实验室常用培养基的配制方法

1 实验五 微生物培养基的配制和灭菌

培养基是将微 生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。

培养基的种类：

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：

合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。

天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。

固体培养基：在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。

半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基。

微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。

一、目的要求

l. 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2. 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3. 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

2 二、实验材料

1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。

2. 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。

3. 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养血、吸管、各种包装纸防水纸、绳索、棉花、标签等。

琼脂培养基配制方法

琼脂培养基是一种广泛应用于微生物学实验中的寒假料，简单易得，易于制备，价格也非常实惠。在细菌、真菌等微生物的培养过程中，琼脂培养基可以提供细胞生长所需的营养物质，并且可以形成胶状物质，让微生物在其中生长繁殖。

配制方法：

1. 准备琼脂

首先，我们需要准备琼脂。通常，琼脂可以在实验室和化学品供应商处购买到。将适量的琼脂加入适量的去离子水中，使其充分溶解，然后稍微加热，搅拌均匀，使其变成均质的液体。

2. 加入营养物质

接下来，我们需要向琼脂中加入适量的营养物质，以促进微生物的生长。常见的营养物质包括葡萄糖、氨基酸、钾盐、磷酸盐等。具体需要添加哪些营养物质，可以根据实验需要和研究对象来定制。

3. 调整pH值

在加入营养物质之后，我们还需要调整琼脂的pH值，以使其更加适合微生物的生长。通常，微生物的适宜生长pH值在6.0-8.0之间。因此，我们需要在此范围内调整琼脂的pH值。

4. 灭菌处理

最后，将琼脂培养基倒入可反复加热的试管或烧杯中，用高温的方法灭菌处理。通常，我们可以将其放置在高温高压灭菌器中进行灭菌处理。处理时间视试管大小而定，一般在15-20分钟左右。

总结：

以上就是琼脂培养基的配制方法。需要注意的是，琼脂培养基的配制过程中，除了添加适量的营养物质和调整pH值外，不要添加任何其他物质，以免对实验结果产生干扰。另外，为保证实验结果的准确性，灭菌处理也是非常重要的一步，必须把握好灭菌时间和温度。最后，希望我们在科学研究中，能够更好地运用琼脂培养基，为科学事业做出更大的贡献。

实验室常用培养基的配制方法

Ampicillin

(100 mg/ml)

IPTG

(24 mg/ml)

X-Gal

(20 mg/ml)

LB 培养基

■ 组份浓度 100 mg/ml Ampicillin

■ 配制量 50 ml

■ 配制方法 1. 称量 5 g Ampicillin 置于 50 ml 离心管中。

2. 加入 40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml。

3. 用 0.22 μm 滤器过滤除菌。

4. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。

■ 组份浓度 24 mg/ml IPTG

■ 配制量 50 ml

■ 配制方法 1. 称量 1.2 g IPTG 置于 50 ml 离心管中。

2. 加入 40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml。

3. 用 0.22 μm 滤器过滤除菌。

4. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。

■ 组份浓度 20 mg/ml X-Gal

■ 配制量 50 ml

■ 配制方法 1. 称量 1 g X-Gal 置于 50 ml 离心管中。

2. 加入 40 ml DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，

定容至 50 ml。

3. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃避光保存。

■ 组份浓度 1%（W/V）Tryptone，0.5%（W/V）Yeast Extract，

1%（W/V）NaCl

■ 配制量 1 L

■ 配制方法 1. 称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。

Tryptone 10 g

Yeast Extract 5 g

NaCl 10 g

2. 加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 滴加 5 N NaOH（约 0.2 ml），调节 pH 值至 7.0。

实验一 培养基的配制及灭菌

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、别离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。

一、实验目的

1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。

2．明确培养基的配制原理。

3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。

4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。

二、实验原理

灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而到达灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高〔160～170℃〕，时间长〔1～2h〕。但干热灭菌温度不能超过 180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏 I 号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基〔PDA〕，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基〔PDA〕。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂〔Agar〕只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在 高温下熔化成液体，而在 45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的 pH 偏酸；细菌、放线菌的 pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的 pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配方如下：