真菌蛋白提取方法

菌dna提取方法
菌DNA提取方法主要有以下几种常用的方法：
1. 热裂解法：将菌株经过培养后，取一部分菌体加入到含有蛋白酶K和SDS等裂解液的管内，经过高温加热和高速离心等步骤，将细胞裂解，使DNA释放到溶液中。

2. 真菌细胞壁裂解法：对于真菌等含有较坚硬的细胞壁的菌株，可以先用混合酶或纤维素酶等酶解细胞壁，然后再用热裂解法或理化方法提取DNA。

3. CTAB方法：CTAB（盐基洗脱法）常用于提取高质量的食管菌和黄杆菌等高GC含量的菌株DNA。

首先，将菌体经过裂解后，使用CTAB裂解液中的盐离子与DNA结合形成沉淀，然后通过洗脱步骤将DNA纯化。

4. 醋酸盐方法：醋酸盐方法适用于提取低GC含量的菌株DNA。

将菌体经过裂解后，通过添加醋酸盐裂解液，使DNA与醋酸和盐结合成为可溶性复合物，后续通过酒精沉淀等步骤将DNA沉淀出来。

5. 商业化基因提取试剂盒：市面上还有许多商业化的基因提取试剂盒，这些试剂盒提供了一套完整的操作流程和试剂，能够方便快速地提取和纯化菌DNA。

不同的菌株和研究目的可能需要使用不同的提取方法，因此在选择提取方法时需
要根据具体情况进行选择。

人造肉的制备方法人造肉是指通过生物技术手段，将植物蛋白、真菌蛋白或动物细胞培养而成的肉类替代品，因其具有可比拟的口感和营养成分，备受市场青睐。

下面，我们将介绍几种常用的人造肉制备方法。

一、植物蛋白制备植物蛋白是目前人造肉中被广泛使用的原料之一，它的制备过程如下：1. 植物蛋白素提取：将大豆、豌豆等植物蛋白素原料加入水中，经浸泡、过滤、沉淀、干燥等步骤，提取出植物蛋白素。

2. 蛋白素加工：将植物蛋白素加入调味料、油脂等辅料中，通过混合、搅拌、挤压等加工工艺，形成肉类的口感和纹理。

植物蛋白制备的优点在于所使用的原料广泛、生产过程简单、成本较低；缺点在于口感和营养成分与真正的肉类差距较大。

二、真菌蛋白制备真菌蛋白是一种从菌类中提取的蛋白质，其制备过程如下：1. 培养真菌菌体：在适当的温度、湿度和营养环境下，将真菌培养成菌体。

2. 提取蛋白质：将菌体经过菌体打破、蛋白质分离等步骤，提取出真菌蛋白。

3. 蛋白质加工：将提取出的真菌蛋白加入调味料、油脂等辅料中，通过混合、搅拌、挤压等加工工艺，形成肉类的口感和纹理。

真菌蛋白制备的优点在于口感和营养成分与真正的肉类相似、成本较低、易于控制生产过程；缺点在于资源较为有限。

三、细胞培养肉制备细胞培养肉是指通过体外培养动物细胞，使其分化为肌肉细胞，最终制备出与真正肉类相似的产品，其制备过程如下：1. 细胞获取：从动物肌肉中获取一定数量的细胞，如肌肉皮层细胞等。

2. 细胞培养：在适宜的培养环境中，添加合适的激素、营养物质等，使细胞进行分化、增殖。

3. 三维培养：将分化好的细胞放在类似肌肉的三维结构中，如使用胶原蛋白、纤维蛋白等构建的支架。

4. 肉质生成：随着细胞的生长和分化，三维结构中的细胞越来越多地类似与肌肉细胞，最终形成肉质组织。

细胞培养肉制备的优点在于不需要大量的饲料、水资源，减少对环境的污染，成本也在不断降低；缺点在于技术难度大、生产周期长、工艺复杂。

四、总结随着人类越来越重视健康和环保，人造肉的应用也在快步发展。

收稿日期:２０１８－１１－０１㊀㊀修回日期:２０１８－１２－０３基金项目:农业高校产学合作项目(２０１８Ｎ５００５).作者简介:张玮玮(１９９３－)ꎬ女.研究方向:天然产物农药.Ｅｍａｉｌ:ｗｅｉｗｅｉｚ２０１０＠ｑｑ.ｃｏｍ.通信作者叶秀娟(１９６８－)ꎬ女ꎬ教授ꎬ博士.研究方向:天然产物活性物质.Ｅｍａｉｌ:ｘｉｕｊｕａｎｙｅ２００４＠ｇｍａｉｌ.ｃｏｍ.诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性张玮玮ꎬ袁素素ꎬ王财成ꎬ叶秀娟(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室ꎬ福建福州３５０００２)摘要:通过柱层析技术从诸葛菜种子中分离抗真菌蛋白ꎬ并采用纸片扩散法㊁琼脂平板稀释法和凹玻片法对抗真菌蛋白的抑菌活性和稳定性进行研究.结果表明:从诸葛菜种子中分离出一种分子质量约为１０ｋｕ的抗真菌蛋白ꎬ命名为Ｚｐꎻ经ＱＥ质谱鉴定ꎬＺｐ蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白.Ｚｐ蛋白对１１种植物病原真菌均具有较强抑制作用ꎬ其中对尖孢镰刀菌生长的半抑制浓度(ＩＣ５０)为５４.３６μｇ ｍＬ－１ꎬ对其孢子萌发的ＩＣ５０为１５.９７μｇ ｍＬ－１.Ｚｐ蛋白的抑菌活性在温度０~１００ħ和ｐＨ１~１４的范围内稳定ꎬ其对有机溶剂(１５％甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚和丙酮)和金属阳离子(５０~２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｍｇ２＋㊁Ｋ＋㊁Ｍｎ２＋和Ｃａ２＋)也具有较强的耐受力.关键词:诸葛菜ꎻ抗真菌蛋白ꎻ纯化ꎻ抑菌活性ꎻ稳定性中图分类号:Ｓ４８２.１文献标识码:Ａ文章编号:１６７１￣５４７０(２０１９)０３￣０２９６￣０７ＤＯＩ:１０.１３３２３/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊ.ｆａｆｕ(ｎａｔ.ｓｃｉ.).２０１９.０３.００４ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＯｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓｖｉｏｌａｃｅｕｓｓｅｅｄｓａｎｄｉｔｓａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｃｔｉｖｉｔｙＺＨＡＮＧＷｅｉｗｅｉꎬＹＵＡＮＳｕｓｕꎬＷＡＮＧＣａｉｃｈｅｎｇꎬＹＥＸｉｕｊｕａｎ(ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＦｕｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ３５０００２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＡｎａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＯｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓｖｉｏｌａｃｅｕｓｓｅｅｄｓｂｙｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬａｎｄｉｔｓａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｃ￣ｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｐａｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎꎬａｇａｒｐｌａｔｅｄｉｌｕｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｃａｖｉｔｙｓｌｉｄｅｍｅｔｈｏｄｓ.ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｅｄｗａｓｎａｍｅｄＺｐꎬｉｔｗａｓ１０ｋｕａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｄｅｆｅｎｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ.Ｚｐｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｓｔｒｏｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｎ１１ｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ.ＴｈｅＩＣ５０ｖａｌｕｅｓｏｆＺｐｐｒｏｔｅｉｎａｇａｉｎｓｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｐｏｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｗｅｒｅ５４.３６ａｎｄ１５.９７μｇ ｍＬ－１ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｉｔｓａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｔａｂｌｅｂｅｔｗｅｅｎ０ａｎｄ１００ħａｎｄｕｎｄｅｒｐＨ１－１４.Ｉｔａｌｓｏｅｘｈｉｂｉｔｅｄｈｉｇｈｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｓ(１５％ｍｅｔｈａｎｏｌꎬｅｔｈａｎｏｌꎬｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌꎬｅｔｈｅｒａｎｄａｃｅｔｏｎｅ)ａｎｄｍｅｔａｌｉｏｎｓ(５０－２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｍｇ２＋ꎬＫ＋ꎬＭｎ２＋ａｎｄＣａ２＋).Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓｖｉｏｌａｃｅｕｓꎻａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅｉｎꎻｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｃｔｉｖｉｔｙꎻｓｔａｂｉｌｉｔｙ抗菌蛋白是植物在长期进化过程中产生的具有抗微生物活性的一类防御性蛋白[１]ꎬ是机体天然免疫系统的重要组成部分.由于抗菌蛋白具有抗菌谱广㊁不易产生耐药性㊁低毒性等特点ꎬ极有可能成为一类新型抗菌素或植物源杀菌剂[２].众多研究人员已经从多种植物中分离出抗菌蛋白ꎬ并对其结构㊁功能和作用机理等进行了研究.例如:Ｙｅｅｔａｌ[３]从甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ)种子中分离出一种分子质量约为３０ｋｕ的蛋白ꎬ其对落花生球腔菌(Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ)㊁白色念珠菌(Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ)和铜绿假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ)均具有抑制作用ꎬ且该蛋白可以抑制鼻咽癌细胞和肝癌细胞的增殖ꎻＬｉｎｅｔａｌ[４]从芥蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａａｌｂｏｇｌａｂｒａ)中纯化出的抗真菌蛋白(５９０７ｕ)能够有效抑制尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏ￣ｒｕｍ)㊁玉蜀黍长蠕孢(Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍｍａｙｄｉｓ)㊁落花生球腔菌和苹果黑腐皮壳菌(Ｖａｌｓａｍａｌｉ)的生长ꎬ还可以抑制肝癌细胞ＨｅｐＧ２和乳腺癌细胞ＭＣＦ７的增殖ꎻＬｉｎｅｔａｌ[５]还从芸薹(Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ)中分离出抗真菌蛋白ｃａｍｐｅｓｉｎ(９.４ｋｕ)ꎬ该蛋白可以抑制尖孢镰刀菌和落花生球腔菌的生长ꎬ对ＨｅｐＧ２和ＭＣＦ癌细胞的增殖也有抑制作用.随着研究的深入ꎬ这些天然活性产物的应用将更加广泛.诸葛菜(Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓｖｉｏｌａｃｅｕｓ)系十字花科诸葛菜属ꎬ因农历二月前后开蓝紫色花ꎬ又称二月蓝㊁翠紫花[６].诸葛菜营养价值较高ꎬ其根㊁茎和叶均可食用[７].诸葛菜种子富含维生素Ｂ１㊁维生素Ｂ２㊁维生素Ｃ和胡福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷第３期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ)２０１９年５月萝卜素以及铁㊁钙等矿质元素[８－１１]ꎻ其含油量高达３５.８％ꎬ其中ꎬ棕榈酸㊁油酸和亚油酸含量较高ꎬ而亚麻酸和芥酸含量低ꎬ是非常优质的油料资源[１２－１４].目前ꎬ学者们已从十字花科多种植物如大白菜[１５]㊁高菜[１６]等中分离出抗真菌蛋白ꎬ但是有关诸葛菜种子中的抗真菌蛋白还未见报道.因此ꎬ本研究以诸葛菜种子为试验材料ꎬ分离纯化其抗真菌蛋白ꎬ并测定该蛋白的抑菌活性和稳定性ꎬ为促进诸葛菜抗真菌蛋白的应用提供参考.１㊀材料与方法１.１㊀材料与仪器诸葛菜种子:购买于江苏省宿迁市四季青种业有限公司.１５种供试植物病原真菌:尖孢镰刀菌㊁稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ)㊁灰葡萄孢菌(Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ)㊁芭乐炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)㊁禾谷镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ)㊁长柄链格孢菌(Ａｌｔｅｒｎａ￣ｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ)㊁烟草炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｍｉｃｏｔｉａｎａｅ)㊁玉蜀黍长蠕孢㊁小白菜炭疽(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｈｉｇｇｉｎ￣ｓｉａｎｕｍ)㊁落花生球腔菌㊁突脐蠕孢菌(Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍｔｕｒｃｉｃｕｍ)㊁茄病镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ)㊁苹果黑腐皮壳菌㊁辣椒疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ)㊁小孢拟盘多毛孢(Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ)均由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供.仪器:Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８６０Ｒ高速冷冻离心机(Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎬＬＧＪ￣１８Ｓ冷冻干燥机(上海松源华兴科技发展有限公司)ꎬＡＫＴＡｐｕｒｅ快速蛋白纯化系统(瑞典ＧＥ公司)ꎬＳＰＸ￣２５０智能恒温培养箱(宁波赛福实验仪器厂).１.２㊀抗真菌蛋白的分离㊁纯化取１５０ｇ诸葛菜种子ꎬ加入２０ｍｍｏｌ Ｌ－１醋酸铵缓冲液(ｐＨ４.６)８００ｍＬꎬ经豆浆机粉碎后置于４ħ匀浆浸提１２ｈꎬ离心(８０００ｒ ｍｉｎ－１ꎬ３０ｍｉｎ)后取上清液备用.将上清液上样于ＳＰ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阳离子交换层析柱(５.０ｃｍˑ２０ｃｍ)ꎬ依次用含０.２㊁０.５和１.０ｍｏｌ Ｌ－１ＮａＣｌ的２０ｍｍｏｌ Ｌ－１醋酸铵缓冲液进行梯度洗脱ꎬ在２８０ｎｍ波长下检测洗出液的光密度.将各组分收集ꎬ以尖孢镰刀菌为指示菌检测各组分抑菌活性.将有活性的组分透析ꎬ冷冻干燥后进一步用ＭｏｎｏＳＴＭ５/５０ＧＬ强阳离子交换柱分离ꎬ该柱预先用２０ｍｍｏｌ Ｌ－１醋酸铵缓冲液平衡ꎬ用０~１.０ｍｏｌ Ｌ－１ＮａＣｌ梯度洗脱ꎬ收集各洗脱峰ꎬ以尖孢镰刀菌为指示菌检测各洗脱峰抑菌活性.将有活性的组分透析并冷冻干燥ꎬ用２０ｍｍｏｌ Ｌ－１醋酸铵缓冲液溶解后上样于ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭＰｅｐｔｉｄｅ１０/３００ＧＬ凝胶层析柱ꎬ收集各洗脱峰ꎬ以尖孢镰刀菌为指示菌检测各洗脱峰抑菌活性ꎬ并收集活性组分ꎬ透析并冷冻干燥.１.３㊀蛋白分子质量测定Ｔｒｉｃｉｎｅ￣ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳方法参考文献[３]ꎬ分离胶浓度１６.５％ꎬ夹层胶浓度１０％ꎬ浓缩胶浓度４％.初始电压为３０Ｖꎬ电泳１ｈ后调至８０Ｖꎬ再继续电泳２.５ｈ.电泳结束后ꎬ用考马斯亮蓝Ｒ￣２５０染色２ｈꎬ再用脱色液(１０％甲醇和１０％乙酸)进行脱色.１.４㊀蛋白质谱分析将电泳检测为单一条带的样品经胰蛋白酶酶解后ꎬ用ＬＣＭＳＭＳ(ｎａｎｏＬＣ￣ＱＥ)进行质谱分析ꎬ通过ＭＡＳＣＯＴ等质谱匹配软件分析ＬＣＭＳＭＳ数据ꎬ通过ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ数据库检索㊁比对㊁鉴定分离得到的蛋白质.质谱分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成.１.５㊀蛋白的抗真菌活性检测用纸片扩散法[１７]进行测定.将待测的植物病原真菌接种于ＰＤＡ培养基上ꎬ２８ħ恒温培养ꎬ待菌落生长至圆面直径为３.０~３.５ｃｍ时ꎬ将灭菌的圆滤纸片放在距离菌丝边缘０.５ｃｍ处ꎬ各取１５μＬ蛋白样品和对照(ＰＢＳ缓冲液ꎬｐＨ７.４)加在滤纸片上ꎬ２８ħ恒温培养至菌落生长到滤纸片边缘时ꎬ观察有无抑菌活性.１.６㊀蛋白对尖孢镰刀菌生长半抑制浓度(ＩＣ５０)的测定采用琼脂平板稀释法[１７]进行测定.将蛋白样品用ＰＢＳ缓冲液配制成一系列浓度ꎬ并经０.２２μｍ滤头过滤除菌.加热融化０.７％ＰＤＡ培养基ꎬ待冷却至４０~５０ħ时ꎬ取０.５ｍＬ蛋白溶液(对照组为０.５ｍＬＰＢＳ缓冲液)与１.５ｍＬ培养基于培养皿(３０ｍｍˑ１５ｍｍ)中混匀ꎬ用打孔器截取相同大小真菌菌块ꎬ置于培养皿中心ꎬ封口 ７９２ ㊀第３期张玮玮等:诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性并转移至２８ħ恒温培养ꎬ直至对照组菌落生长至培养皿边缘.用十字交叉法测量真菌菌落的生长直径ꎬ并计算该蛋白对尖孢镰刀菌生长的抑菌率ꎬ每组３个重复.运用ＳＰＳＳ软件对数据进行Ｐｒｏｂｉｔ回归分析ꎬ计算ＩＣ５０.菌丝生长抑制率/％＝对照组菌落生长面积－处理组菌落生长面积对照组菌落生长面积ˑ１００１.７㊀蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发ＩＣ５０的测定１.７.１㊀孢子制备㊀将尖孢镰刀菌接种于ＰＤＡ培养基上ꎬ２８ħ黑暗条件下恒温培养７~１５ｄꎬ取５ｍＬ无菌水加入上述培养皿中ꎬ用涂布器在真菌表面来回刮动ꎬ滤除菌丝得到孢子悬液.稀释孢子悬液至浓度为１ˑ１０６~１ˑ１０７ＣＦＵ ｍＬ－１ꎬ取等体积孢子悬液与０.０５％葡萄糖溶液混合备用.１.７.２㊀孢子萌发抑制率的测定㊀用凹玻片法[１８－１９]进行测定.将蛋白样品用ＰＢＳ缓冲液配制成一系列浓度ꎬ并经０.２２μｍ滤头过滤除菌.取１０μＬ孢子悬浮液(对照组为ＰＢＳ缓冲液)与１０μＬ蛋白溶液混匀ꎬ加在凹玻片中央ꎬ置于含有两层浸湿的无菌滤纸片的培养皿(９０ｍｍˑ１５ｍｍ)中ꎬ２８ħ恒温保湿培养至对照组孢子萌发率达到９０％以上时ꎬ将各培养皿放入４ħ冰箱中.６ｈ后用光学显微镜观察并记录孢子萌发数ꎬ每组至少观察１００个孢子ꎬ每组３个重复ꎬ计算孢子萌发抑制率.运用ＳＰＳＳ软件对数据进行Ｐｒｏｂｉｔ回归分析ꎬ计算ＩＣ５０.孢子萌发率/％＝孢子萌发数观察孢子数ˑ１００孢子萌发抑制率/％＝对照组孢子萌发率－处理组孢子萌发率对照组孢子萌发率ˑ１００１.８㊀蛋白的稳定性检测１.８.１㊀热稳定性㊀取５个１.５ｍＬ离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用ＰＢＳ缓冲液溶解ꎬｐＨ７.４)０.１ｍＬꎬ其中４管分别在４０㊁６０㊁８０㊁１００ħ条件下水浴１５ｍｉｎ(待冷却至室温时进行试验)ꎬ１管未处理作为阳性对照ꎬ另取１个离心管加入ＰＢＳ缓冲液０.１ｍＬ作为阴性对照.以尖孢镰刀菌作为指示菌ꎬ采用纸片扩散法进行抑菌试验ꎬ每组设３个重复.１.８.２㊀ｐＨ稳定性㊀取７个１.５ｍＬ离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用ＰＢＳ缓冲液溶解ꎬｐＨ７.４)０.１ｍＬꎬ其中６管分别加入调配好的ｐＨ值为１㊁３㊁５㊁１０㊁１２㊁１４的ＰＢＳ缓冲液０.１ｍＬꎬ１管未处理作为阳性对照ꎬ另取１个离心管加入ＰＢＳ缓冲液０.１ｍＬ作为阴性对照ꎬ室温放置１ｈ.抑菌试验方法同１.８.１.１.８.３㊀有机溶剂稳定性㊀取６个１.５ｍＬ离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用ＰＢＳ缓冲液溶解ꎬｐＨ７.４)０.１ｍＬꎬ其中５管分别加入用ＰＢＳ缓冲液配制的１５％(ｖ/ｖ)甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮溶液０.１ｍＬꎬ１管未处理作为阳性对照ꎬ另取５个离心管分别加入１５％甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮０.１ｍＬ作为阴性对照ꎬ室温放置１ｈ.抑菌试验方法同１.８.１.１.８.４㊀金属离子稳定性㊀用ＰＢＳ缓冲液分别配制５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１的Ｍｇ２＋㊁Ｋ＋㊁Ｍｎ２＋㊁Ｃａ２＋溶液.取６个１.５ｍＬ离心管ꎬ分别加入抗真菌蛋白(用ＰＢＳ缓冲液溶解ꎬｐＨ７.４)０.１ｍＬꎬ其中５管分别加入５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｍｇ２＋溶液０.１ｍＬꎬ１管未处理作为阳性对照ꎬ以２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｍｇ２＋溶液作为阴性对照ꎬ室温放置１ｈ.Ｋ＋㊁Ｍｎ２＋㊁Ｃａ２＋溶液按照同样的方法进行处理.抑菌试验方法同１.８.１.１.９㊀数据处理用Ｅｘｃｅｌ和ＳＰＳＳ１７.０软件对数据进行分析处理.２㊀结果与分析２.１㊀抗真菌蛋白的分离、纯化诸葛菜种子蛋白上清液经ＳＰ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阳离子交换柱分离后ꎬ得到４个洗脱组分ａ㊁ｂ㊁ｃ㊁ｄ(图１Ａ)ꎻ以尖孢镰刀菌为指示菌ꎬ用滤纸片法测得ｂ组分具有抗真菌活性(图１Ｂ)ꎬ所以将ｂ组分进一步纯化.ｂ组分经ＭｏｎｏＳＴＭ５/５０ＧＬ强阳离子交换柱分离后ꎬ得到５个洗脱峰ｅ㊁ｆ㊁ｇ㊁ｈ㊁ｉ(图１Ｃ)ꎻ抑菌活性检测结果显示ｇ洗脱峰具有抗真菌活性(图１Ｄ)ꎬ所以选择ｇ组分进一步纯化.将ｇ组分上样于ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭＰｅｐｔｉｄｅ１０/３００ＧＬ凝胶层析柱进一步分离ꎬ得到ｊ㊁ｋ㊁ｌ㊁ｍ共４个洗脱峰(图１Ｅ)ꎻ抑菌活性检测结果表明ｌ洗脱峰具有抗 ８９２ 福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷㊀真菌活性(图１Ｆ).Ａ.ＳＰ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析ꎻＢ.ＳＰ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析各组分活性检测ꎻＣ.ＭｏｎｏＳＴＭ５/５０ＧＬ柱层析ꎻＤ.ＭｏｎｏＳＴＭ５/５０ＧＬ柱层析各组分活性检测ꎻＥ.ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭＰｅｐｔｉｄｅ１０/３００ＧＬ柱层析ꎻＦ.ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭＰｅｐｔｉｄｅ１０/３００ＧＬ柱层析各组分活性检测.ａ－ｍ代表各洗脱组分ꎻＣＫ.无菌水.图１㊀诸葛菜种子抗真菌蛋白的分离层析及各组分活性检测结果Ｆｉｇ.１㊀ＣｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＯ.ｖｉｏｌａｃｅｕｓｓｅｅｄｓＭ.标准蛋白ꎻＺ.Ｚｐ蛋白.图２㊀诸葛菜种子抗真菌蛋白的Ｔｒｉｃｉｎｅ￣ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳结果Ｆｉｇ.２㊀Ｔｒｉｃｉｎｅ￣ＳＤＳ￣ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｔｈｅａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＯ.ｖｉｏｌａｃｅｕｓｓｅｅｄｓ㊀㊀Ｔｒｉｃｉｎｅ￣ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳结果(图２)表明ꎬ诸葛菜种子抗真菌蛋白经过３步分离纯化后ꎬⅠ组分蛋白呈单一条带ꎬ说明已达到较高纯度ꎬ其相对分子质量约为１０ｋｕꎬ将该蛋白命名为Ｚｐ.２.２㊀质谱分析结果将Ｔｒｉｃｉｎｅ￣ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳得到的单一条带进行质谱分析ꎬ在ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ数据库中检索ꎬ结果如表１所示.经蛋白相似度和序列比对发现ꎬＺｐ蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白(ｄｅｆｅｎｓｉｎ)ꎬ在ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ数据库中的序列号为Ｃ９ＷＧＴ１ꎬ相对分子质量为８７３７.１７ｕꎬ这与电泳得出的Ｚｐ蛋白分子质量较为接近.表１㊀Ｚｐ蛋白的质谱鉴定与ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ数据库检索结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｄａｔａｂａｓｅｒｅｔｒｉｅｖａ(ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ)ｏｆＺｐｐｒｏｔｅｉｎ蛋白蛋白名称序列号(ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ数据库)序列分子质量/ｕ１ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｋ.ＮＱＣＩＮＬＥＫ.Ａ８７３７.１７ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｋ.ＮＱＣＩＮＬＥＫ.Ａ８７３７.１７ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｋ.ＮＱＣＩＮＬＥＫ.Ａ８７３７.１７ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｋ.ＮＱＣＩＮＬＥＫ.Ａ８７３７.１７ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｋ.ＮＱＣＩＮＬＥＫ.Ａ８７３７.１７ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｒ.ＨＧＳＣＮＹＶＦＰＡＨＫ.Ｃ８７３７.１７ＤｅｆｅｎｓｉｎＣ９ＷＧＴ１Ｒ.ＨＧＳＣＮＹＶＦＰＡＨＫ.Ｃ８７３７.１７２ＡｃｔｉｎＡ０Ａ０Ｂ５Ｊ８Ｂ２Ｋ.ＡＧＦＡＧＤＤＡＰＲ.Ａ４１７０５.３ＡｃｔｉｎＡ０Ａ０Ｂ５Ｊ８Ｂ２Ｒ.ＬＤＬＡＧＲ.Ｄ４１７０５.３３ＰｒｏｔｅｉｎＹｃｆ２Ａ０Ａ１Ｓ５ＳＪＷ６Ｒ.ＥＩＱＱＬＫ.Ｅ２７０００５.０８２.３㊀Ｚｐ蛋白的抗真菌活性Ｚｐ蛋白的抗真菌效果如图３所示ꎬ其对稻瘟病菌㊁灰葡萄孢菌㊁突脐蠕孢菌㊁烟草炭疽病菌㊁苹果黑腐皮壳菌㊁芭乐炭疽病菌㊁小白菜炭疽㊁玉蜀黍长蠕孢㊁落花生球腔菌㊁小孢拟盘多毛孢和尖孢镰刀菌共１１种植物病原真菌均具有抑制作用ꎬ而对茄病镰刀菌㊁辣椒疫霉㊁长柄链格孢菌和禾谷镰刀菌等４种真菌没有明显的抑制作用.由此可知ꎬ诸葛菜种子抗真菌蛋白具有一定的广谱性. ９９２ ㊀第３期张玮玮等:诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性Ａ.稻瘟病菌ꎻＢ.茄病镰刀菌ꎻＣ.灰葡萄孢菌ꎻＤ.突脐蠕孢菌ꎻＥ.烟草炭疽病菌ꎻＦ.苹果黑腐皮壳菌ꎻＧ.芭乐炭疽病菌ꎻＨ.小白菜炭疽ꎻＩ.玉蜀黍长蠕孢ꎻＪ.辣椒疫霉ꎻＫ.落花生球腔菌ꎻＬ.长柄链格孢菌ꎻＭ.禾谷镰刀菌ꎻＮ.小孢拟盘多毛孢ꎻＯ.尖孢镰刀菌.ＣＫ.ＰＢＳ缓冲液ꎻＺ.Ｚｐ蛋白.图３㊀Ｚｐ蛋白的抗真菌效果Ｆｉｇ.３㊀ＡｎｔｉｆｕｎｇａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅＺｐｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＯ.ｖｉｏｌａｃｅｕｓｓｅｅｄｓ２.４㊀Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌生长的ＩＣ５０Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌生长的抑制效果如图４Ａ所示.随着Ｚｐ蛋白浓度的增大ꎬ对尖孢镰刀菌生长的抑制率逐渐升高ꎬ当Ｚｐ蛋白浓度为１４２.５μｇ ｍＬ－１时ꎬ对尖孢镰刀菌的抑制率超过６０％(图４Ｂ).Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌生长抑制的Ｐｒｏｂｉｔ回归方程:Ｐｒｏｂｉｔ(ｐ)＝－１.５３０＋０.８８２ｘ.由此得出Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌生长的ＩＣ５０为５４.３６μｇ ｍＬ－１.Ａ图中１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁ＣＫ分别代表ＺＰ蛋白浓度为２８５.０㊁１４２.５㊁７１.３㊁３５.６㊁１７.８㊁０μｇ ｍＬ－１.图４㊀Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌生长的抑制效果Ｆｉｇ.４㊀ＩｎｈｉｂｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆＺｐｐｒｏｔｅｉｎｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＦ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ２.５㊀Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发的ＩＣ５０Ｚｐ蛋白可以抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发:与对照组相比ꎬ处理组孢子萌发数显著减少ꎬ且萌发的牙管较短ꎬ有的孢子形态膨大加粗ꎬ甚至出现畸形(图５Ａ).随着Ｚｐ蛋白浓度增大ꎬ对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制率逐渐升高ꎬ当蛋白浓度为１８.８５μｇ ｍＬ－１时ꎬ孢子萌发抑制率达到６０％(图５Ｂ).Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发抑制的Ｐｒｏｂｉｔ回归方程:Ｐｒｏｂｉｔ(ｐ)＝－１.４４９＋１.２０４ｘ.由此得出Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发的ＩＣ５０为１５.９７μｇ ｍＬ－１.２.６㊀Ｚｐ蛋白的稳定性从图６Ａ可看出ꎬＺｐ蛋白在４０㊁６０㊁８０㊁１００ħ水浴处理１５ｍｉｎ后ꎬ对尖孢镰刀菌的抑制活性基本保持不变ꎬ表明该蛋白的热稳定性良好.由图６Ｂ可知ꎬＺｐ蛋白在经不同ｐＨ值的溶液处理后ꎬ对尖孢镰刀菌仍 ００３ 福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷㊀有较强的抑制作用ꎬ说明该蛋白的耐酸碱性较强.图５㊀Ｚｐ蛋白对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制效果Ｆｉｇ.５㊀ＩｎｈｉｂｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆＺｐｐｒｏｔｅｉｎｏｎｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＦ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｓｐｏｒｅｓＡ.热稳定性ꎬ其中ＣＫ－为ＰＢＳ缓冲液ꎬＣＫ＋为未处理的Ｚｐ蛋白ꎻＢ.ｐＨ稳定性ꎬ其中ＣＫ－为ＰＢＳ缓冲液ꎬＣＫ＋为未处理的Ｚｐ蛋白ꎻＣ㊁Ｄ.有机溶剂稳定性ꎬ其中ａ１㊁ａ２㊁ａ３㊁ａ４㊁ａ５分别代表含有Ｚｐ蛋白的甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮溶液ꎬｂ１㊁ｂ２㊁ｂ３㊁ｂ４㊁ｂ５分别代表不含Ｚｐ蛋白的相应溶液ꎬＣＫ为未处理的Ｚｐ蛋白ꎻＥ㊁Ｆ㊁Ｇ㊁Ｈ分别为Ｃａ２＋㊁Ｍｇ２＋㊁Ｍｎ２＋㊁Ｋ＋稳定性ꎬ其中ａ㊁ｂ㊁ｃ㊁ｄ㊁ｅ分别对应含Ｚｐ蛋白的５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１金属离子溶液ꎬＣＫ－为不含Ｚｐ蛋白的２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１金属离子溶液ꎬＣＫ＋为未处理的Ｚｐ蛋白.图６㊀Ｚｐ蛋白的稳定性Ｆｉｇ.６㊀ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＺｐｐｒｏｔｅｉｎ由图６Ｃ㊁６Ｄ可知ꎬ经１５％甲醇㊁乙醇㊁异丙醇㊁乙醚㊁丙酮溶液处理过的Ｚｐ蛋白能够明显抑制尖孢镰刀菌的生长ꎬ而单独的相应有机溶剂对尖孢镰刀菌生长并没有抑制作用ꎬ由此说明该蛋白对有机溶剂具有一定的耐受性.由图６Ｅ㊁６Ｆ㊁６Ｇ㊁６Ｈ可知ꎬ不含Ｚｐ蛋白的２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｃａ２＋㊁Ｍｇ２＋㊁Ｍｎ２＋㊁Ｋ＋溶液对尖孢镰刀菌生长没有抑制作用ꎬ而含有该蛋白的不同浓度(５０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁２５０ｍｍｏｌ Ｌ－１)金属离子溶液对尖孢镰刀菌生长具有明显的抑制作用ꎬ说明Ｚｐ蛋白在强阳离子溶液中活性稳定.３㊀讨论与结论本研究从诸葛菜种子中分离出一种分子质量约为１０ｋｕ的抗真菌蛋白Ｚｐ.Ｚｐ蛋白对多种植物病原真菌均具有抑制作用ꎬ其中对尖孢镰刀菌生长的ＩＣ５０为５４.３６μｇ ｍＬ－１ꎬ对其孢子萌发的ＩＣ５０为１５.９７μｇ ｍＬ－１.抗真菌蛋白存在于十字花科的多种植物种子中ꎬ且这些蛋白对多种植物病原真菌具有抑制活性.例如:油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)种子中分离出的抗真菌蛋白(９４１２ｕ)对尖孢镰刀菌和落花生球腔菌的ＩＣ５０分别为７８.１２和４２.３５μｇ ｍＬ－１[２０]ꎻ甘蓝种子中纯化出分子质量为３０ｋｕ的抗真菌蛋白ꎬ对落花生球腔菌的ＩＣ５０为１５０μｇ ｍＬ－１[３]ꎻ芥蓝种子中纯化出分子质量为５９０７ｕ的抗真菌蛋白ꎬ对尖孢镰刀菌㊁玉蜀黍长蠕孢㊁落花生球腔菌和苹果黑腐皮壳菌的ＩＣ５０分别为２５.４０㊁１２.４０㊁１４.１８和０.８９μｇ ｍＬ－１[４].由此可知ꎬＺｐ蛋白的抗真菌活性较强.经质谱鉴定ꎬＺｐ蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白.Ｃｈａｎｅｔａｌ[２１]已经从褐色芸豆(Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ)的种子中分离出一种防御素类蛋白ꎬ分子质量为５.４ｋｕꎬ该蛋白也具有抗真菌活性.防御素类蛋白是植物抗菌蛋白中数目最多的一个种类且具有广谱的抗菌活性[２２].通过对Ｚｐ蛋白的抑菌 １０３ ㊀第３期张玮玮等:诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性２０３ 福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷㊀活性进行检测可知ꎬ其对尖孢镰刀菌等１１种真菌都有较强的抑制活性ꎬ表明该蛋白具有抑菌广谱性.防御素类蛋白还具有典型的三维稳定结构[２３].检测可知ꎬＺｐ蛋白具有良好的耐热㊁耐酸碱性ꎻ已有研究发现ꎬ油菜种子抗菌蛋白和芥蓝种子抗菌蛋白也具有热稳定性和强酸强碱稳定性[４ꎬ２４－２５].Ｚｐ蛋白对有机溶剂和金属离子也具有一定的耐受能力ꎻＴｅｒｒａｓｅｔａｌ[２６]研究表明ꎬ萝卜(Ｒａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓ)种子Ｒｓ￣ＡＦＰ１和Ｒｓ￣ＡＦＰ２抗菌蛋白在Ｋ＋溶液(５０ｍｍｏｌ Ｌ－１)中具有抑菌活性ꎬ且抑菌活性稳定.油菜㊁芥蓝㊁萝卜以及诸葛菜都属十字花科植物ꎬ说明十字花科多种植物种子中分离出的抗真菌蛋白具有一定的共性.综上所述ꎬＺｐ蛋白抑菌谱广ꎬ抑菌活性稳定ꎬ具有潜在的应用价值.但有关诸葛菜种子抗真菌蛋白抑制植物病原真菌生长的具体作用机理还有待研究.参考文献[１]朱立成ꎬ罗辉ꎬ曾铂ꎬ等.慈菇中抗真菌蛋白分离纯化初步研究[Ｊ].井冈山大学学报(自然科学版)ꎬ２０１３ꎬ３４(４):３３－３６. 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CTAB 法是一种化学方法，全称为十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium bromide）法。

它是一种常用的离心法，用于提取和纯化DNA，并可与蛋白质、核酸和其他细胞组分分离。

CTAB 法主要应用于植物组织或真菌样本中DNA 的提取。

该方法利用CTAB 作为提取缓冲液的成分之一，其作用是溶解和去除细胞膜、蛋白质和多种污染物，从而使DNA 得以纯化。

CTAB 法的基本步骤包括以下几个关键步骤：
1. 组织样本裂解：将待提取的组织样本加入含有CTAB 提取缓冲液的离心管中，并通过机械碾磨或超声波处理等方法破坏细胞膜结构，释放DNA。

2. 蛋白质沉淀：加入氯仿或酚/氯仿混合液将蛋白质沉淀下来。

这一步骤的目的是去除细胞的蛋白质和其他杂质。

3. DNA 沉淀：加入等体积的异丙醇或乙醇，使DNA 沉淀出来。

这一步骤利用DNA 在高盐浓度和无机离子的条件下难溶于水的特性。

4. 清洗和纯化：将沉淀的DNA 用乙醇洗涤，并去除残留的盐和其他杂质。

最后，用缓冲液重溶DNA，得到纯净的DNA 溶液。

CTAB 法相对简单且成本较低，在植物分子生物学、遗传学和系统学研究中得到广泛应用。

其提取的DNA 可用于遗传分析、PCR 扩增、基因测序等各种实验技术和研究领域。

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。

最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。

5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。

真菌DNA提取方法方法一：取出约0.1 g 菌丝体,加入1 mL 裂解缓冲液( Tris-HCl 100 mmol/L (p H 9.0) ; EDTA 100 mmol/ L ;NaCl 400 mmol/L ;2 %SDS) ,加入少许石英砂,在研钵中将菌丝进行充分研磨。

将菌体移入1.5 mL 的离心管中,于65℃水浴保温30 min ,每10 min 取出充分混匀1 次。

加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为24 ∶24 ∶1) ,轻轻混匀5min ,12 000 r/ min 离心10 min 。

吸取上清液,加入等体积氯仿,轻摇5 min ,12 000r/ min 离心10 min 。

收集上清液,加入0.75 倍体积的异丙醇沉淀DNA ,用70 %乙醇冲洗2～3 次后自然风干,加入500μL 1 ×TE 缓冲液溶解DNA 。

加入2 μL RNase( 10 mg/ mL ) , 37 ℃水浴保温30min 。

加入等体积苯酚∶氯仿(体积比为1 ∶1) ,轻摇5 min ,12 000 r/ min 离心10 min 。

取上清液加入等体积氯仿,轻摇5 min ,12 000 r/ min 离心10 min 。

吸取上清液,用2 倍体积的无水乙醇沉淀DNA , -20 ℃短暂放置后,12 000 r/ min 离心。

用70 %的乙醇洗涤沉淀DNA 2 次,自然风干后溶于适量0.1 ×TE缓冲液中,贮存于- 20 ℃备用。

方法二1.实验试剂（1）DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS（2）3M NaAc（3）TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA（4）酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)（5）氯仿:异戊醇(24:1)（6）异丙醇（7）无水乙醇（8）75%乙醇（9）RNaseA2.实验步骤（1）取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉（2）加入4mL提取液，快速振荡混匀（3）加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本）（4）1000rpm，4℃，5min（5）上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000rpm，4℃离心5min）（6）取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min （7）用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中（8）加入1ul RNaseA （10mg/mL），37℃处理1h（9）用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）（10）取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。

真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1 液氮将菌体研磨为粉末；2 向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3% (w/v) TCA和0.093% β巯基乙醇），过夜沉降；3 4 度20,000g 离心15 min；4 移处上清，用冰冷的含0.07% (v/v) β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5 离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。

二酚抽提法1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

3 在4度混合30分钟。

4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。

5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。

6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。

7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。

三提取液抽提丙酮沉淀法1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

2 取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。

3 向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mM Tris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100(v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0, 0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。

4 混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。

5 12000 rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。

7 向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。

8 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。

弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。

四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform /Methanol/Water Precipitation1 预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。

真菌dna提取步骤
真菌DNA提取是一项重要的实验技术，它可以用于研究真菌的遗传学特性，如基因组结构、功能基因的表达和调控等。

下面将介绍真菌DNA提取的步骤。

步骤一：样品准备
首先需要准备真菌样品，可以是培养物或者从自然环境中采集的真菌菌丝。

如果是培养物，需要在生长期内收集菌丝，如果是野生真菌，需要在采集后尽快处理样品。

步骤二：细胞破碎
将真菌样品放入离心管中，加入适量的研磨珠和研磨缓冲液，使用高速震荡器或者研磨器将样品破碎。

破碎后离心管中的混合物应该是均匀的悬浮液。

步骤三：细胞裂解
将破碎后的真菌悬浮液转移到离心管中，加入适量的裂解缓冲液和蛋白酶K，混合均匀后在60℃水浴中孵育30分钟。

这一步可以使真菌细胞壁和细胞膜破裂，释放DNA。

步骤四：DNA纯化
将裂解后的真菌悬浮液转移到离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，混合均匀后离心分离。

上层的DNA溶液可以通过吸管转移到新的离心管中，加
入等体积的异丙醇混合液，混合均匀后离心分离。

上层的DNA沉淀可以用70%乙醇洗涤，最后用去离子水溶解DNA。

步骤五：DNA浓度和质量检测
使用分光光度计或者凝胶电泳等方法检测提取的DNA浓度和质量。

DNA的浓度应该在50-100 ng/μL之间，质量应该高，没有明显的降解或污染。

综上所述，真菌DNA提取的步骤包括样品准备、细胞破碎、细胞裂解、DNA 纯化和DNA浓度和质量检测。

这些步骤需要严格控制条件，以确保提取的DNA 质量高、纯度高、浓度适宜，从而保证后续实验的成功进行。