体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法_差速贴壁_阿糖胞苷_胰酶法

ＣＲＴＥＲＰ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ武汉理工大学生物材料与工程研究中心，湖北省武汉市４３００７０殷义霞★，女，１９７９年生，湖北省天门市人，汉族，武汉理工大学在读硕士，主要从事生物医学工程方面的研究。

ｙｉｎｙｘ７１＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：李世普，教授，武汉理工大学生物材料与工程研究中心，湖北省武汉市４３００７０ｌｉｓｈｉｐｕ４６＠１２６．ｃｏｍ国家重点基础研究发展计划资助（２００５ＣＢ６２３９０５）＊中图分类号：Ｒ３２９．２文献标识码：Ｂ文章编号：１６７３－８２２５（２００７）０７－０１２８４－０３收稿日期：２００６－０８－２８修回日期：２００６－１２－０２（０６－５０－８－６４４２／ＺＳ・Ｘ）体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法：差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法＊★殷义霞，李世普，闫玉华，袁琳，王欣宇ＰｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｓｉｎｇｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏｗｉｔｈＮａｓｈ’ｓｍｅｔｈｏｄ，ｃｙｔａｒａｂｉｎｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔＡＩＭ：Ｔｏｓｅｔｕｐａｎｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｕｓｅｆｕｌｍｅｔｈｏｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｕｒｉｆｙｔｈｅｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇｃｅｌｌｓ（ＯＥＣｓ）ｏｆｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｓｉｎｖｉｔｒｏｔｈｒｏｕｇｈｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ：ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｉｎＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｎＪｕｎｅ２００６．①Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（Ｓｉｇｍａｗｉｔｈｔｈｅｂａｔｃｈｎｕｍｂｅｒｏｆｗ１０５６２），ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＨａｎｇｚｈｏｕＳｉｊｉｑｉｎｇ），ｔｒｙｐｓｉｎ（Ａｍｅｒｅｓｃｏ），ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ），ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ），ａｎｄｎｅｕｒａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＮＧＦＲ－ｐ７５）．②ＦｉｖｅＷｉｓｔｅｒｒａｔｓｏｆ３ｄａｙｓｏｌｄｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｅｘｅｃｕｔｅｄａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｄｉｐｐｅｄｉｎｔｏｇｒａｉｎａｌｃｏｈｏｌｔｏｏｂｔａｉｎｔｗｏｏｕｔｅｒｌａｙｅｒｓｆｒｏｍｔｈｅｏｌｆａｃｔｏｒｙｂｕｌｂｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｎｄｉｇｅｓｔｅｄｉｎｔｏ１．２５ｇ／ＬｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏｓｅｐａｒａｔｅｔｈｅＯＥＣｓｆｏｒｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｉｎｖｉｔｒｏ．③ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆＮａｓｈ＇ｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ｃｙｔａｒａｂｉｎｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｅｉｇｈｔｅｅｎｈｏｕｒｓｌａｔｅｒ，ｔｈｅｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇｌｉｑｕｉｄｏｆｎｏｎ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｃｅｌｌｓｗａｓｄｉｖｅｒｔｅｄｔｏａｎｏｔｈｅｒｃｕｌｔｕｒｅｖｅｓｓｅｌｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｎａｌｌｏｆａｔｔａｃｈｍｅｎｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｉｖｅｒｔｅｄｔｏ０．１ｇ／Ｌｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ２ｄａｙｓ．Ａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ４８ｈｏｕｒｓｉｎｔｈｅ２ｍｇ／Ｌｃｙｔａｒａｂｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｐｄａｔｅｄｗｉｔｈｆｒｅｓｈｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ．Ａｆｔｅｒ１ｄａｙ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｌｅａｎｅｄｔｗｉｃｅｗｉｔｈｔｈｅＨａｎｋｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｎｄｉｇｅｓｔｅｄｆｏｒ１０ｍｉｎｕｔｅｓｗｉｔｈ１．２５ｇ／Ｌｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｐｕｒｅｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２０％ｗａｓａｄｄｅｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙｗｈｉｌｅｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｅｎｓｅｄａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｂｏｄｙｔｕｒｎｅｄｉｎｔｏｒｏｕｎｄ，ｓｏａｓｔｏｐｒｅｐａｒｅｆｏｒｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇｌｉｑｕｉｄ．④Ｔｈｅｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｎｅｕｒａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｔｏｏｂｓｅｒｖｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＯＥＣｓｕｎｄｅｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｉｎｖｅｒｓｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＡｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｍａｓｃｕｌｉｎｅｒａｔｅｏｆＯＥＣｓｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＲＥＳＵＬＴＳ：①ＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｌｉｖｅＯＥＣｓ：ＣｕｌｔｕｒｅｄＯＥＣｓａｐｐｅａｒｅｄｗｉｔｈｂｉｐｏｌａｒｏｒｍｕｌｔｉｐｏｌａｒｓｌｅｎｄｅｒａｎｄｉｎｔｅｒｌａｃｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｌｉｍａｎｄｉｎｔｅｒｌａｃｅｄｗｉｔｈｅａｃｈｏｔｈｅｒ．②ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯＥＣｓｓｔａｉｎｅｄｂｙＨＥ：Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｔｒｉａｎｇｌｅａｎｄｆｕｓｉｆｏｒｍｗｉｔｈｌｏｎｇｐｒｏｃｅｓｓ，ｒｅｄｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ａｎｄｂｌｕｅｋａｒｙｏｎｓ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１－３ｂｌｕｅ－ｂｌａｃｋｎｕｃｌｅｏｌｉｉｎｔｈｅｋａｒｙｏｎｓ．③ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯＥＣｓｓｔａｉｎｅｄｂｙＧＦＡＰｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｂｉｐｏｌａｒｏｒｍｕｌｔｉｐｏｌａｒｓｌｅｎｄｅｒａｎｄｉｎｔｅｒｌａｃｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓｗｅｒｅｂｒｏｗｎａｎｄｔｈｅｎｕｃｌｅｏｌｕｓｅｓｗｅｒｅｈａｚｅｌ．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ９１．５％．④ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯＥＣｓｓｔａｉｎｅｄｂｙＰ７５ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｍｏｓｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅａｎｄａｐｐｅａｒｅｄｇｒｅｅｎ．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ８９％．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇＯＥＣｓｗｉｔｈＮａｓｈ＇ｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ｃｙｔａｒａｂｉｎｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎｉｓａｖａｉｌａｂｌｅａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓｅｅｄｃｅｌｌｓｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｎｅｒｖｅｇｕｉｄｉｎｇｒｅｃｏｖｅｒｙｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＹｉｎＹＸ，ＬｉＳＰ，ＹａｎＹＨ，ＹｕａｎＬ，ＷａｎｇＸＹ．ＰｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｓｉｎｇｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏｗｉｔｈＮａｓｈ＇ｓｍｅｔｈｏｄ，ｃｙｔａｒａｂｉｎｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕｙｕＬｉｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ２００７；１１（７）：１２８４－１２８６（Ｃｈｉｎａ）［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０７－７／７ｋ－１２８４（ｐｓ）．ｐｄｆ］摘要目的：通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定，建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法。

方法：实验于２００６－０６在武汉理工大学完成。

①阿糖胞苷（Ｓｉｇｍａ，批号ｗ１０５６２）；胎牛血清（杭州四季青产品）；胰蛋白酶（Ａｍｒｅｓｃｏ）；多聚赖氨酸（Ｓｉｇｍａ）；胶质纤维酸性蛋白，神经生长因子受体蛋白抗体（博士德）。

②选取出生３ｄ内的Ｗｉｓｔａｒ大鼠５只，乙醇浸泡后断头处死，取嗅球的最外两层，通过１．２５ｇ／Ｌ胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞，体外原代培养。

③采用Ｎａｓｈ差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法纯化嗅鞘细胞。

培养１８ｈ后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中，再培养３６ｈ，重复上述步骤移入０．１ｇ／Ｌ多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养，纯化后的细胞在２４ｈ内陆续贴壁，常规培养２ｄ，加入终浓度为２ｍｇ／Ｌ的阿糖胞苷，作用４８ｈ后，换上新的培养基，继续培养１ｄ，弃去培养基，用无钙镁的Ｈａｎｋｓ液清洗２次，然后用１．２５ｇ／Ｌ的胰酶消化１０ｍｉｎ，待细胞突起回缩、胞体变圆时，立刻加入纯血清终止，其血清终浓度为２０％，制备单细胞悬液。

④倒置显微镜下观察其形态变化，苏木精－伊红染色，同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞，并计算嗅鞘细胞阳性百分率。

结果：①活细胞形态观察：分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起，且突起细长，相互交织。

②嗅鞘细胞的苏木精－伊红染色鉴定：细胞呈三角形或梭形，有长的突起，胞浆被染成粉红色，胞核呈蓝紫色，胞核内深染的为核仁，有１～３个核仁。

③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定：细胞呈现棕黄色，胞核淡染，阳性细胞成网状连接，胞体多为三角形，有细长突起，阳性率９１．５％。

④嗅鞘细胞的Ｐ７５免疫组化染色鉴定：阳性细胞呈绿色，多数细胞染色阳性，阳性率８９％。

结论：实验所采用的Ｎａｓｈ差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行，为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。

关键词：细胞培养技术／方法；嗅球／细胞学；免疫组织化学殷义霞，李世普，闫玉华，袁琳，王欣宇．体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法：差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（７）：１２８４－１２８６［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０７－７／７ｋ－１２８４（ｐｓ）．ｐｄｆ］基础医学ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＣｈｉｎａＹｉｎＹｉ－ｘｉａ★，Ｓｔｕｄｙｉｎｇｆｏｒｍａｓｔｅｒ＇ｓｄｅｇｒｅｅ，ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａｙｉｎｙｘ７１＠１２６．ｃｏｍＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：ＬｉＳｈｉ－ｐｕ，Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａｌｉｓｈｉｐｕ４６＠１２６．ｃｏｍＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙ：ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒａｍＦｏｕｎｄｅｄｂｙｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．２００５ＣＢ６２３９０５＊Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２００６－０８－２８Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２００６－１２－０２中国组织工程研究与临床康复第１１卷第７期２００７－０２－１８出版ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＦｅｂｒｕａｒｙ１８，２００７Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．７１２８４ＣＲＴＥＲ沈阳１２００邮政信箱１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ殷义霞，等．体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法：差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法ＩＳＳＮ１６７３－８２２５ＣＮ２１－１５３９／Ｒｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ０引言嗅鞘细胞具有独特的促进中枢神经轴突再生的能力，在脊髓损伤领域已有众多的研究和报道［１－３］。