 164 地下水环境监测技术规范HJ 347.1 水质粪大肠菌群的测定滤膜法HJ 347.2 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法HJ 630 环境监测质量管理技术导则HJ 755 水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范HJ 91.1 污水监测技术规范3 术语和定义3.1 总大肠菌群 total coliforms参照HJ 755定义为：37℃培养，24 h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。

3.2 粪大肠菌群 fecal coliforms又称耐热大肠菌群（thermmotolerant coliforms ），参照HJ 755定义为：44.5℃培养24 h，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽抱杆菌。

3.3 细菌总数 total bacteria参照HJ 1000定义为：36℃培养48 h，样品在营养琼脂上所生长的需氧菌和兼性厌氧菌菌落总数。

4 采样技术要求14.1 样品采集4.1.1 地表水附近有桥梁的河流断面宜在桥上采样，湖库点位和水体较深的河流断面宜采用船只采样，水深较浅的河流断面宜涉水采样，按照HJ/T 91的相关规定执行。

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2 水中微生物简介
• 自然界的水可分为地下水和地面水，除了 地下深层水外，如湖泊，河流，海洋等各 种地面水中都存在着各种各样的微生物。 但它们所含的微生物种类，数量和分布都 不相同。其中有些是“土生土长”的。另 一些水生细菌是外来的，它们来自土壤， 空气，垃圾，工厂废物或城市下水道污水。 而来自下水道的微生物中，很可能含有人 体肠道致病菌，例如霍乱，伤寒，副伤寒 和痢疾等病原菌。
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举例：
• 某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种 1mL 的5 管中有2 管为阳性；接种1：10 的 水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数 （MPN）表中查检验结果5-2-0，得知 100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故 1L 水样中的总大肠菌群数为49×10=490 个。
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• 如果接种的水样量不是10mL、1mL 和 0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样 量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公 式换算成每100mL 的MPN 值。
表2 大肠菌群检数表
接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份)
18
38
25 注意事项
• • • • • 灭菌 初发酵后以有阴、有阳稀释效果最好。 水样一定要摇均。 每个稀释倍数要求做5管。 接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接 种注意：
• 加入水样时，先将培养管管口用酒 精灯消毒一次，加入水样后再用酒 精灯消毒一次，封口。
18 • 阳性的判别：既产酸又产气： • 观察：24h小时后取出观察培养 管，颜色由紫色变为黄色和有 气泡产生两个方面才能判为阳 性
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3. 复发酵试验
• 轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管， 用3mm接种环或灭菌棒将培养物转移到EC 培养液中。在44.5℃±0.5℃下培养 24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养 基液面）。接种后所有发酵管必须在30分 钟内放进水浴中。培养后立即观察，发酵 管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
4 污水的细菌学检验
•
水质的细菌学检验主要包括两个 常规项目：细菌总数和总大肠菌群。
5 总大肠菌群测定的两种方法
• 多管发酵法 • 滤膜法
6 粪大肠菌群的定义
• 粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，主要 来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳 糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。 用提高培养温度的方法，造成不利于来自 自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养 出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群， 从而更准确地反映出水质受粪便污染的情 况。
11 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：
• 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。 除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。 （即按上述配方比例三倍（除蒸馏水外）， 配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液）
12 EC培养液：
• 成分： 胰胨 20克， 乳糖 5克， 胆盐三号 1.5克，磷酸氢二钾（K2HPO4）4克，磷酸 二氢钾（KH2PO4）1.5克，氯化钠5克，蒸 馏水1000毫升。 • 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于 含有 玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌 器中，115℃高压灭菌器中灭菌20min，灭 菌后pH应为6.9。
13 培养基的存放
•
在密封瓶中的脱水培养基成品要存放 在大气湿度低，温度低于30摄氏度的 暗处，存放时应避免阳光直接照射， 并且要避免杂菌倾入和液体蒸发。当 培养液颜色变化，或体积变化明显时 应废弃不用。
14 测定步骤
• 1. 水样接种量的选择 • 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度 确定水样接种量。每个样品至少用三个不 同的水样量接种。同一接种水样量要有五 管。 • 相对未受污染的水样接种量为10ml、1 ml、 0.1 ml。受污染水样接种量根据污染程度接 种1 ml、0.1 ml、0.01 ml、或0.1 ml、 0.01 ml、0.001 ml等。
9 培养基及试剂
• 本标准所用试剂除另有说明，均为符合国 家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新 制备的去离子水。
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单倍乳糖蛋白胨培养液：
• 将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节 溶液pH 为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫 乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中， 于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于 冷暗处备用。
20 结果的计算
• 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果 的数目，从表2或表3中查得每升水样中的 粪大肠菌群。 • 接种水样为100ml 2份，10ml 10份，总量 300ml 时，查表2可得每升水样中粪大肠菌 群； • 接种5份10ml 水样，5份1ml水样，5份 0.1ml水样时，查表3求得MPN指数，MPN 值再乘10，即为1升水样中的粪大肠菌群；
7 适用范围
• 本标准适用于地表水，地下水 及废水中粪大肠菌群的测定。
8 原理
• 多管发酵法是以最可能数（most probable number），简称MPN 来表示试验结果的。实际 上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌 密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑， 并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有 大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管 重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含 量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显 示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验 所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度 而定。
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• 培养液的浓度和量的选择：
• 如接种体积为10 ml，则试管内应装有三倍 浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为 1mL或少于1mL，则可接种普通浓度的乳糖 蛋白胨培养液10mL中。
16 2. 初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨 培养液的发酵管中。在 37℃±0.5℃下培养24h±2h。产 酸和产气的发酵管表明试验阳性。 入在倒管内产气不明显，可轻拍试 管，有小气泡升起的为阳性。
26 思考题
• 配制好的培养基保存多少时间？存放时应 注意哪些事项？
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• 答：配制好的培养基不宜保存过久，以少 量勤配为宜。已灭菌的培养基可在4—100C 存放一个月。存放时应避免阳光直射，并 且避免杂菌侵入和液体蒸发。
28 填空题
0C 1. 细菌采样玻璃瓶洗涤干燥后，要在 0C灭菌 干热灭菌 或高压蒸汽 min。 • 2. 对受污染严重的水体，可选择 方法 测定其总大肠菌群数。 • 3. 总大肠菌群测定过程的复发酵试验中， 0C温 接种完菌落后，应将发酵管置于 度下培养 h。 • 4. 复发酵试验使用 培养基。
29
• 计算题： • 某水样接种10mL 的5 管中有4管 为阳性；接种1mL 的5 管中有3 管 为阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管中有1管为阳性。求1L 水样 中的总大肠菌群数为多少？