单核细胞李斯特菌耐药基因

・　３２７６　・　・案例分析・　检验医学与临床２０１６年１１月第１３卷第２２期Ｌａｂ　Ｍｅｄ　Ｃｌｉｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１６，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．２２　产单核细胞李斯特茵致临床感染２例　曲淑君，张继东　（河北省遵化市人民医院检验科０６４２９９）　关键词：产单核李斯特茵｝　感染；　治疗　Ｉ）１３１：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—９４５５．２０１６．２２．０６３　文献标志码：Ｃ　文章编号：１６７２—９４５５（２０１６）２２—３２７６—０２　产单核细胞李斯特菌为革兰阳性杆菌，在自然界广泛分　布。通常认为只有产单核细胞李斯特菌对人体致病，相对罕　见，具有较高的致病性，一旦感染引起一系列症状，如流产、败　血症及脑膜炎等，病死率高达３Ｏ　，易感人群为孕妇、新生儿、　老人、ＨＩＶ感染者及其他疾病引起的免疫力低下的人群。特　别是对于孕妇，应加强对该菌的监测，因其可通过胎盘和产道　感染新生儿，引起流产、早产、死胎＿１］。２０１５年１Ｏ月，笔者从　一例宫内感染的患者羊水中分离出一株产单核细胞李斯特菌，　２０１６年３月从一老年患者的血液和肛周脓肿及血栓性外痔术　后的切口渗液同时分离出产单核李斯特菌，报道如下。　１临床资料　患者１，女，２３岁，主因一胎孕５个月，阴道流水５　ｈ入院。　查体：体温３８℃，咽无充血，扁桃体不大，双肺呼吸音清，心率　１２ｏ次／分，律齐，腹部膨隆。宫底脐平，偶可触及官缩，强度弱，　子宫无张力，宫底轻压痛，胎心１７８次，规则，先露不清，未人　盆。阴道检查已婚外阴，宫颈管软，可见少量淡黄色浑浊羊水　流出，无异味。辅助检查：２０１５年１Ｏ月９日彩超双顶径５．１　ｃｍ；股骨长４．０　ｃｍ；Ｉ级胎盘；仅见少许羊水，深约１．５　ｃｍ。白　细胞：２１．２９×１Ｏ。／Ｌ；中性粒细胞百分比８７．８　；血象高，考虑　与胎膜早破、官内感染有关。评估病情，患者现孕５个月，胎膜　早破，宫内感染，难免流产，应终止妊娠。交代病情，患者及家　属表示同意，予口服米非司酮，静点催产素引产。同时取羊水　送细菌室进行培养。培养结果为革兰阳性杆菌，经梅里埃　Ｖｉｔｅｋ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ鉴定为产单核细胞李斯特菌。　患者２，男，７９岁，主因５　ｈ前无明显诱因出现发热，体温　最高３９．２℃，伴发冷、寒战，无明显胸闷、气短，无咯血、胸痛。　无心悸、尿少、水肿，无尿急、尿痛，无腹痛、腹泻，院外未予处　理，为进一步诊治来本院，门诊完善相关检查予布洛芬口服退　热对症处理后收入院。查体：呼吸平稳，口唇微绀，胸廓呈桶　状，双肺呼吸音弱，双肺可闻及少许湿性哕音，心率８Ｏ次／分，　律齐，腹部柔软，无压痛、反跳痛及肌紧张。肛周可见４个１　ｅｍ左右手术切口，切口处可见少许渗液，双下肢无水肿。鉴别　诊断：（１）血流感染，患者高龄，机体抵抗力差，突发发热，伴发　冷、寒战，警惕本病，查血培养及药敏；（２）肛周脓肿术后切口感　染，患者高龄，机体抵抗力差，现发热，１个月前行肛周脓肿术，　切口处可见渗液，警惕本病，行切口渗液培养及药敏。血培养　及切口渗液均生长革兰阳性杆菌，经梅里埃Ｖｉｔｅｋ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ　鉴定为产单核细胞李斯特菌。　２病原学检查　患者１，临床取羊水送检，分别接种血平板和中国蓝平板，　３５℃孵育箱过夜培养，次日在血平板上可见直径为１～２　ｍｉｌｌ、　灰白色菌落，菌落周围有狭窄的Ｂ溶血环，有些菌落甚至刮开　菌落才能看到溶血，对涂片进行革兰氏染色，为革兰阳性短小　杆菌，触酶阳性，采用梅里埃Ｖｉｔｅｋ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ的ＧＰ卡鉴定为　产单核细胞李斯特菌，鉴定百分率为９５　，生物编码为　３４２２１０３２４７３３６２１，动力阳性，ＣＡＭＰ试验阳性。　患者２，临床无菌采集血液注入血培养瓶，将培养瓶放人　梅里埃Ｂａｃｔ／ＡＬＥＲＴ　３Ｄ　２４０血培养仪中培养，次日报阳，涂片　革兰染色为革兰阳性杆菌，电话报告临床，同时转钟血平板、中　国蓝平板和巧克力平板，次日在血平板上可见直径为ｉ～２　ｍｍ　菌落，巧克力平板可能由于添加万古霉素，未见生长，经鉴定为　产单核细胞李斯特菌，鉴定百分率为９５　，生物编码为　３４２２１０３２４７３３６２１。临床在送血培养的同时，用拭子采集清创　后的伤口渗液送检，用拭子涂布血平板和中国蓝平板，３５℃孵　育箱过夜培养，次日在血平板上可见直径为１～２　ｍｍ菌落，采　用梅里埃Ｖｉｔｅｋ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ的ＧＰ卡鉴定为产单核细胞李斯特　菌，鉴定百分率为９５　，生物编码为３４２２１０３２４７３３６２１，动力阳　性，ＣＡＭＰ试验阳性，就此可以推测患者血流感染的原发病灶　应该为切口感染。　３临床治疗情况　由于产单核李斯特菌的药敏试验不适宜用纸片扩散法，可　采用稀释法和Ｅ—ｔｅｓｔ法，药敏试验结果判断标准参考美国临床　和实验室标准化研究所出版的Ｍ４５一Ａ文件。由于本实验室不　具备上述条件，所以只能采用经验用药，患者１采用左氧氟沙　星０．４　ｇ／ｄ静脉输液，患者２人院后采用头孢他啶静脉滴注，　无效，获得病原后，改用哌拉西林／他唑巴坦静点抗感染治疗，　均取得满意效果。　４讨　论　李斯特菌属隶属于细菌域，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆　菌目，李斯特菌科。目前属内有１Ｏ个种和亚种，包括单核细胞　李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌、威氏李斯特菌、格氏　李斯特菌和无害李斯特菌等。伊氏李斯特菌有２个亚种，伊氏　李斯特菌伊氏亚种和伊氏李斯特菌伦敦亚种　］。　李斯特菌广泛存在于自然环境以及人和动物粪便中口］。　只有产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌与人类疾病有关，前　者对人的病原性已经确立，后者病原性尚未确立。其他的李斯　特菌种对人无致病性＿２］。产单核细胞李斯特菌有较高致病性，　可感染各类人群，尤其是对孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低　下者，引起原发性脑膜炎、脑炎、败血症和流产。该菌有生物趋　向性，致神经系统严重损害，病死率达２Ｏ　～５Ｏ　，残存者伴　有神经学上的后遗症。妊娠者感染，常常引起似流感样菌血　症，因为该菌能穿透胎盘，若不予及早处理，可导致胎盘炎、羊　膜炎和感染婴儿流产、死产、早熟、早产　３。同时该菌亦是公共　卫生学上重要的食源性病原茵，若污染奶及其制品可引起食物　中毒　］。该菌临床分离率极低，原卫生部全国细菌耐药性监测　网（ＭＯＨＮＡＲＩＮ）２００６￣２００７年２８　７４１株革兰阳性杆菌中产　单核李斯特菌只有１５株（ｏ．０５２　），但由该菌引起的病死率高　达３Ｏ　－－７０％『ｃ

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ＰＣＲ在快速检测食品单核细胞增多性李斯特菌中的应用

作者：谭炳乾 肖 军

来源：《湖北农业科学》2009年第07期

摘要：为应用PCR快速检测食品中的单核细胞增多性李斯特菌，设计合成了针对单核细胞增多性李斯特菌溶血素编码基因的特异性引物进行PCR扩增。结果表明，在单核细胞增多性李斯特菌中能扩增出348bp的预期片段，大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和李斯特属的绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌的扩增结果均为阴性。用该方法检测了81份食品样品，检测结果与分离鉴定方法一致，表明本方法可用于食品中单核细胞增多性李斯特菌的快速检测。检测样品中，单核细胞增多性李斯特菌污染率为8.6％，以禽肉类制品中的污染率最高。

关键词：PCR；单核细胞增多性李斯特菌；hly；检测

中图分类号：Q939.123：Q789

文献标识码：A

６５２　中国人兽共患病学报　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｏｏｎｏｓｅｓ　２００７，２３（７）　

文章编号：１００２—２６９４（２００７）０７—０６５２—０４　

产单核细胞李斯特菌ｐｌｃＢ基因的克隆与原核表达＊　

田德斌，袁舟，殷月兰，黄金林，董　慧，焦新安　

摘要：目的　克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌ｐｌｃＢ基因。方法利用ＰＣＲ技术从产单核细胞李斯特菌基因组中　扩增不含编码信号肽的ｐｌｃＢ基因。采用Ｔ—Ａ克隆构建ｐＧＥＭ－Ｔ—ｐｌｃＢ重组质粒，ＢａｍＨ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ双酶切ｐＧＥＭ－Ｔ—ｐｌｃＢ获得　ｐｌｃＢ片段后再插入ｐＧＥＸ－６ｐ－１原核表达载体，获得ｐＧＥＸ一６ｐ－１一ｐｌｃＢ重组表达质粒并在表达宿主菌ＢＬ２１中诱导表达。对表　达产物进行纯化和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ、磷脂酶活性实验分析。结果　克隆的ｐｌｃＢ基因长８３４ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ上公　布的序列完全相同；表达的与ＧＳＴ标签蛋白融合的广谱磷脂酶Ｃ蛋白（ＧＳＴ—ＰＣ＿ＰＬＣ）具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结　论成功构建产单核细胞李斯特菌ｐｌｃＢ基因的原核表达质粒，并在大肠杆菌中得到有效表达，这为进一步研究ＰＣ－ＰＬＣ蛋白　的致病与免疫机理奠定了基础。　关键词：产单核细胞李斯特菌；ｐｌｃＢ基因；广谱磷脂酶Ｃ；原核表达　中图分类号：Ｒ３７８．９９　文献标识码：Ａ　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌｃＢ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　

ＴＩＡＮ　Ｄｅ—ｂｉｎ，ＹＵＡＮ　Ｚｈｏｕ，ＹＩＮ　Ｙｕｅ－ｌａｎ，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉｎ－ｔｉｎ，ＤＯＮＧ　Ｈ　ｕｉ，ＪＩＡＯ　Ｘｉｎ—ａｎ　

（Ｊ　ｉａｎｇｓｕ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｚｏｏｎｏｓｉｓ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｙａｎｇｚｈｏｕ　２２５００９．Ｃｈｉｎａ）　

第３０卷第１１期　２００８年１１月　中国预防兽医学报　

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ＶＯ１．３Ｏ．Ｎｏ．１１　ＮＯＶ．２００８　

产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达　

张衍海１，２，白艳艳　，张彦明　，郑增忍　，张　宝　，童光志ｔ，　

（１中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨１５０００１；２．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛２６６０３２　３．西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨陵７１２１００；４．中国农业科学院上海兽医研究所，上海２００２３２）　

摘　要：利用ＰＣＲ方法扩增产单核细胞李斯特茵（ＬＭ）的溶血素基因ｈｌｙＡ，获得一条大小约为１　６００　ｂｐ的目　的片段，将其与ｐＭＤ１８一Ｔ栽体连接，经酶切、ＰＣＲ鉴定，命名为ｐＭＤ１８－Ｔ—ｈｌｙＡ。测序结果显示所扩增的ｈｔｙａ　

基因与ＧｅｎＢａｎｋ中发表的ｈ／ｙＡ的序列同源性为９９％。利用含有ＢａｍＨ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ酶切位点引物Ｂ从ｐＭＤ１８一Ｔ—ｈｌｙａ　

扩增不含信号肽序列的目的片段Ｂ，获得了大小约为ｌ　５００　ｂｐ的基因片段，该片段与ｐＥＴ３２ａ表达载体经ＢａｍＨ　Ｉ／　

Ｘｈｏ　Ｉ处理后进行连接，转化ＢＬ２１受菌体。通过酶切、ＰＣＲ鉴定及序列测定后获得阳性ｐＥＴ３２ａ．ｈｌｙＡ表达重组　质粒，将重组茵用终浓度为０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ进行诱导表达，结果表明重组茵在诱导２　ｈ～３　ｈ表达量最高，融　

合蛋白约占菌体的４０％，分子量大小约为８０　ｋｕ；利用ＬＭ的阳性血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析，证实该融合蛋白　

可以被ＬＭ阳性血清所识别，为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接ＥＬＩＳＡ诊断方法提供了条件。　

关键词：产单核细胞李斯特菌；溶血素；ｈｌｙＡ；克隆；表达　中图分类号：Ｑ７８６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８—０５８９（２００８）１　１－０８７０—０５