SOD测定方法

SOD活性的测定一、酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

二、S OD的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用。

（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用,避光保存。

(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，同上(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。

避光保存。

同上SOD反应混液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为1.5：0.3：0.3：0.3：0.25，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素0.3ml和酶液50微升。

2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取50微升的酶液，4000Lux照光30分钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以空白调零，560nm比色。

每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5 ×Vt×A CK）单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。

SOD_测定方法SOD（Superoxide Dismutase）是一种重要的抗氧化酶，它可以将有害的超氧自由基转化为氧和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。

SOD的测定方法有多种，下面将介绍常用的几种方法。

1.超氧根自由基抑制法：该方法通过测定SOD对超氧自由基的抑制能力来测定SOD的活性。

超氧根自由基在存在特定底物的条件下，可以引起化学反应的颜色变化，通过测量这种变化的幅度可以得出样品中SOD的活性。

超氧根自由基抑制法具有可操作性强、结果可靠的特点，是常用的SOD活性测定方法之一2.X射线法：该方法利用X射线产生的自由基对辅酶A的氧化程度来测定SOD活性。

辅酶A在被氧化前后，有很大的吸收差别，可以通过比较吸收光谱来计算SOD活性。

3.含氮蓝法：含氮蓝为特定底物，可以在碱性条件下与还原型NBT（硝基蓝）产生紫色的还原型NBT。

SOD能够阻止NBT的还原反应，因此通过测量样品和对照组在一定时间内的吸光度差值，可以计算出SOD的活性。

4.电化学法：该方法利用电化学生物传感器对SOD的电化学反应进行测定。

在电极表面，SOD催化还原型O2为H2O2，而H2O2又在电极表面电催化为电流。

通过测量电流的大小，可以得出样品中SOD的活性。

这些方法各有优缺点，选择合适的测定方法应根据实验条件和目的来确定。

无论采用何种方法，都需要严格控制实验条件，如温度、时间、pH 值等，以确保测定结果的准确性和可重复性。

鉴于SOD活性在不同组织和物种之间有所差异，建议在研究中同时采用多个测定方法进行验证，以获得更可靠的结果。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。

5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。

%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。

活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。

样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。

在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

sod测定原理
SOD测定原理是通过测量超氧化物岐化酶（SOD）的活性来
评估细胞内抗氧化能力的一种方法。

SOD是细胞中一种重要
的抗氧化酶，能够将有害的超氧自由基转化为较为稳定的过氧化氢和氧气，从而保护细胞免受氧化损伤。

测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的是基于SOD能够催化黄嘌呤（pyrogallol）的氧化反应。

在碱性条件下，黄嘌
呤可以被超氧自由基氧化为紫色产物。

SOD的活性越高，产
生的紫色产物越少。

为了测定SOD活性，首先需要制备一定浓度的黄嘌呤溶液，
通常是0.1%的黄嘌呤溶液。

将样品（如细胞提取物）与黄嘌
呤溶液混合，然后加入稍微碱性的缓冲液，使整个混合物的
pH在9-10之间。

接下来，需要在适当的温度下孵育一段时间（通常是37°C），以使SOD与黄嘌呤发生反应。

在孵育过程中，黄嘌呤将被氧化，产生紫色产物。

孵育结束后，加入醋酸停止反应。

最后，通过分光光度计测量溶液的吸光度值。

SOD活性高的
样品，反应过程中产生的紫色产物较少，吸光度值较低；而SOD活性低的样品，反应过程中产生的紫色产物较多，吸光
度值较高。

根据吸光度值的差异，可以计算出样品中SOD的活性。

通常
会与一个已知活性的SOD标准品进行比较，从而得出样品中
SOD的相对活性。

这样就可以评估细胞内的抗氧化能力及SOD活性的变化情况。

总的来说，SOD测定原理是基于黄嘌呤的氧化反应，通过测量产生的紫色产物的吸光度值来评估SOD的活性。

SOD酶活性测定方法SOD（超氧化物歧化酶）是一种重要的抗氧化酶，通过催化O2.-的自动氧化为O2和H2O2来清除有害氧自由基。

SOD的活性能够反映生物体内清除氧自由基的能力，因此SOD活性的测定对于研究氧自由基相关疾病以及抗氧化剂的评价具有重要意义。

以下是目前常用的几种SOD活性的测定方法：1. Nitroblue tetrazolium (NBT)法：这是最早用于测定SOD活性的方法之一、该方法基于超氧自由基能够氧化NBT成为紫色的甲胺蓝（blue formazan）。

SOD能够阻止NBT的氧化过程，从而减少blue formazan的产生。

测定时，试样中的NBT和蛋白质混合后加入酶底物，通过测定产生的blue formazan的吸光度来评估SOD的活性。

2. epinephrine autoxidation法：该方法基于SOD能够催化抑制肾上腺素自动氧化反应，从而测定其活性。

肾上腺素在氧气存在下会自动氧化生成可见光吸收的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程，减少可见光吸收的产生。

通过测定反应体系中可见光吸收的变化来评估SOD的活性。

3. Pyrogallol autoxidation法：该方法与上述方法类似，基于SOD能够催化抑制邻二氧苯酚（pyrogallol）自动氧化反应，从而测定其活性。

邻二氧苯酚在氧气存在下会自动氧化生成氧的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程。

通过测定反应体系中氧的产生速率或者邻二氧苯酚消耗速率来评估SOD的活性。

4. Xanthine oxidase法：该方法基于SOD能够催化脲酶氧化邻位双黄嘌呤（xanthine）生成尿酸，而脲酶则通过XOD（xanthine oxidase）作用于氧气生成邻位双黄嘌呤的过程来实现。

由于SOD能够清除产生的超氧自由基，从而减少尿酸的生成。

通过测定尿酸产生的速率来评估SOD的活性。

这些方法各自具有一定的优缺点，研究者们需要根据实际需要选择合适的方法来测定SOD活性。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。

在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx 日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。