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RNA抑制沉默和过氧化氢酶是CMV病毒2B蛋白与蛋白相互作用引起坏死的原因原文出处：Jun-ichi I, Bo MK, Hanako S, and Chikara M. Virus-Induced Necrosis Is a Consequence of Direct Protein-Protein Interaction between a Viral RNA-Silencing Suppressor and a Host Catalase[J].Plant Physiology Ò, August 2011, Vol. 156, pp.2026–2036.Virus-Induced Necrosis Is a Consequence of Direct Protein-Protein Interaction between a Viral RNA-SilencingSuppressor and a Host Catalase许多植物宿主发病是因为病毒蛋白相互作用，但植物病毒如何诱发某种疾病的症状还需要进一步的研究。
黄瓜花叶病毒（CMV-HL）可诱导在感染百合品系拟南芥（拟南芥）植物得离散坏死斑;其他的CMV株可诱导类似的斑点，但并不是所有都由CMV-HL诱导。
众所周知RNA沉默抑制CMV的原理是启动2b蛋白（2b），参与病毒的诱导。
在采用原位接近连接测定免疫染色和原生质的测定中，报告显示，CMV2b的直接交互Catalase3（CAT3）在受感染的组织，在分解中有一个关键酶的作用是有毒性的过氧化氢分解的。
有趣的是，CAT3，通常在细胞质（乙醛酸循环体）的局部，由2b和CAT3之间的相互作用到细胞核。
虽然CAT3在转基因植物中的过表达降低的CMV积累和延迟的病毒症状发展到一定程度，2b中似乎以中和过氧化氢酶的细胞有助于主机防御反应，从而有利于病毒感染。
我们的结果提供的证据表明，除改变的类型症状通过干扰微RNA途径和2b可以直接绑定到一个宿主因子是在清除蜂窝重要过氧化氢，从而与该主机因子干扰具体地说，导致一个特定坏死的诱导。
病毒基因沉默抑制因子与AGO蛋白结合抑制RNA沉默的研究进展作者：申永梅杨纪君霍晓辉田东方曹雪松来源：《天津农业科学》2012年第01期摘要：总结了RNA 沉默及病毒RNA 沉默抑制因子(VSRs)的研究进展，以及病毒基因沉默抑制因子利用甘氨酸/ 色氨酸(GW) 模型作为ARGONAUTE(AGO) 钩和寄主发生RNA 沉默的重要作用部位相互结合从而抑制基因沉默的研究机制。
通过研究发现，在酵母、动植物细胞中，一些包含GW 模型的蛋白质被认为是RNA 沉默效应复合物中AGOs 的重要协助者。
结果说明，GW 模型是一种能用于调节RNA 沉默途径活性的万能的、有效的工具，用GW 模型竞争性结合AGOs 并抑制寄主基因沉默可能是一种被许多病原菌用于抵抗寄主RNA 沉默的方法。
关键词： RNA 沉默； VSRs； AGO 蛋白； GW 模型中图分类号： Q74 文献标志码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.01.006Evolution of Restraining Host RNA Silencing by Binding of Viral Suppressor Protein and ArgonautesSHEN Yong-mei1, YANG Ji-jun1, HUO Xiao-hui1, TIAN Dong-fang2, CAO Xue-song1（1.College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng, Shandong 252059, China;2. Shandong Provincial Committee School,Jinan ,Shandong 250103,China）Ａｂｓｔｒａｃｔ: This paper summed up the evolution of RNA silence and viral suppressors of RNA silencing (VSRs) ,and viral suppressors of RNA silencing use glycine/ tryptophane (GW) motifs as an ARGONAUTE (AGO) hook inhibit gene silence by binding the important location of RNA silence. Through the study we found that, in yeast, animal and plant cells, some protein containing GW motifs was considered to be important partners of AGOs in RNA silencing effector complexes.The result indicated the GW motif seemed to be a universal and effective tool for regulating the activities of RNA silencing way, and many pathogens may use the method of GW motif competing for and restraining host AGOs to counteract host RNAi-based defenses.Key words: RNA silencing; VSRs; argonaute protein; GW motifesRNA 沉默是广泛存在于真核生物中的调控基因表达的保守机制，其作用是调控多种生物学功能，包括维持基因组的完整性、发育过程中基因的调控、控制多种生理活性和对外界各种非生物及生物刺激的响应等，特别是抗病毒反应[1]。
科学家揭示病毒抑制RNA沉默新机制
佚名
【期刊名称】《蔬菜》
【年(卷),期】2014(000)005
【摘要】近日，从中国农业科学院植物保护研究所获悉，周雪平研究团队与浙江大学农业与生物技术学院李正和研究团队在双生病毒与植物互作方面取得新的研究进展。
他们利用遗传学和分子生物学等技术手段，以系统翔实的实验证据揭示了双生病毒编码的一个致病因子通过调控植物内源基因沉默抑制子抵御寄主防卫反应的新机制。
【总页数】1页(P76-76)
【正文语种】中文
【相关文献】
1.科学家揭示病毒抑制植物RNA沉默新机制 [J],
2.科学家揭示双生病毒抑制植物基因沉默新机制 [J],
3.病毒抑制RNA沉默新机制 [J],
4.中国农科院植保所揭示病毒抑制植物RNA沉默新机制 [J],
5.日本科学家揭示流感病毒增殖关键蛋白（RNA聚合酶）的构造，查明了病毒共通的增殖机制，发现了抑制这种蛋白的化合物 [J],
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
病毒基因沉默抑制因子与AGO蛋白结合抑制RNA沉默的研究进展申永梅;杨纪君;霍晓辉;田东方;曹雪松【期刊名称】《天津农业科学》【年(卷),期】2012(018)001【摘要】总结了RNA沉默及病毒RNA沉默抑制因子(VSRs)的研究进展,以及病毒基因沉默抑制因子利用甘氨酸/色氨酸(GW)模型作为ARGONAUTE(AGO)钩和寄主发生RNA沉默的重要作用部位相互结合从而抑制基因沉默的研究机制.通过研究发现,在酵母、动植物细胞中,一些包含GW模型的蛋白质被认为是RNA沉默效应复合物中AGOs的重要协助者.结果说明,GW模型是一种能用于调节RNA沉默途径活性的万能的、有效的工具,用GW模型竞争性结合AGOs并抑制寄主基因沉默可能是一种被许多病原菌用于抵抗寄主RNA沉默的方法.【总页数】5页(P23-27)【作者】申永梅;杨纪君;霍晓辉;田东方;曹雪松【作者单位】聊城大学生命科学学院,山东聊城252059;聊城大学生命科学学院,山东聊城252059;聊城大学生命科学学院,山东聊城252059;山东省委党校,山东济南250103;聊城大学生命科学学院,山东聊城252059【正文语种】中文【中图分类】Q74【相关文献】1.沉默p53凋亡刺激蛋白抑制因子抑制结直肠癌细胞的增殖 [J], 伍海军;何宏;梁昱;袁君;周蓉蓉;黄进;申良方2.shRNA介导的Y-盒结合蛋白-1表达沉默抑制神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的体内成瘤能力 [J], 王弘;李雪;迟昨非;王汝南;郝良纯3.马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用 [J], 霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松4.植物病毒基因沉默抑制因子研究进展 [J], 吴蓓蕾;王锡锋5.中国番茄黄化曲叶病毒编码的RNA沉默抑制子AC4蛋白的核酸结合特性 [J], 张馨月;章颉;邓凤林;吴建祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
马铃薯Y病毒属病毒的致病机理及植物抗性机制研究进展作者：张莉娟林垠孚吴凤李今朝农耀京来源：《农业研究与应用》2021年第01期摘要：马铃薯Y病毒属病毒是世界范围内影响范围广、危害严重并造成重大经济损失的病毒属之一，侵染的物种主要有茄科、豆科、藜科等农作物和经济作物。
本研究综述了近年来关于马铃薯Y病毒属病毒的致病机理和植物对抗此类病毒的抗性机制，为更好的理解和防控马铃薯Y病毒属病毒提供理论参考。
关键词：马铃薯Y病毒属致病机理植物抗性中图分类号：Q93 文獻标识码：AResearch Progress on Pathogenesis of Potyvirus and Plant Resistance MechanismZHANG Lijuan1， LIN Yinfu2， WU Feng1， LI Jinzhao1， NONG Yaojing1（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China;2College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005， China）Abstract： Potyvirus is one of the most widely distributed viruses in the world， causing serious damage and huge economic losses. The main species infected by Potyvirus are Solanaceae，Leguminosae and Chenopodiacea. This article reviews the pathogenesis of Potyvirus and the plant resistance mechanism to Potyvirus in recent years， so as to provide theoretical reference for better understanding， prevention and control of Potyvirus.Key words： Potyvirus; pathogenesis; plant resistance马铃薯Y病毒属是迄今为止最大的植物RNA病毒属，国际植物病毒分类委员会（ICTV）在2017年公布的数据显示，共发现160个马铃薯Y病毒属种类病毒。
PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究作者：刘洋周鹏庹德财唐庆华言普黎小瑛沈文涛来源：《热带作物学报》2021年第08期摘要：芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）和槟榔坏死环斑病毒（Areca plam necrotic ringspot virus， ANRSV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中分别可诱导十字花科作物和槟榔产生坏死病症的2种不同属病毒。
VPg（Viral protein genome linked）作为与马铃薯Y 病毒科病毒基因组5′端的结合蛋白，在病毒复制、翻译和运动等侵染过程中发挥重要作用。
本研究利用In-Fusion克隆策略分别构建了可表达3′端融合Strep蛋白标签序列的ANRSV和TuMV VPg全长编码基因的马铃薯X病毒（Potato virus X， PVX）载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。
通过农杆菌渗透注射接种本生烟（Nicotiana benthamiana），利用RT-PCR、Strep蛋白标签亲和层析和Western blot等方法证明了PVX病毒载体能够介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生烟中系统表达，且发现这2种VPg蛋白的过量表达诱导本生烟叶片产生了不同程度的系统性坏死病症。
进一步采用DAB和NBT染色，在产生坏死症状叶片中检测到大量活性氧（reactive oxygen species， ROS）的积累。
因此，推测VPg可能是TuMV和ANRSV诱发植物病症产生的一个决定因子，为后续研究这2种病毒诱导症状形成机制奠定了基础。
关键词：芜菁花叶病毒;槟榔坏死环斑病毒;马铃薯X病毒;VPg蛋白;侵染;本生烟Abstract： VPg （viral protein genome-linked）is a protein that is covalently attached to the 5′ end of positive strand viral RNA and acts as a primer during RNA synthesis in Potyviridae. Turnip mosaic virus （TuMV， genus Potyvirus） and Areca plam necrotic ringspot virus （ANRSV，genus Arepavirus） are typical members of in the family Potyviridae and cause damaging disease in many kinds of Brassicaceae and Areca catechu， respectively. In this study， we constructed Potato virus X （PVX） -based vectors pPVX-VPg-AR and pPVX-VPg-Tu for individually expressing TuMV， ANRSV- encoded VPg protein （VPg-AR and VPg-Tu） with a Strep-tag in Nicotiana benthamiana plants by agroinfiltration. The expression of recombinant VPg-AR and VPg-Tu was identified using RT-PCR of total RNA and western blot analysis of strep-tagged proteins from PVX-VPg-AR and pPVX-VPg-Tu -infected plant leaves， respectively. The ectopic expression of VPg-AR and VPg-Tu caused severe systemic necrosis in N. benthamiana. Further study revealed that the overexpression of VPg-AR and VPg-Tu resulted in accumulation of reactive oxygen species （ROS） after 3，3′-diaminobenzidine （DAB）-HCl and nitroblue tetrazolium （NBT） staining for detect ion of H2O2 and O2− radicals in PVX-VPg-AR and PVX-VPg-Tu-infected plant leaves.The results demonstrated that VPg might be a pathogenicity determinant that plays key roles in symptom formation of TuMV and ANRSV.Keywords： Turnip mosaic virus; Areca nut necrotic ringspot virus; Potato virus X; VPg protein; infection; Nicotiana benthamiana馬铃薯Y病毒科（Potyviridae）是仅次于双生病毒科（Geminiviridae）的第二大植物病毒科和第一大植物RNA病毒科[1-2]。
《马铃薯晚疫病菌不同生长时期miIRNA let-7对PIK-A基因的调控机制研究》篇一马铃薯晚疫病菌不同生长时期miRNA let-7对PIK-A基因的调控机制研究一、引言马铃薯晚疫病菌是一种常见的植物病原菌，对马铃薯等农作物的生产造成严重威胁。
近年来，随着分子生物学技术的不断进步，人们开始对这种病菌的遗传调控机制进行研究。
MicroRNA （miRNA）是一种在植物和生物体内发挥重要调控作用的小分子RNA，其在基因表达中扮演着关键角色。
本文将针对马铃薯晚疫病菌不同生长时期miRNA let-7对PIK-A基因的调控机制进行深入研究。
二、材料与方法（一）实验材料1. 马铃薯晚疫病菌样品：选取不同生长时期的马铃薯晚疫病菌作为研究对象。
2. 生物信息学工具：包括生物数据分析软件、序列比对工具等。
（二）实验方法1. RNA提取与纯化：采用适当的试剂和操作方法提取不同生长时期马铃薯晚疫病菌的RNA，并进行纯化。
2. miRNA和PIK-A基因序列分析：通过生物信息学工具对miRNA let-7和PIK-A基因的序列进行比对和分析。
3. 实时荧光定量PCR：利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期马铃薯晚疫病菌中miRNA let-7和PIK-A基因的表达水平。
4. 转基因实验：构建过表达和沉默PIK-A基因的转基因马铃薯晚疫病菌，观察其生长特性和致病力变化。
三、实验结果与分析（一）miRNA let-7在马铃薯晚疫病菌中的表达规律通过对不同生长时期马铃薯晚疫病菌中miRNA let-7的表达水平进行实时荧光定量PCR检测，发现miRNA let-7在病原菌生长的不同阶段均有一定程度的表达，且在特定生长阶段表达量较高。
（二）miRNA let-7与PIK-A基因的相互作用关系通过生物信息学工具对miRNA let-7和PIK-A基因的序列进行比对和分析，发现二者之间存在潜在的互补配对关系。
进一步通过实验验证，证实了miRNA let-7可以与PIK-A基因的mRNA 结合，从而抑制其翻译过程。
dsRNA介导的沉默抑制子抗马铃薯Y病毒病的研究的开题报告题目：dsRNA介导的沉默抑制子抗马铃薯Y病毒病的研究一、研究背景马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是马铃薯生产中的一种常见病害，其主要通过昆虫带菌传播。
PVY可导致马铃薯产量降低、质量下降，严重时会导致植株死亡。
传统的病害控制方式多采用化学药剂喷洒，但存在药剂残留和环境污染的问题。
因此，寻找一种有效的生物技术控制PVY是至关重要的。
基因沉默技术是一种通过靶向基因序列，使其转录或翻译受到干扰的技术，已被广泛应用于作物病虫害防治领域。
其中，双链RNA（dsRNA）介导的沉默抑制子技术是一种重要的基因沉默技术。
在该技术中，通过合成dsRNA干扰目标基因的转录或翻译，从而实现抗病害应用的目的。
二、研究目的本研究旨在探讨dsRNA介导的沉默抑制子对马铃薯Y病毒病的防治作用及其机理，寻找一种生物技术方法，有效地控制PVY的传播。
三、研究内容1. 设计合成dsRNA根据PVY的基因序列，设计合成dsRNA，包括PVY CP基因和HC-Pro基因的dsRNA。
2. 配制dsRNA处理马铃薯通过采用浸泡、注射等方式，将dsRNA处理马铃薯，考察其对马铃薯的影响。
3. 分析dsRNA处理对PVY感染的影响将PVY接种于dsRNA处理的叶片上，通过RT-qPCR、Western blot等方法分析处理前后PVY的表达水平、感染程度的变化。
4. 探究dsRNA介导的沉默抑制子的机理通过RNA干扰机理和蛋白质组学等方法，探究dsRNA介导的沉默抑制子对防治PVY的机理。
四、研究意义本研究将为绿色防控马铃薯Y病毒病提供一种新的生物技术手段。
同时，该研究也将增加对基因沉默技术的应用深度及机理研究，为研究基因沉默技术在植物防治病虫害方面的应用提供理论支撑。
马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松【摘要】马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子.通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO 共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现.研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】7页(P70-76)【关键词】马铃薯卷叶病毒(PLRV);P0蛋白;抑制RNA沉默;AGO蛋白;相互作用【作者】霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松【作者单位】聊城大学生命科学学院,聊城252059【正文语种】中文RNA沉默是一种由同源序列引起的特异RNA降解过程。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近来发现的一种重要的基因沉默现象，通常由双链RNA 介导。
1990年Napoli首次提出植物中的RNA沉默也称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。
高等植物对于病毒侵染有保护自身的防御机制，当病毒侵染植物时，由病毒RNA和mRNA介导的转基因会引起植物对病毒的抗性，称为病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。
它是转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）一种特殊形式。
但是，为利于病毒侵染，植物病毒也同时编码一种蛋白用来对抗RNAi，这类蛋白可以用于抑制RNA沉默的各个步骤，称为 RNAi 抑制因子［2］。
据报道已鉴定了50余种病毒编码的RSS，例如马铃薯Y病毒属（Potyvirus）中的蚜传辅助性蛋白酶（help component-proteinase，HC-Pro）［3］，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的2b，马铃薯X 病毒（Potato virus X，PXV）编码的p25、马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV）属编码的P0以及甘蔗黄叶病毒编码（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）的 P0 等［4］。
基因沉默抑制因子干扰基因沉默的机制有多种形式：抑制siRNA的积累；抑制因子与siRNA的结合，使之不能与蛋白核酸复合体结合形成RISC（RNA诱导的沉默复合物）；抑制双链RNA的形成；抑制因子与基因沉默核酸蛋白复合体相结合，阻止转录后基因沉默的发生。
AGO蛋白是RNA沉默途径中一个关键蛋白，AGO蛋白可以与小RNA的引导链及其他蛋白质组装形成的RNA诱导的沉默复合体（RISC）。
病毒编码的RSS与AGO相互作用的研究表明，AGO作为RNA沉默路径当中的关键蛋白可能会成为很多病毒RSS作用的靶位点，AGO蛋白正确组装成RISC需要多种dsRNA结合蛋白的协助，因此推测许多RSS利用其含有的“AGO 钩”（GW/WG重复，甚至只含有单个GW或WG）与AGO的竞争性结合来抑制RNA沉默。
最新研究发现，抑制因子中含有的重复甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是与AGO相互作用的关键氨基酸，基因序列中GW/WG重复二次至多次可以作为“AGO钩”（Ago hook）与AGO蛋白结合并在基因沉默中发挥作用［5，6］。
例如芜箐邹缩病毒（TCV）外壳蛋白P38中的二个GW重复是与AGO相互作用的关键氨基酸，而且P38与AGO互作的同时会影响DCL的表达［7］。
马铃薯卷叶病毒属于黄症病毒科家族的马铃薯卷叶病毒属中的黄化病毒组（Luteovirus），1916年被发现，是发现最早的马铃薯病毒，由多种蚜虫以持久性方式传播，而不能由机械传播，PLRV的分布主要局限于在寄主植株韧皮部维管束内，主要侵染茄科（如马铃薯、番茄等）植物。
据报道，在我国北方地区造成的马铃薯产量的损失约为30%-40%，严重时候可达到80%-90%。
PLRV基因组结构为等轴对称，直径约24 nm。
PLRV的RNA的碱基组成大体上为28%A、23%U、25%C与24%G。
PLRV的基因组含有8个ORFs，其中有部分ORF重叠，在通过选择性的识别起始密码后再经过移码、通读终止密码子及利用亚基因组等各种策略分别翻译各 ORF［8］（图 1）。
P0是由 PLRV的 ORF1所编码，它是病毒侵染植株后引起病症的决定性因子，并且是一种RSS。
图1 马铃薯卷叶病毒基因组结构目前已鉴定的马铃薯卷叶病毒属中的RSS只有马铃薯卷叶病毒（PLRV）、甜菜西方黄化病毒（BWYV）、南瓜蚜传黄化病毒（CABYV）和甜瓜蚜传黄化病毒（MABYV）编码的P0蛋白，但对其机制都还不清楚，而我们试图通过农杆菌瞬时表达渗透注射转GFP基因的16c烟草叶片研究PLRV-P0是否能抑制RNA沉默。
通过序列分析发现P0基因序列中含有两个重复的WG基序，我们首先将P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸（W）点突变为丙氨酸（A）（命名为P0WA），然后分别将P0和P0WA基因克隆到改造后的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-CE上，将 PLRV-P0，PLRV-P0WA分别和AGO共同进行农杆菌渗透注射野生型（N.ben）烟草叶片，并在荧光显微镜下观察PLRV-P0和AGO 及PLRV-P0WA和AGO共同注射后是否有绿色荧光的出现，从而确定PLRV-P0到底能否和AGO蛋白发生相互作用及其关键氨基酸。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料本氏烟草（Nicotiana benthamiana）以及转GFP基因的（16c）烟草种子由David Baulcombe教授惠赠。
1.1.2 菌种、质粒大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101，pWEIMING101载体均由本实验室保存，双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-CE以及重组质粒ASK-NE，ASK-CE，AGO-NE，pGR107P0WA均由本实验其他研究人员构建。
1.1.3 酶和试剂限制性内切酶（Xho I，Cla I，Sal I，Kpn I）和T4 DNA连接酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶及其缓冲液，dNTP购自TakaRa公司；胶回收试剂盒，质粒快速提取试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司；DNA分子量标准购自Fermentas公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 引物设计与合成根据GenBank中报道的PLRV-P0的基因序列，设计合成含有相关酶切位点的上下游引物并由上海生工生物工程公司合成。
1.2.2 目的基因的PCR扩增1.2.2.1 P0基因的PCR扩增以pER8的cDNA为模板，PLRV-P0 5'：GTTAGTCGACATGATTGTATTGACCCAGTCTG（下划线为Sal I酶切位点）；PLRVP0 3'：ACAGGGTACCTCATTCTTGTAATTCCTTTTGG（下划线为Kpn I酶切位点），1300-CE-P0 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（下划线为Cla I酶切位点）；1300-CE-P0 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下划线为Xho I酶切位点）为引物进行PCR扩增。
PCR反应体系为：pER8的cDNA 模板1 µL，10 × PCR Buffer 5 µL（含 Mg2+），2.5 mmol/L 的dNTP 4 µL，10 μmol/L上下游引物各1 µL，Taq DNA聚合酶1 µL，Pfu 0.5 µL，加去离子水至总体积为50 µL。
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共30个循环；72℃延伸5 min。
然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2.2 P0WA基因的PCR扩增 PLRV-P0的第87-140位氨基酸的原序列如下（方框内为两个WG基序）：WGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGWG 。
以重组质粒pGR107P0WA为模板PCR扩增，将PLRV-P0的第87、140位的色氨酸（W）点突变丙氨酸（A），突变之后的序列如下（方框内为两个WG基序突变后）：AGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGAG 。
以pGR107-P0WA质粒为模板，1300-CE-P0W-A 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（下划线为Cla I酶切位点）；1300-CE-P0WA 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下划线为Xho I酶切位点）为引物进行PCR扩增。
PCR反应体系为：pGR107-P0WA质粒DNA模板1 µL，10×PCR Buffer 5 µL（含Mg2+），2.5 mmol/L的dNTP 4µL，10 μmol/L上下游引物各1 µL，Taq DNA聚合酶1 µL，Pfu 0.5µL，加去离子水至总体积为50 µL。
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸5 min。
然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
