石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。

它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。

下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。

因此，第一步是将蜡块去蜡。

首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。

然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。

这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。

步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。

常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。

固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。

步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。

首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。

脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。

在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。

石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。

最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。

之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。

切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。

步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。

抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。

常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。

热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。

化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。

抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。

步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。

免疫组化染色
1.石蜡切片60℃烤片2h
2.二甲苯脱蜡15min X 2次
3.梯度乙醇水化：100%乙醇X 2次，95%乙醇X 1次，85%乙醇X 1次，75%乙醇X 1次，
纯水X 2次，各5min。

4.抗原修复:
方法一（微波修复）：将玻片浸没在EDTA或枸橼酸钠抗原修复液中，微波炉高火5min，解冻2min，中低火20min，自然冷却到室温。

方法二（高压修复）：将玻片浸没在枸橼酸钠抗原修复液中，121℃，高压5min，自然冷却到室温。

1L抗原修复液：3g柠檬酸钠+0.4g柠檬酸。

5.灭火内源性过氧化物酶：将玻片浸入3% H2O2，室温15min，避光。

6.双蒸水浸泡3min，去除H2O2。

7.PBS洗3次，每次5min
8.甩干，将玻片摆放在湿盒上，免疫组化笔花圈，加入0.3% TritonX-100穿透细胞15min。

如果检测细胞质蛋白，此步骤科省略。

9.甩干，加入10% BSA 封闭1h。

10.加入2% BSA稀释好的一抗，4℃孵育过夜。

11.第二天，把湿盒从4℃拿出恢复至室温，PBS洗3次，每次5min
12.甩干，加入对应的二抗，室温孵育1h
13.PBS洗3次，每次5min
14.甩干，加入新鲜配置的DAB，显色时间需要摸索，最长不超过10min
15.清水终止显色，自来水冲洗20min以上。

16.苏木素染色30s，自来水冲洗返蓝
17.梯度乙醇脱水：75%乙醇X 1次30s，85%乙醇X 1次30s，95%乙醇X 1次30s，100%
乙醇X 1次30s，二甲苯6min
18.中性树胶封片。

柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)1.适用范围：适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500W电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。

3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.14.操作步骤：(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。

(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中，大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。

盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水笼头下加速冷却)，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。

(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。

5.注意事项：(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。

(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。

(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出。

(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine((5)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。

EDTA 抗原热修复法1. 适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。

2. 仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。

3. 所需试剂：EDTA抗原修复液，pH9 .04. 操作步骤：(1)抗原修复液的配制：根据所需工作液的量，取迈新公司产品MVS-0098适量，按1:50 的比例稀释。

不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响简介肾活检是诊断某些肾脏疾病的重要手段。

在进行肾活检时，通常需要进行免疫荧光染色来确定肾脏病理组织的类型和程度。

在进行免疫荧光染色时，免疫抗原修复是一个关键的步骤，它可以增强抗原在组织中的表达，提高染色效果。

本文将探讨不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响。

抗原修复方法在进行免疫荧光染色时，抗原修复的主要目的是恢复或增强组织中的抗原表达，使其更易于被抗体检测。

目前常用的抗原修复方法包括化学方法、热处理法和酶消解法。

下面分别介绍它们的原理和操作步骤。

化学方法化学方法是一种使用化学物质对组织进行抗原修复的方法。

化学物质一般都是酸、碱或其他特定化合物，它们可以通过改变组织中蛋白质的构象，使其易于与抗体结合。

常用的化学物质包括醋酸、乙酸、甲酸、谷氨酰胺等。

操作步骤1.将药液加入试管中。

2.离心石蜡切片，并将其放入药液中。

3.在适当的温度和时间下进行反应。

4.在 PBS 溶液中洗涤石蜡切片。

5.进行抗体染色。

热处理法热处理法是将组织样本放入高温环境中，以改变蛋白质的构象。

它可以使组织中抗原更易于被抗体识别和结合。

该法使用方便，但需要控制好时间和温度，过渡的热处理会导致组织破坏或失去抗原，而时间过短则容易影响染色效果。

操作步骤1.将石蜡切片放到蛋白酶降解试剂中，进行蛋白酶降解。

2.将石蜡切片放入热处理缓冲液中。

3.用高压蒸气炉进行热处理，温度一般在 90-100°C，时间在 10-20 分钟。

4.在 PBS 溶液中洗涤石蜡切片。

5.进行抗体染色。

酶消解法酶消解法是将组织中的蛋白质通过裂解和水解等方式分解为更容易被抗体检测的分子。

酶消解法适用于形态不易被破坏的组织样本，如肝、肾等。

操作步骤1.将石蜡切片放入酶消解缓冲液中进行反应，时间一般在 20-30 分钟。

2.在 PBS 溶液中洗涤石蜡切片。

3.进行抗体染色。

影响因素抗原修复方法的选择需要考虑多个因素，如待测抗原类型、形态、表达水平、抗体类型等。

抗原修复是一种用于提高免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）染色效果的技术。

以下是一些抗原修复的注意事项：
1. 选择合适的修复方法：不同的抗原需要不同的修复方法。

例如，一些抗原需要使用蛋白酶消化来暴露抗原表位，而另一些抗原则需要使用热修复或化学修复。

因此，在进行抗原修复之前，需要了解待检测抗原的性质，并选择适当的修复方法。

2. 控制修复时间和温度：抗原修复的时间和温度是影响修复效果的重要因素。

通常，修复时间和温度需要根据不同的修复方法和抗原进行调整。

如果修复时间过长或温度过高，可能会导致抗原的过度修复，从而影响染色效果。

3. 避免抗原丢失：在进行抗原修复时，需要注意避免抗原的丢失。

例如，在蛋白酶消化过程中，需要控制消化时间和浓度，以避免过度消化导致抗原丢失。

4. 控制修复液的 pH 值：抗原修复液的 pH 值也会影响修复效果。

通常，修复液的 pH 值需要根据不同的修复方法和抗原进行调整。

如果 pH 值过高或过低，可能会导致抗原的变性或丢失。

5. 避免交叉污染：在进行抗原修复时，需要注意避免交叉污染。

例如，使用不同的修复液和器具处理不同的样本，以避免交叉污染。

总之，抗原修复是 IHC 和 IF 染色过程中的重要步骤，需要仔细控制修复时间、温度、修复液的 pH 值等因素，以确保获得最佳的染色效果。

石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。

2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。

3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。

渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。

4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。

切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。

2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。

3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。

染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。

2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。

3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。

4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。

5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。

6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。

8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

免疫组化中抗原修复的方法(一)免疫组化中抗原修复1. 引言在免疫组化实验中，抗原修复是一项重要的步骤。

由于组织样本中的抗原可能会被固定、石化或脱变，导致免疫染色的效果不佳。

因此，进行抗原修复可以提高抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性。

2. 抗原修复的方法热原修复法热原修复法是最常用的抗原修复方法之一。

具体步骤如下：•将切片置于含有缓冲液的载玻片上；•将载玻片放置在加热板上，设定适当的温度和时间，通常为95°C，15-20分钟；•等待切片冷却至室温，继续下一步的处理。

酶解原修复法酶解原修复法适用于某些情况下，特别是当形状石化的抗原需要修复时。

具体步骤如下：•将切片置于含有酶解液的载玻片上；•将载玻片放置在适当的温度和湿度条件下进行酶解，通常为37°C，30分钟；•冷却切片至室温，然后进行下一步处理。

酸性原修复法酸性原修复法主要用于修复石蜡包埋组织标本中的抗原。

具体步骤如下：•将切片浸泡在含有酸性溶液的容器中，通常使用的酸性溶液；•在合适的温度条件下进行酸解，通常为95°C，30分钟；•将切片冷却至室温，并进行下一步处理。

高压原修复法高压原修复法是相对较新的抗原修复方法，它利用高压力来提高修复效果。

具体步骤如下：•将切片置于含有修复液的载玻片上；•将载玻片放置在高压原修复设备中，设定适当的压力和时间；•冷却切片至室温，并进行后续处理。

3. 结论抗原修复在免疫组化实验中起到至关重要的作用，可以修复被固定、石化或脱变的抗原，提高抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性。

常用的抗原修复方法包括热原修复法、酶解原修复法、酸性原修复法和高压原修复法。

选择合适的方法进行抗原修复，可以提高免疫组化实验的准确性和可靠性。

以上就是本文对免疫组化中抗原修复的相关方法进行的详细介绍。

希望对读者在免疫组化实验中的抗原修复环节有所帮助。

4. 热原修复法的原理和优缺点原理热原修复法是利用高温对抗原进行恢复性变性处理，使其重回天然的结构状态。

免疫组化常见抗原修复方法大多数甲醛固定的组织在开始染色之前都需要先修复抗原，这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。

两种抗原修复方法为热修复法（称之为热诱导抗原表位修复或HIER）和酶解法。

一、热修复法1. 热修复缓冲溶液下面是三种HIER较为常用的缓冲溶液，对于一个特定的抗体，在没有其他研究者建议的情况下，要通过实验确定选用哪种修复缓冲液。

1) 枸橼酸钠缓冲液(10 mM Sodium Citrate，0.05% 吐温- 20, pH 6.0)2) 1 mM EDTA, 调至pH 8.03) Tris/EDTA 缓冲液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液， 0.05% 吐温-20, pH 9.0)2. 热修复方法a) 高压蒸汽法玻片要置于金属架上1)材料及试剂· 家用不锈钢高压锅· 加热板· 玻片架放置容器（容量大约400-500ml）· 抗原修复缓冲液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠pH 6.0）2)方法1. 将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内，然后将锅置于加热板并开至最大功率，此时不要把盖子盖紧。

在等待煮沸过程中，进行脱蜡至水。

2.煮沸后，将玻片从自来水中取出放入高压锅内。

小心热溶液- 使用镊子。

依照说明书加上加压阀。

3.高压锅达到最大压力后，维持3分钟。

4.3分钟过后，关掉加热板，将高压锅取下放置。

5.打开高压锅阀门，冷水冷却锅身。

压力降下后，打开锅盖，冷水冷却10分钟。

6.继续染色。

b) 微波法1)材料和试剂· 家用(850W)或科研专用微波炉· 微波炉专用玻片放置架及容器（容量大约400-500ml）或染色缸· 抗原修复缓冲液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸橼酸钠溶液pH 6.0，等等）2)方法1.将切片脱蜡至水。

2.向微波炉专用容器中加入合适的修复缓冲液。

免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。

正确操作：多甲灌注固定一一多甲或甲醛后固定一一蔗糖梯度脱水一一负70度保存一一冰冻切片错误操作：多甲灌注固定一一多甲或甲醛后固定一一负70度保存一一蔗糖梯度脱水一一冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。

J2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。

要点和操作技巧：1•固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。

对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。

有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

」Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。

适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2 •组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3 •切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4 •烤片：60 C 30分钟或37 C过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5 .蜡块及切片的保存：最好在 4 C保存6.脱片问题：Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml 的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。

如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine ）的切片。

在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1 : 50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7 .灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

免疫组化中抗原修复的方法介绍免疫组化是一种重要的实验技术，用于检测细胞或组织中的特定抗原。

然而，在某些情况下，抗原可能会失去其天然的组织学特性，从而导致免疫组化结果的不准确性。

为了解决这个问题，可以使用抗原修复的方法。

本文将详细探讨免疫组化中抗原修复的方法。

抗原修复的目的抗原修复的目的是恢复组织中的抗原在免疫组化实验中的表达，以提高免疫组化结果的准确性。

抗原修复的方法可以解决以下问题： 1. 组织固定时可能导致抗原的变性或掩盖。

2. 组织切片时可能导致抗原的丢失。

3. 某些抗体需要与特定抗原结合才能发挥作用。

常用的抗原修复方法煮沸法煮沸法是一种简单而常用的抗原修复方法。

具体步骤如下： 1. 将组织切片置于含有缓冲盐水的容器中。

2. 将容器放入煮沸器中，保持沸腾10-30分钟。

3. 取出容器，将切片冷却至室温。

4. 切片清洗，以去除残余盐水。

酸性解偶联剂法酸性解偶联剂法可以用于修复因羟烯酸基团损伤而导致的抗原修复问题。

具体步骤如下： 1. 将组织切片置于含有酸性解偶联剂的缓冲溶液中。

2. 在室温下孵育切片1-2小时。

3. 清洗切片，以去除残余缓冲溶液。

高温蛋白酶法高温蛋白酶法可用于修复由于过度固定而导致的抗原修复问题。

具体步骤如下： 1. 将组织切片置于含有高温蛋白酶的缓冲溶液中。

2. 在适当的温度下孵育切片一段时间，并定期观察抗原修复的程度。

3. 停止孵育，冷却切片至室温。

4. 清洗切片，以去除残余缓冲溶液。

抗原修复方法的选择选择适当的抗原修复方法取决于多个因素： 1. 组织的类型和性质。

2. 使用的抗体种类。

3. 实验的目的和要求。

结论抗原修复是免疫组化中的重要步骤，可以提高实验结果的准确性。

本文介绍了煮沸法、酸性解偶联剂法和高温蛋白酶法三种常用的抗原修复方法。

选择适当的抗原修复方法对于免疫组化实验的成功至关重要。

在实际应用中，应根据组织的类型和性质、使用的抗体种类以及实验的目的和要求来选择合适的抗原修复方法。

石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过抗原抗体特异性反应来检测并定位蛋白的方法，目前广泛应用于组织病理学诊断。

其中，抗原修复（Antigen repair，AR）是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。

原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，使抗原与抗体的结合点减少，从而令抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。

这种交联在高温加热或是蛋白酶水解的作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。

一AR常用的方法是否进行AR、采用什么方法进行AR 要按抗体说明书的要求决定，不同的抗体选择适合该抗体的AR方法，有的要求高温修复，有的要求酶消化。

➤微波法方法：切片于抗原修复液中经微波炉内微波辐射5-20min。

它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。

微波辐射可以使各物质分子作极性运动，促进形成的醛键断裂开。

分子间运动所产生的瞬间热可导致甲醛固定后的蛋白的变性。

该法的特点是：产热迅速，容易操作，但也容易引起抗原修复液的沸腾，使得修复液温度不稳定。

➤高温高压法方法：切片于抗原修复液中在高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续1-5min。

该法利用高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度在100℃-120℃之间，而高压也易使蛋白变性。

➤真空负压法方法：切片于抗原修复液中在预先调至95℃的真空负压干燥箱中真空负压处理5-10min。

这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。

该法特点是分子在失重的情况下四处飘游，可以增加各分子间的碰撞机会，而且恒定的温度能保证使甲醛固定的蛋白发生变性又不会使抗原修复液达到沸点。

➤酶修复法方法：0.10%胰蛋白酶或0.40%胃蛋白酶在室温或37℃消化切片15-30min。

免疫组化应注意什么原则免疫组化是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，用于检测、定位和鉴定细胞、组织和生物分子中的特定抗原。

在进行免疫组化实验的过程中，需要注意以下原则：1. 选择合适的抗原修复方法：组织固定和包埋的过程会使细胞或组织中的抗原发生变性或不可逆变化，因此需要对抗原进行修复操作。

常用的抗原修复方法包括热修复、酶解修复和酸性修复等。

选择适当的抗原修复方法可以恢复抗原的免疫反应性，提高实验的准确性和可重复性。

2. 合理选择一抗和二抗：在免疫组化实验中，一抗是检测目标抗原的抗体，二抗是针对一抗产生的抗体。

合理选择适合的一抗和二抗对实验结果的准确性和特异性至关重要。

一抗的选择应考虑抗原亲和力、特异性和交叉反应性等因素。

二抗则应选择与一抗来源物种不同的抗体，以避免非特异性反应的干扰。

3. 控制染色反应的时间和条件：染色反应时间和条件的控制直接影响实验结果的准确性和可靠性。

染色反应时间过长可能导致背景染色过度，影响抗原的可视化观察；染色反应条件温度过高或过低可能导致抗体与抗原结合的非特异性结构破坏或抑制，影响染色反应的特异性。

4. 注意负对照和阳性对照的设置：负对照用于评估实验过程中非特异性反应的背景水平，通常使用未与一抗进行反应的样本作为负对照。

阳性对照则用于评估一抗和二抗的有效性和敏感性，通常使用已知含有目标抗原的样本作为阳性对照。

合理设置负对照和阳性对照可以帮助准确判断实验结果和消除可能的假阳性或假阴性结果的干扰。

5. 实验结果的观察和分析：免疫组化实验结果的观察和分析应充分考虑细胞或组织的形态特征和染色强度等信息。

观察时应留意光线和显微镜的调节，结合已有的形态学知识进行判断和分析，避免主观因素对结果的干扰。

6. 实验参数的优化和标准化：实验参数的优化和标准化对于免疫组化技术的准确性和可靠性至关重要。

通过合理优化实验参数，如抗体浓度、抗原修复时间和温度、染色剂浓度和反应时间等，可以提高实验结果的准确性和可重复性。

对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。

2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。

7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。

柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)1.适用范围：适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500W电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。

3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.14.操作步骤：(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。

(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中，大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。

盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水笼头下加速冷却)，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。

(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。

5.注意事项：(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。

(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。

(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出。

(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine((5)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。

EDTA抗原热修复法1.适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。

2.仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。

3.所需试剂：EDTA抗原修复液，pH9 .04.操作步骤：(1)抗原修复液的配制：根据所需工作液的量，取迈新公司产品MVS-0098适量，按1:50的比例稀释。

免疫组化中抗原修复方法及注意事项问：为什么要进行抗原修复：答：福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。

同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。

因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。

抗原修复中柠檬酸缓冲液的配制方法：A液：枸橼酸，C6H8O7.H2O，21.01g 加水定容至1000ml；B液：枸橼酸钠，C6H5Na3O7.2H2O, 29.41g 加水定容至1000ml;使用时：A液9 ml, B液41 ml，加水至500ml，即可配成工作液。

抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。

抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。

本文的目的是概述AR-HIC的发展、应用和标准化。

一、AR技术加热AR技术微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。

加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟（注意防止切片干躁）。

有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟（在第一个5分钟后检测液体高度）。

加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。

片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC 染色。

为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin 缸，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。

抗原修复方法及注意事项在免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）等实验技术中，抗原修复是一个至关重要的步骤。

它对于提高抗原的检测敏感性和特异性，获得准确可靠的实验结果具有重要意义。

接下来，让我们详细了解一下抗原修复的方法以及在操作过程中需要注意的事项。

一、抗原修复的概念抗原修复，简单来说，就是通过一系列的处理方法，使在组织固定和处理过程中被封闭或破坏的抗原决定簇重新暴露出来，从而能够与抗体发生特异性结合，被检测到。

二、抗原修复的方法（一）热诱导抗原修复（HIER）这是目前应用最为广泛的方法之一。

1、水浴加热法将切片浸泡在装有修复液的容器中，然后置于水浴锅中加热。

通常温度设定在 95 100℃，时间一般为 15 20 分钟。

2、高压加热法把切片放入装有修复液的高压锅中加热。

这种方法能在较短时间内达到较好的修复效果，一般加热 2 3 分钟，压力维持在 10 13 个大气压。

3、微波加热法将切片放入装有修复液的容器中，然后放入微波炉中加热。

加热时间和功率需要根据具体情况进行调整，一般为 5 15 分钟。

（二）酶消化法常用的酶包括蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。

酶的浓度和作用时间需要根据组织类型和抗原特性进行优化。

（三）非加热抗原修复法例如使用某些化学试剂，如尿素等，来实现抗原修复。

三、抗原修复液的选择常见的抗原修复液有柠檬酸盐缓冲液（pH 60）、EDTA 缓冲液（pH 80 90）和 TrisEDTA 缓冲液（pH 90）等。

不同的修复液对于不同的抗原和组织具有不同的效果，需要根据实验条件进行选择。

四、抗原修复的注意事项（一）组织切片的准备切片的厚度要适中，一般为 3 5 微米。

过厚的切片可能导致修复不均匀，过薄的切片则容易在操作过程中受损。

（二）修复液的配制要严格按照配方准确配制修复液，确保 pH 值和浓度的准确性。

同时，修复液要新鲜配制，避免长时间存放导致失效。

（三）温度和时间的控制这是抗原修复的关键因素。

抗原修复方法及注意事项一、抗原修复的原理在组织样本的处理过程中，如固定、脱水和包埋等，抗原的表位可能会被遮蔽或改变，导致抗体无法有效地与之结合，从而影响检测结果的准确性。

抗原修复的目的就是通过一系列的处理方法，恢复抗原的天然构象和表位，使其能够被抗体识别。

二、常见的抗原修复方法1、热诱导抗原修复（HeatInduced Antigen Retrieval，HIAR）水浴加热法：将切片放入装有修复液的容器中，在水浴锅中加热至一定温度并保持一定时间。

高压锅加热法：在高压锅中加入适量的修复液和切片，加热至喷气后维持一定时间。

微波加热法：将切片置于装有修复液的容器中，在微波炉中进行加热。

2、酶消化抗原修复蛋白酶 K：常用于消化细胞和组织中的蛋白质，暴露抗原表位。

胰蛋白酶：对某些抗原具有较好的修复效果。

3、非热诱导抗原修复酸处理：如使用柠檬酸等酸性溶液进行处理。

碱处理：如使用氢氧化钠等碱性溶液进行处理。

三、不同方法的优缺点1、热诱导抗原修复优点：操作相对简单，效果较为稳定，适用于大多数抗原。

缺点：可能会导致组织形态的一定改变，需要严格控制加热时间和温度。

2、酶消化抗原修复优点：对于某些特定的抗原修复效果较好。

缺点：酶的浓度和作用时间较难掌握，容易造成过度消化或消化不足。

3、非热诱导抗原修复优点：对组织形态的影响较小。

缺点：效果可能不如热诱导修复方法显著，适用范围相对较窄。

四、抗原修复的注意事项1、修复液的选择根据抗原的性质和实验要求选择合适的修复液。

常见的修复液有柠檬酸盐缓冲液、EDTA 缓冲液等。

不同的修复液可能对不同的抗原具有不同的修复效果，需要进行预实验摸索。

2、温度和时间的控制热诱导抗原修复时，温度过高或时间过长可能会导致组织过度损伤，影响形态和抗原性；温度过低或时间过短则可能修复效果不佳。

一般来说，水浴加热法的温度通常在 95-100℃，时间 10-20 分钟；高压锅加热法喷气后 1-3 分钟；微波加热法根据微波炉的功率和样本数量而定，通常为 5-15 分钟。

抗原修复（免疫组化石蜡切片）抗原修复（免疫组化石蜡切片）用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。

抗原修复的几种常用方法（供参考）1. 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。

根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。

适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本：Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等2. 沸热修复：电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

3. 高压热修复：在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。

此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复）4. 酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。

胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。

适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等上海博耀生物技术有限公司免疫学实验室钟子期听懂了俞伯牙的琴音——“巍巍乎若高山，荡荡乎若流水”,俞伯牙视其为知音。

免疫组化抗原修复步骤免疫组化抗原修复，这可是个相当重要的环节呢！就好像给一个沉睡的宝贝轻轻唤醒一样。

首先啊，咱得准备好切片。

这切片就像是我们要精心雕琢的艺术品，得小心翼翼地对待。

把切片放进合适的容器里，就像是给宝贝找了个温暖的小窝。

接下来，就是关键的一步啦，选择合适的修复液。

这修复液就像是魔法药水，能让抗原重新焕发光彩。

不同的抗原可能需要不同的修复液哦，就像不同的人有不同的喜好一样。

选对了修复液，那效果可就大不一样啦！然后呢，把切片泡在修复液里，让它们好好地享受这个过程。

这时候啊，你就想象那些抗原在修复液里欢快地跳舞，慢慢地恢复活力。

可别着急哦，得给它们足够的时间来“苏醒”。

在这个过程中，温度也是很关键的哟！就像人洗澡水的温度得合适一样，修复液的温度也要恰到好处。

太高了不行，太低了也不行，得把握好那个度。

等抗原修复得差不多了，就把切片捞出来。

这捞出来的动作也要轻柔，可别把好不容易唤醒的抗原又给弄晕啦！然后用缓冲液冲洗一下，就像是给宝贝洗了个舒服的澡。

你说这免疫组化抗原修复是不是很神奇？它能让那些隐藏起来的抗原重新现身，为我们的研究和诊断提供重要的依据。

要是没有这一步，那很多重要的信息可能就被埋没了呢！想象一下，如果我们不重视抗原修复，那得出的结果可能就不准确啦，那岂不是会误导我们的判断？所以啊，可千万别小瞧了这看似简单的步骤哦！大家在做免疫组化抗原修复的时候，一定要认真仔细，就像对待自己最珍贵的宝贝一样。

每一个细节都不能马虎，只有这样，才能得到最可靠的结果呀！这可不是开玩笑的哟！总之呢，免疫组化抗原修复步骤虽然不算特别复杂，但每一步都很关键。

我们要用心去做好每一个环节，让抗原修复发挥出最大的作用。

这样我们才能在免疫组化的世界里游刃有余，发现更多的奥秘呀！。