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30个马铃薯卷叶病毒CP基因序列分析韩树鑫2白艳菊*1,2张威1,2 高艳玲1,2范国权1,2张抒 1 申宇11.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，哈尔滨，1500862.东北农业大学，哈尔滨，150030摘要：通过对不同的含有PLRV的样品进行RT-PCR扩增，成功的克隆了PLRV CP基因，经比对样品的CP基因序列，核酸一致率为99.55%，仅发现了来自于广东的样品与其它样品有5个碱基的差异。
试验样品与国内以报道的PLRV CP基因进行进化分析，不同地区的PLRV CP 基因可分为A,B共2组，且有区域性特征，来自广东、云南及贵州的样品在两组中均有分布，但来自于内蒙古的样品仅聚类在A组。
而中国样品与其他国家PLRV CP基因相比较，经进化树分组后，主要分为S1和S2 两组，其中S1组中，包含了所有来自于我国的样品和绝大多数其它样品，且无规律可循。
而S2组中的样品仅只来自于埃及和波兰。
总体上，PLRV CP序列的差异仍然较小。
这说明目前PLRV病毒的种群基因较稳定。
关键词：马铃薯；卷叶病毒（Potato leaf roll virus, PLRV）；CP基因；序列分析中图法分类号：文献标示码：A 文章编号：Thirty Sequences Analysis of CP Gene of Potato Leaf Roll VirusHAN Shu-Xin1,BAI Yan-Ju*1，2,ZHANG Wei1,2, GAO Yan-Ling1，2,FAN Guo-Quan1，2,ZHANG Shu1, SHEN Yu11. Heilongjiang Academ of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China;2. Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;Abstract: We used RT-PCR to amplified the different samples that contain PLRV, and we successfully cloned PLRV CP gene,comparing the sample of gene sequence CP, that the nucleic acid concordance rate of all the samples was 99.55%, but the sample from Guangdong were found five bases different to other samples. We had analysed the test samples PLRV CP gene and other PLRV CP gene in China that had been published with phylogenetic tree, the samples from different area can be divided into two groups, we named group A and group B, and we have found the regional characteristics in the test samples, However, from Guangdong, Yunnan and Guizhou samples were distributed in all two groups, but the samples from Inner Mongolia only clusteringin the group A. The PLRV CP gene from Chinese samples compared with other countries PLRV CP gene that had analysed with phylogenetic tree, all the PLRV CP gene can also be divided intoS1 and S2 two groups, all the PLRV CP gene from China and most of other countries PLRV CP gene were included group S1, but there was no regulation,. In the group S2, there were only the PLRV CP gene from Egypt and Poland. In general, the differences of PLRV CP gene from different area were still small. Thus, the gene of the PLRV population is stable.Key words: Potato; Potato leaf roll virus ; PLRV ; CP gene; analysis of sequences收稿日期: 2015.4.20 修回日期：2015.8.20基金项目：现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-10-P14）作者简介：韩树鑫(1984—)，男，在读博士研究生，主要从事植物病理方向的研究。
马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松【摘要】马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子.通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO 共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现.研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】7页(P70-76)【关键词】马铃薯卷叶病毒(PLRV);P0蛋白;抑制RNA沉默;AGO蛋白;相互作用【作者】霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松【作者单位】聊城大学生命科学学院,聊城252059【正文语种】中文RNA沉默是一种由同源序列引起的特异RNA降解过程。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近来发现的一种重要的基因沉默现象，通常由双链RNA 介导。
1990年Napoli首次提出植物中的RNA沉默也称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。
高等植物对于病毒侵染有保护自身的防御机制，当病毒侵染植物时，由病毒RNA和mRNA介导的转基因会引起植物对病毒的抗性，称为病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。
陕西马铃薯卷叶病病原的分子生物学鉴定颜永杰;吴宽;谢海峰;高云芳【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)005【摘要】[目的]对陕西榆林疑似感染马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的病株毒源进行分子生物学鉴定,为陕西省马铃薯卷叶病的防治提供参考.[方法]根据GenBank数据库已报道的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列设计了1对引物,利用RT-PCR技术成功扩增了陕西PLRV·CP基因,然后进行克隆、测序,并与GenBank中已报道的27个PLRV分离物的CP基因进行同源性分析.[结果]获得的陕西PLRV·CP基因大小为627 bp,含有1个ORF,编码208个氨基酸的多肽,其与已报道的27个国内外PLRV·CP高度同源.[结论]陕西榆林的疑似病株确定为感染PLRV的马铃薯病株.【总页数】6页(P87-92)【作者】颜永杰;吴宽;谢海峰;高云芳【作者单位】西北大学,生命科学学院,陕西,西安,710069;西北大学,信息科学与技术学院,陕西,西安,710069;西北大学,生命科学学院,陕西,西安,710069;西北大学,生命科学学院,陕西,西安,710069【正文语种】中文【中图分类】S435.32;S432.4+1【相关文献】1.紫色卷叶病病因·病原鉴定和抗性苗应用研究 [J], 黄标;杨荣;夏李虹;赵家流;李江平;兀彦龙;陈植基;文尚华;陈士伟2.惠州市冬种马铃薯卷叶病毒病的发生、鉴定及气象影响因子研究 [J], 陈兆贵;张蒙;肖军委;胡成来3.宁夏贺兰山东麓葡萄卷叶病病原鉴定研究 [J], 李玉鼎;马占鸿;李明福4.马铃薯卷叶病毒陕西分离物外壳蛋白(CP)的生物信息学分析 [J], 颜永杰;吴宽;张珏;高云芳;谢海峰5.用生物素-亲和素-酶联免疫吸附法鉴定马铃薯卷叶病毒 [J], 侯燕军;张鹤龄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
陕北地区马铃薯Y病毒的RT-PCR检测及其序列分析冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2014(042)009【摘要】以陕北地区8个县(区)种植2～3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,Trizol 法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯Y病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计1对特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的DNA片段,1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.回收纯化CP基因片段并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性.结果显示,所有马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的、长度为400 bp的目的片段,表明这些马铃薯均感染了Y病毒;陕北8个县(区)马铃薯Y病毒CP基因与国内外其他地区12个样品之间的序列一致性为88.4％～99.8％,表明马铃薯Y病毒的CP基因序列比较保守,不易发生变异.RT-PCR方法可快速、准确地检测马铃薯Y病毒,从而为马铃薯茎尖剥离脱毒生产脱毒种苗(薯)提供依据.【总页数】5页(P941-944,967)【作者】冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁【作者单位】榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000;榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000;榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000;榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000【正文语种】中文【中图分类】S435.32【相关文献】1.陕北地区马铃薯X病毒CP基因的RT-PCR检测及其序列分析 [J], 冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁2.加工番茄马铃薯Y病毒一步法RT-PCR检测及CP基因的克隆与序列分析 [J], 梁学超;向本春;程朝玲;苏海娣;郑银英3.陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析 [J], 冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁4.榆林地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析 [J], 冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁5.2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析 [J], 钱琨;顾丙泉;王明珍;金文杰;秦爱建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
山西农业科学2022，50（7）：1036-1042Journal of Shanxi Agricultural Sciences山西省马铃薯病毒病生物芯片检测及分析冯海旭，王新华，李娇，李娟，孟泽，曹挥，冯雪（山西农业大学植物保护学院，山西太谷030801）摘要：为了明确山西省马铃薯病毒种类、发生和分布情况，于2019—2020年在山西省晋北、晋中和晋南的8个马铃薯主产地共采集319份疑似病样，采用生物芯片检测技术对样品进行了马铃薯病毒的检测。
结果表明，共检测到阳性样本305份，共检测到马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯X病毒（PVX）5种病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）1种类病毒；8地采集样品的病毒检出率均大于90.00%。
侵染类型包括单一病毒侵染和2种或多种病毒复合侵染，病毒单独侵染占阳性样本的比例为40.00%，多种病毒复合侵染占阳性样本的比例高达60.00%，PVY在单病毒侵染中检出率最高，占比为35.74%；PVY+PLRV在2种病毒复合侵染组合中检出率最高，占比为16.61%；PVY+PVM+PLRV在3种病毒复合侵染组合中检出率最高，占比为8.78%；PVY+PVS+PVM+PLRV在4种病毒复合侵染组合中检出率最高，占比为9.40%。
表明山西省马铃薯主产区病毒病发生较为普遍，PVY是优势病毒，多种病毒复合侵染是病毒在田间的主要存在形式。
关键词：马铃薯病毒病；病毒检测；生物芯片检测；山西省中图分类号：S435.32文献标识码：A文章编号：1002‒2481（2022）07‒1036‒07Biochip Detection and Analysis of Potato Virus Diseases in Shanxi ProvinceFENG Haixu，WANG Xinhua，LI Jiao，LI Juan，MENG Ze，CAO Hui，FENG Xue（College of Plant Protection，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：The purpose of this study is to clarify the species,occurrence and distribution of potato virus in Shanxi province. From2019to2020,319suspected disease samples were collected from8main potato producing areas in northern,central and southern of Shanxi province,and the samples were detected for common potato viruses by biochip detection technology.The results showed that a total of305positive samples were detected,and five viruses and one viroid were detected,including potato virus Y（PVY）,potato leaf roll virus（PLRV）,potato virus M（PVM）,potato virus S（PVS）,potato virus X（PVX）,and potato spindle tuber viroid（PSTVd）;the virus detection rates of samples collected in8places were>90.00%.The infection types included single virus infection and two or multiple viruses co-infection.The single virus infection accounted for40.00%of the positive samples,the multiple virus co-infection accounted for60.00%of the positive samples,and the detection rate of PVY in single virus infection was the highest,35.74%;the detection rate of PVY+PLRV in the two viruses co-infection combination was the highest,16.61%;among the three viruses co-infection combination,PVY+PVM+PLRV had the highest detection rate of8.78%;among the four viruses co-infection combination,PVY+PVS+PVM+PLRV had the highest detection rate of9.40%.The results indicated that the occurrence of virus disease was common in the main potato producing areas of Shanxi province,PVY was the dominant virus,and the co-infection of multiple viruses was the main form of virus in the fields.Key words：potato virus diseases;virus detection;biochip detection;Shanxi province马铃薯（Solanum tuberosum L.）又名洋芋、土豆等，属茄科多年生草本植物，原产于南美洲安第斯山区[1]，具有丰富的营养价值。
30个马铃薯卷叶病毒CP基因序列分析韩树鑫2白艳菊*1,2张威1,2 高艳玲1,2范国权1,2张抒 1 申宇11.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，哈尔滨，1500862.东北农业大学，哈尔滨，150030摘要：通过对不同的含有PLRV的样品进行RT-PCR扩增，成功的克隆了PLRV CP基因，经比对样品的CP基因序列，核酸一致率为99.55%，仅发现了来自于广东的样品与其它样品有5个碱基的差异。
试验样品与国内以报道的PLRV CP基因进行进化分析，不同地区的PLRV CP 基因可分为A,B共2组，且有区域性特征，来自广东、云南及贵州的样品在两组中均有分布，但来自于内蒙古的样品仅聚类在A组。
而中国样品与其他国家PLRV CP基因相比较，经进化树分组后，主要分为S1和S2 两组，其中S1组中，包含了所有来自于我国的样品和绝大多数其它样品，且无规律可循。
而S2组中的样品仅只来自于埃及和波兰。
总体上，PLRV CP序列的差异仍然较小。
这说明目前PLRV病毒的种群基因较稳定。
关键词：马铃薯；卷叶病毒（Potato leaf roll virus, PLRV）；CP基因；序列分析中图法分类号：文献标示码：A 文章编号：Thirty Sequences Analysis of CP Gene of Potato Leaf Roll VirusHAN Shu-Xin1,BAI Yan-Ju*1，2,ZHANG Wei1,2, GAO Yan-Ling1，2,FAN Guo-Quan1，2,ZHANG Shu1, SHEN Yu11. Heilongjiang Academ of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China;2. Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;Abstract: We used RT-PCR to amplified the different samples that contain PLRV, and we successfully cloned PLRV CP gene,comparing the sample of gene sequence CP, that the nucleic acid concordance rate of all the samples was 99.55%, but the sample from Guangdong were found five bases different to other samples. We had analysed the test samples PLRV CP gene and other PLRV CP gene in China that had been published with phylogenetic tree, the samples from different area can be divided into two groups, we named group A and group B, and we have found the regional characteristics in the test samples, However, from Guangdong, Yunnan and Guizhou samples were distributed in all two groups, but the samples from Inner Mongolia only clusteringin the group A. The PLRV CP gene from Chinese samples compared with other countries PLRV CP gene that had analysed with phylogenetic tree, all the PLRV CP gene can also be divided intoS1 and S2 two groups, all the PLRV CP gene from China and most of other countries PLRV CP gene were included group S1, but there was no regulation,. In the group S2, there were only the PLRV CP gene from Egypt and Poland. In general, the differences of PLRV CP gene from different area were still small. Thus, the gene of the PLRV population is stable.Key words: Potato; Potato leaf roll virus ; PLRV ; CP gene; analysis of sequences收稿日期: 2015.4.20 修回日期：2015.8.20基金项目：现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-10-P14）作者简介：韩树鑫(1984—)，男，在读博士研究生，主要从事植物病理方向的研究。
E-mail:pluto789@ *通讯作者：白艳菊. E-mail:yanjubai@马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus ，PLRV )，属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus )，主要侵染茄科植物，其能够引起马铃薯卷叶、黄化、矮缩、僵化及块茎网状坏死等病症，导致产量和品质下降。
PLRV是单分子正义ssRNA病毒，全基因组长610 Kb，其中第4个读码框（ORF3）是CP的编码序列，长627bp，编码产物为23kDa的多肽[1,2]。
该病毒于1916年被发现，病毒主要集中于寄主体内的维管束中，且含量低[3]。
PLRV 在田间以蚜虫持久性传播，持毒时间久，传播距离远[4]。
通常，蚜虫在马铃薯田中的密度比临近作物高，在马铃薯生长期间蚜虫密度逐渐增大，PLRV病毒感染率也随之增加[5]。
由于PLRV在中国马铃薯生产区普遍发生[6]，而病毒病防治没有特效药剂，一旦感病则无法治疗和控制，所以种薯病毒检测非常重要，通过检测剔除感染病毒的植株或切断传播途径防止扩散。
中国是一个幅员辽阔、地理气候等环境复杂的国家。
目前，马铃薯从南到北，从东到西，全国范围内广泛分布，PLRV在各地都有发生，且新的PLRV也会随种子资源的引进而发生同步引进的风险。
围绕PLRV的CP基因进行的研究比较普遍，但都是以地区划分，缺乏衔接和与国际上整体PLRV种群间的比对分析，而且，PLRV病毒是否随环境和气候的改变而有所不同尚无系统研究和阐述。
PLRV的CP基因还是PLRV检测单克隆抗体的重要来源。
本研究的开展有利于了解PLRV病毒的变异、重组，可以进一步了解我国PLRV的种群构成，有助于了解病毒的发生、流行特点，并为在生产中PLRV的检测鉴定、防治及其致病机理、抗病基因工程育种的研究提供理论支持和参考。
1 材料与方法1.1 试验材料试验使用的马铃薯材料来自于黑龙江省农科院植物脱毒苗木所，于2012-2014年采集，经ELISA检测感染PLRV的马铃薯样品30份（表1）。
表1：样品来源Table 1: Sample source1.2 引物的设计与合成根据已有的马铃薯卷叶病毒基因的保守序列，及常用于检测Total RNA质量的内参基因NAD5的保守序列，本试验共使用三对引物，其中PLRV-F/R用于鉴定马铃薯样品是否感染PLRV病毒，NAD5-F/R用于鉴定RNA是否符合试验要求。
同时设计了引物CP-PLRV-F/R用于扩增PLRV的CP序列。
引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。
表2：引物列表Table 2: The list of primers引物名称Primer ID 引物序列Sequence来源FromPLRV-F CGCGCTAACAGAGTTCAGCCXianzhou Nie（2001）[7] PLRV-R GCAATGGGGGTCCAACTCATNAD5-F CTCCAGTCACCAACATTGGCATAAKato, S.（1995）[8].NAD5-R GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTTCP-PLRV-F CGGAATTCATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGG本文CP-PLRV-R CCCAAGCTTCTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCA1.3 总RNA的提取植株总RNA的提取按照Trizol (Invitrogen) 试剂说明书步骤进行。
提取试验的所有离心操作均在4℃下完成，应用分光光度法测定RNA浓度及纯度，用电泳法检测RNA完整性。
1.4 RT-PCR检测及PLRV的CP序列扩增1.4.1 cDNA第一链的合成以感染PLRV的马铃薯叶片总RNA为模板，反转录合成cDNA 第一链，反应步骤为：在PCR管中加入模板RNA 4uL，Random primer 1 uL，用DEPC 水补齐至10uL。
65 ℃加热5 min。
冰上冷却2 min后像PCR管中加入5 × Buffer 5 uL，dNTP 1.25 uL （10 mmol/L），RNasin 0.5 uL (40 U/uL), M-MLV 1 uL( 200 U/uL)，用DEPC 水补齐至25uL。
在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：37 ℃1 h，70 ℃15 min (酶失活)后，冰上冷却，-20 ℃保存备用。
1.4.2 RNA 质量和马铃薯PLRV 病毒的双重RT-PCR 检测 以cDNA 第一链为模板，使用引物NAD5-F/R 和PLRV-F/R 进行双重PCR 扩增，使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
双重RT-PCR 鉴定PLRV 病毒及RNA 质量的步骤为：在PCR 管中加入制备的cDNA 2uL ，dNTP 2uL （2.5 mmol/ L ），rTaq 0.25uL （5U/ uL ），10× PCR Buffer 5 uL ，上下游引物(10 mmol/ L) 各 0.5 uL ，用DEPC 水定容到25uL 的反应体系。
PCR 扩增条件: 94℃ 2min 预变性后进行35个循环（ 94℃变性20s ， 55.5℃退火30s,，72℃延伸30s ）， 72℃延伸5min ，4℃存放。
