高密度培养

微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。

一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。

但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。

Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。

而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。

高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。

随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。

基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。

其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。

底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。

呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。

高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。

一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。

培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。

高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。

高密度培养裂壶藻的方法
1.准备培养基：将适量的碳源（如糖、淀粉等）、氮源（如硝酸盐、磷酸盐等）、微量元素（如钙、镁、锌等）混合溶解，加入适量的硫酸钠，调节pH值至7.0，加入适量的抗生素，搅拌均匀，即可得到培养基。

2.接种：将裂壶藻细胞悬浮液加入培养基中，搅拌均匀，放入培养箱，控制温度为25℃，光照强度为100μmol/m2/s，湿度为80%，接种后24小时即可观察到细胞的增殖。

3.培养：每隔24小时，将培养基更换一次，以保持培养基的新鲜，控制细胞的增殖，使细胞达到高密度。

4.收获：当细胞达到高密度时，可以将细胞收集，用离心机将细胞分离，然后用适当的消毒剂处理，即可得到高密度培养的裂壶藻细胞。

微生物的高密度培养定义一[1]高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。

单位：细胞干重/升（DCW/L）。

凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。

定义二[2]细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。

用途[1]各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。

发展状况[2]细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。

随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。

但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。

谷胱甘肽(GSH)的生产[3]谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。

迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。

微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。

一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。

但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。

Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。

而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。

高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。

随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。

基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。

其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。

底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。

呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。

高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。

一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。

培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。

高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。

2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。

答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。

重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。

通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。

在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。

关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。

重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。

目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。

分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。

大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。

产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。

但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。

因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。

1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。

现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。

表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。

微生物的个体生长：指细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。

繁殖：引起生命个体数量增加的生物学过程。

微生物细胞数目的检测方法：显微直接计数法：用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。

活菌计数法：通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌的方法，计数依据是在稀释情况下一个菌落由一个活细胞繁殖形成，又称平板菌落计数法。

微生物生物量的测定方法：1、湿重法将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。

2、干重法将离心得到的细胞沉淀物置于100~105℃的烘箱中干燥过夜至水分去除，然后再称重。

3、比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增加。

在一定浓度范围内，悬液中细胞的数量与透光量成反比，与光吸收值成正比。

因此利用分光光度计在450nm~650mn的某一波长可以测定培养物的光吸收值来确定细胞量。

4、生理指标法与微生物生长量相平行的生理指标很多，可根据实验目的和条件适当选用。

一般微生物细胞的含氮量比较稳定，故可用凯氏定氮法等测定其总氮量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量。

蛋白质含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。

1、丝状微生物菌丝长度测定法将真菌接种在琼脂平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。

2、培养料中菌体生长速率测定法主要测定一定时间内固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。

3、单个菌丝顶端生长速率测定法可利用湿室培养法对丝状微生物进行培养，定时将湿室中的培养有微生物的载玻片置于显微镜下，借助目镜测微尺测定一定时间内单个菌丝的伸长长度。

微生物的同步生长与同步培养方法同步培养法：使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。

同步生长：指这种培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式。

获得微生物同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：采用物理或化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段停止下来，使先到该阶段的微生物细胞不能进入下个阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进入下个生长阶段，达到诱导微生物细胞同步生长的目的。

高密度培养名词解释高密度培养是一种新型的生物技术，它可以促进生物体内的生长和强化存活率。

这种技术通过改变细胞增殖环境来提高培养基中细胞的生长和存活率。

通过使用高密度培养，生物技术人员可以研究出更多的生物分子，从而推动农业技术的发展和改善人类的生活质量。

高密度培养的定义是指在细胞培养基中添加大量细胞，以达到增加细胞的数量、形态和活力的效果。

在细胞培养基中，有多种不同的营养素，这些营养素可以为细胞提供必要的营养和养分，促进细胞增殖。

它也可以控制细胞环境，以确保它们具有良好的生长和存活率。

高密度培养技术也可以应用于细胞表面工程，以促进细胞增殖和调节细胞活动。

在细胞表面工程中，微米级的物质可以被放置在细胞表面，从而改变细胞表面蛋白的表达，影响细胞的生长和存活率。

同时，细胞表面工程也可以调节细胞的代谢过程，从而影响细胞的活性和特性。

高密度培养技术有助于提高培养细胞的速度和灵敏度，在很大程度上提高了细胞的存活比率。

高密度培养还可以节约种子和细胞培养基的成本，从而降低实验过程中制备细胞培养基的成本。

在细胞培养过程中，它还可以提高培养基的吸收率，使细胞增殖所需的时间减少。

此外，高密度培养技术还可以应用于基因工程中，从而更有效地避免变异。

基因工程是一种利用生物技术改变特定基因的技术，通过改变特定基因，可以改变外在表现。

高密度培养可以帮助基因工程技术更有效地抑制基因变异，从而提高改造后细胞的生长和存活率。

总之，高密度培养是一种先进的生物技术，可以有效地提高细胞的生长和存活率，从而提高农业技术的发展和改善人类生活质量。

这种技术的开发和应用不仅可以提高生物分子的研究和开发能力，而且还可以改善人们的健康和生活品质，为人类谋取更多的福祉。

凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究首先，凝结芽孢杆菌的筛选是研究的第一步。

目前主要的筛选方法有传统的培养方法和分子生物学方法。

传统的培养方法是基于形态学特征和代谢产物的产生情况进行筛选，但是这种方法耗时且效果不稳定。

而分子生物学方法则是通过采用特定基因的引入或剔除来筛选出产生或不产生胞外聚合物的菌株。

这种方法可以更准确地筛选出胞外聚合物产生量高的菌株，但需要一定的基因工程技术支持。

在获得高胞外聚合物产生菌株后，需要进一步研究其高密度培养工艺。

高密度培养是指在同一培养容器中培养细胞达到较高的细胞密度。

目前主要的培养方式有批量发酵、连续发酵和条件发酵等。

其中批量发酵是最常用的培养方式，可以通过调节培养基的成分和培养条件来提高胞外聚合物的产生量。

连续发酵则是将废液连续引出，新培养基连续加入，使细胞在养分过剩的状态下维持较高的细胞密度。

条件发酵则是通过在特定条件下培养菌株来提高产物的产生速率或产量。

例如，可以调节温度、pH值、氧气和碳源的浓度等来优化培养条件。

在高密度培养的过程中，酸碱度、氧气和碳源的供给等都会影响细菌的生长和产物的产生。

因此，需要对培养过程中的各种因素进行优化研究。

例如，可以通过反应动力学和代谢通量分析来优化培养菌株的条件。

通过调整培养基和培养条件，可以最大化胞外聚合物的产生量，并提高培养速率和产量。

此外，培养菌株的细胞稳定性也是高密度培养过程中需要考虑的问题。

在培养过程中，菌株可能会发生突变或丢失产物的能力。

因此，需要采取相应的措施来保持菌株的稳定性，例如进行定期的转接和冻存备份。

综上所述，凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺的研究对于进一步发展其产业应用具有重要意义。

通过选择合适的筛选方法获得高产的菌株，并通过优化培养条件和培养基，最大化胞外聚合物的产生量和培养速率，可以为凝结芽孢杆菌的应用提供更好的支持。

2022年四川农业大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、用孔雀绿和复红作细菌芽孢染色时，可使菌体呈______色，使芽孢呈______色。

2、不同病毒在不同的宿主细胞上可形成不同特征的聚集体，如在动物细胞内的______，细菌苔上的______，植物叶片上的______，昆虫细胞内的______，以及动物单层细胞上的______等。

3、微生物在糖酵解生成丙酮酸基础上进行的其他种类的发酵有丁二醇发酵、混合酸发酵、______发酵和______发酵等。

丁二醇发酵的主要产物是______，______发酵的主要产物是乳酸、乙酸、甲酸、乙醇。

4、按照对培养基成分的了解，培养基可分为______、______和______。

5、真核微生物包括______、______、______和______等几个大类。

6、著名的微生物学家Roger Stanier提出，确定微生物学领域不应只是根据微生物的大小，而且也应该根据有别于动、植物的______。

7、与单批发酵相比，微生物的连续发酵具有许多优点，如______、______、______和______等；同时，也还存在某些缺点，如______， ______和______等。

8、植物根际微生物对植物有害的方面有______和______等。

9、遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的______，它是指起始密码子AUG上游30～40核苷酸的一段非译区。

10、人体的白细胞种类很多，它们在免疫防御中具有重要作用，例如，具有吞噬功能的如______、______、______和______；无吞噬功能但在特异性免疫中作用极其重要的有两种，即______与______。

二、判断题11、由于支原体细胞膜上含有甾醇，因此，它们对于抗真菌的抗生素很敏感。

（）12、在促进扩散过程中，载体蛋白对被运输物质具有较高的专一性，一种载体蛋白只能运输一种物质。

（）13、凡能利用乙酸作为唯一碳源的微生物，必然存在着乙醛酸循环。

2022年四川师范大学生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、在没有显微镜的条件下，通过观察生长在______上的______形状或生长在______上的______现象，可推测某细菌可能长有鞭毛。

2、病毒的非增殖性感染有______、______和______3种类型。

3、微生物的4种糖酵解途径中，______是存在于大多数生物体内的一条主流代谢途径；______是存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径，为微生物所特有；______是产生4碳、5碳等中间产物，为生物合成提供多种前体物质的途径。

4、无氮培养基是用来分离______、按用途它属于______培养基、按成分属于______培养基。

5、真核生物细胞中核糖体附着在______的表面。

6、微生物在其体制等方面具有一系列的优势，如______、______、______、______和______等。

7、描述指数期的三个重要参数分别是：______、______和______。

8、磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：______、______、______。

9、四种引起细菌基因重组的方式是______、______、______和______。

10、IgG在木瓜蛋白酶的作用下，可产生2个相同的______（符号为______）和1个______（符号为______）。

二、判断题11、细菌的异常形态是细菌的固有特征。

（）12、大多数真菌需要高碳氮比的营养物，而动物致病细菌需要低碳氮比的营养物。

（）13、微生物的次生代谢物是微生物主代谢不畅通时，由支代谢途径产生的。

（）14、植物病毒一般均无包膜。

（）15、厚垣孢子是由有隔菌丝的真菌产生的。

（）16、根据16S和18S rRNA测序和统计结果所提出的三域学说来看，真核生物域与古生菌域更为接近。

（）17、细菌分裂繁殖一代所需时间为倍增时间。

（）18、在自然界氮元素循环的8个环节中，有6个是只有微生物才能运转，因此可以认为微生物是氮素循环中的核心生物。

2022年南京工业大学浦江学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、立克次氏体是一类______、______的原核生物，它与支原体的区别是______和______，与衣原体的区别是______、______和______。

专性寄生于植物韧皮部的立克次氏体，称作______。

2、纯化的病毒制备物应保持其______和______。

3、发酵工业的生产菌种主要来源：______、______和______。

4、按照对培养基成分的了解，培养基可分为______、______和______。

5、真菌无性孢子主要包括______、______、______、______、______、______和______，有性孢子主要包括______、______、______ 和______。

6、细菌分类鉴定的主要文献是______。

7、常用的活菌计数法有______、______和______等。

8、微生物将空气中的N2还原为NH3的过程称为______。

该过程中根据微生物和其他生物之间相互的关系，固氮体系可以分为______、______ 和______3种。

9、检出营养缺陷型一般有四种方法：① ______，② ______，③ ______和④ ______。

10、生理上的屏障结构有______和______。

二、判断题11、G＋菌的细胞壁结构只有一层，通常含有磷壁酸；G－菌细胞壁结构有两层，不含磷壁酸。

（）12、基团移位是借助于酶或定向酶系统实现的主动输送，因此不需要消耗能量。

（）13、化能自养微生物的产能效率、生长速率和生长得率都很低。

（）14、利用噬菌斑的形态和特点，可进行噬菌体的鉴定、分离和计数。

（）15、真核微生物染色质中的组蛋白，都是以八聚体形式存在于核小体中。

（）16、菌株的概念与克隆的概念相差甚远。

（）17、细胞大小相同的同种微生物可用来进行同步培养。

（）18、大量服用抗生素的患者同时要服用维生素，这是为了补充因肠道微生物受抑制减少维生素的合成。