新生大鼠雪旺细胞原代培养方法改良

新生大鼠雪旺细胞原代培养方法改良

陈祥;赵明;周华山;胡火珍

【摘 要】对常用的阿糖胞苷处理及差速贴壁法进行大鼠雪旺细胞原代培养及纯化的方法进行改进.先用阿糖胞苷处理杀死大部分的成纤维细胞,再用抗-Thy-1.1抗体和兔补体处理去除残余成纤维细胞,获得纯化的雪旺细胞.此外,我们对抗-Thy-1.1抗体和兔补体的浓度、处理时间等都进行了改进,避免了由于雪旺细胞状态不好而引起的大量雪旺细胞死亡.此方法能够将雪旺细胞的纯度由90％提高到99％.

【期刊名称】《四川动物》

【年(卷),期】2012(031)003

【总页数】4页(P464-467)

【关键词】雪旺细胞;原代培养

【作 者】陈祥;赵明;周华山;胡火珍

【作者单位】四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064

【正文语种】中 文

【中图分类】Q95-33;Q421

雪旺细胞是外周神经系统的主要胶质细胞，在外周神经保护、促进外周神经纤维生长、构成髓鞘等方面具有重要的功能。它能促进神经发育过程中轴突的生长，促进神经修复和再生(Dezawa，2002)，保证神经纤维功能正常行使。雪旺细胞的病变能够引起多种疾病，如病理条件下的雪旺细胞是神经纤维瘤的主要形成细胞(Krasnoselsky et al.，1994)。为了深入相关研究，需要通过培养获得高纯度的雪旺细胞。目前常用的原代培养法获得的雪旺细胞纯度不高，细胞大量损失，获得的雪旺细胞数量少。本研究对培养方法进行改良，能够弥补上述缺点，获得大量的高纯度的雪旺细胞。现报道如下。

新生1～3 d的野生型SD大鼠5只，human neuregulin-β-1 EGF domain(R＆D cat#396-HB-050)，Forskolin(Sigma，F6886)，trypsin(Gibco cat#15090-046)，阿糖胞苷(Sigma cat#C6645)，L-15 培养基(Gibco cat#11415-064)，anti-Thy-1.1 antibody(Serotec cat#MCA04G)，rabbit

complement(Calbiochem cat#234400)，s100(abcam cat#ab34686)。

1.2.1 雪旺细胞的分离和培养 将新生大鼠置于冰上麻醉直至大鼠昏迷，在无菌条件下于解剖镜下取出其坐骨神经，放置在4℃ L-15培养基中待用。将收集好的大鼠坐骨神经在常温下以100 g的转速离心3 min，弃上层L-15培养基。加入5 mL事先预热含有0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的L-15培养基，于37℃水浴锅中消化30 min，每隔10 min轻轻摇动，然后50 g离心5 min。弃上清液，加入2

mL 10D培养基(含10%FBS的DMEM培养基并添加双抗)。用1 mL移液枪轻轻吹打使组织混匀成悬浊液，接种于poly-D-lysine处理过的6孔板中，置于培养箱(37℃，10%CO2，90%湿度)中培养 1 d(David et al.，1999)。

1.2.2 阿糖胞苷处理非特异性去除成纤维细胞纯化雪旺细胞 去除培养基，用1×PBS洗3次，更换为3 mL含有10 μM/mL阿糖胞苷的10D培养基培养48 h。

1.2.3 anti-Thy-1.1 antibody和rabbit complement特异性去除成纤维细胞纯化雪旺细胞 去除培养基，1×PBS洗两次，10D培养基洗一次，加入1 mL 10D培养基，添加20 μL anti-Thy-1.1 antibody混匀，在培养箱中放置15 min，加入150 μL rabbit complement混匀，在培养箱中放置30 min。移去培养基并用1×PBS洗3次，更换为3 mL含有human neuregulinβ-1 EGF domain(终浓度为10 ng/mL)和 Forskolin(终浓度为2.5 μM/mL)的10D培养基。

2 d后，重复用 anti-Thy-1.1 antibody和 rabbit complement处理的步骤，将处理时间分别缩短为10 min 和 20 min，用量分别缩减为 15 μL 和 112.5 μL，处理之后用1×PBS洗5次，确保抗体补体清洗干净，再换为事先预热好的3 mL含有human neuregulin-β-1 EGF domain(终浓度为10 ng/mL)和Forskolin(终浓度为2.5 μM/mL)的10D培养基。

密切关注雪旺细胞的生长状态，每天更换培养基，5 d后(若细胞状态不好可推迟)再一次用anti-Thy-1.1 antibody和rabbit complement处理，处理方式与第二次处理相同。

1.2.4 雪旺细胞的传代 待细胞长满后用D-Hanks洗涤细胞两次，再用0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液和D-Hanks以1∶14的比例混合消化传代。

1.2.5 雪旺细胞的鉴定 S-100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族，在周围神经系统，只有雪旺细胞强烈表达S-100蛋白，用S-100抗体来鉴定雪旺细胞是极其可靠的。将纯化后的雪旺细胞调整浓度并接种5000个于24孔板内的玻璃爬片上，待细胞长满玻片的70%后，取出进行S-100免疫荧光鉴定，具体操作如下:PBS漂洗5次，4%多聚甲醛固定15 min;PBS漂洗5次，5%羊血清封闭液室温下封闭1 h;PBS漂洗5次，一抗室温孵育2 h;PBS漂洗5次，二抗室温孵育1 h;PBS漂洗5次，DAPI室温孵育15 min;PBS漂洗5次，封片。

1.3.5 雪旺细胞的纯度统计 采用流式细胞仪检测雪旺细胞纯度，具体操作如下:制备单细胞悬液;细胞计数，取出1×106个细胞于试管中;用台盼蓝染色计活细胞数，检测到活细胞数＞95%;在试管中加入一抗，孵育45 min;PBS洗涤2次，1500

rpm，离心3 min，弃上清;加入二抗，孵育30 min;PBS洗1次，1500 rpm，离心 3 min，弃上清;加 300 μL PBS，上机检测。将5次的数据用Graphpad Prism 4软件进行统计。

取材同上，以等体积0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶的混合液于37℃条件下消化10 min，随后的过程同上，接种第二天在10D培养基中加入阿糖胞苷(终浓度为5

μg/mL)处理(李锋等，2006)24 h后即换入含有Forskolin(终浓度为2 μM/mL)和human neuregulin-β-1 EGF domain(终浓度为 20 ng/mL)的10D培养液。传代后经差速贴壁的方法再次纯化后传代(何晶等，2006)。

在阿糖胞苷处理之后，有大量的成纤维细胞已经死亡悬浮在培养基中，但是贴壁的细胞中仍有少量成纤维细胞。在每次anti-Thy-1.1 antibody和rabbit

complement处理完成后的第二天，都可以观察到培养基中有部分细胞悬浮死亡。在anti-Thy-1.1 antibody和rabbit complement三次处理完成后得到纯化的雪旺细胞。

在第三次处理完成后第三天，在普通倒置显微镜下观察到培养得到的细胞形态与常用的阿糖胞苷处理及差速贴壁纯化雪旺细胞法并没有很大差异(图1);用S-100进行免疫荧光染色，雪旺细胞呈绿色的双极或多极梭型形态，而成纤维细胞仅显示出蓝色的细胞核，检测到改良方法培养得到的雪旺细胞纯度较高(图2，B)，而常用的阿糖胞苷处理及差速贴壁纯化雪旺细胞法培养得到的雪旺细胞的纯度较低，有成纤维细胞的干扰(图2，A)。将5次平行实验获得的原代细胞都使用流式细胞仪检测雪旺细胞的纯度，得到稳定的结果，常用方法得到的雪旺细胞的纯度仅在90%左右(89.7% ～90.5%)，而改良方法得到的雪旺细胞的纯度达到了99%(98.7%～99.1%)，统计显示有显著差异(P＜0.05)。

雪旺细胞是外周神经系统的主要胶质细胞，在外周神经保护、促进外周神经纤维生长，构成髓鞘等方面具有重要的功能。在研究外周神经过程中，常常需要大量纯化的雪旺细胞。我们在分离纯化及培养雪旺细胞过程中进行了多项改良。

一般胶原酶的使用浓度是0.03%，处理时间是10 min，使用这一方法得到的雪旺细胞少。浓度改为0.1%、处理时间30 min时消化效果更好，可以减少吹打混匀过程中的吸吹次数，降低吸吹次数过多对雪旺细胞的影响，减少了雪旺细胞的损失。

阿糖胞苷是一种抗代谢药，能够干扰DNA合成从而杀死细胞，因成纤维细胞增殖快，而雪旺细胞生长迟缓，利用这两类细胞增殖速度和细胞周期的差异，能够杀死大部分成纤维细胞，但是阿糖胞苷并不是细胞特异性的增殖抑制剂，用阿糖胞苷处理必定会对雪旺细胞产生一定影响，我们利用这两类细胞的分裂周期差异，调整了浓度和处理时间，在杀死成纤维细胞的同时尽可能地降低其对雪旺细胞的影响。

在常用的阿糖胞苷处理及差速贴壁纯化雪旺细胞法中，利用成纤维细胞贴壁比雪旺细胞快的特点来去除成纤维细胞达到纯化雪旺细胞的目的，但是此方法的条件受多种因素的影响，不容易控制，不能完全去除成纤维细胞的干扰，而且会造成雪旺细胞的大量损失，使获得的雪旺细胞量少且纯度不高，所以我们在改良的方法中未采用差速贴壁法来纯化雪旺细胞。

通过阿糖胞苷处理培养的雪旺细胞仍然有少量的成纤维细胞无法去除。为了获得高纯度的雪旺细胞，我们先采用阿糖胞苷处理去除大部分的成纤维细胞，然后利用大鼠成纤维细胞表面有异体抗原Thy-1.1(Carey＆Stahl，1990)这一特性，运用了补体介导的细胞溶解来杀死残余成纤维细胞的方法，获得了高纯度雪旺细胞(纯度达99%)。在少量的运用了anti-Thy-1.1 antibody和rabbit complement处理的文献报道中，anti-Thy-1.1 antibody和 rabbit complement的处理次数最多为两次，两次处理之间的时间间隔为2天，而且两次的处理时间和使用浓度都分别与我们第一次处理所用的时间和浓度一样。在运用文献报道中的方式处理时我们发现，如果只处理一次，纯化后雪旺细胞的纯度仅为95%左右，如果处理两次，第二次处理之后会出现细胞状态不好的现象，细胞每天都有大量死亡。分析可能是由于以下几个原因所致:a.刚接种上的原代细胞中成纤维细胞较多，处理一次并不能完全去除成纤维细胞，而且由于成纤维细胞生长速度更快，所以只使用anti-Thy-1.1 antibody和rabbit complement处理一次纯化效率不高;b.使用的anti-Thy-1.1

antibody和rabbit complement中含有叠氮钠，对雪旺细胞有一定的损伤;c.培养基中还残留anti-Thy-1.1 antibody和rabbit complement;d.anti-Thy-1.1

antibody特异性并不是很强。因此，我们在方法上做了以下改进:a.将处理次数改为3次，将第二次和第三次处理的时间缩短，anti-Thy-1.1 antibody和 rabbit