⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-⼭东⼤学
⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数
【实验⽬的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体⽅法，并对⼩⿏脾细胞进⾏原代培养；
2.掌握⽆菌操作的具体过程及⽆菌操作台的使⽤；
3.学习掌握染⾊法鉴别细胞的⽣死状态的原理及⽅法；
4.学习使⽤⾎球计数板对细胞总数及活细胞数进⾏计数；
【实验原理】1.细胞培养
细胞培养指的是在⽆菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的⽣理环境，使离体的细胞在体外⽣长和繁殖，并且维持其结构和功能的⼀种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在⽆菌条件下，⽤胰蛋⽩酶消化或机械分散等⽅法，将动物组织分散成单个细胞开始⾸次培养长出单层细胞的⽅法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞⽣长增殖达到⼀定密度，形成致密的单层细胞时，⽤胰蛋⽩酶将细胞消化分散成单细胞，从⼀个容器中以1：2或其他⽐例转移到另⼀个容器中扩⼤培养的⽅法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
⾼等⽣物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某⼀群细胞在体的功能活动是⼗分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进⾏观察和研究，则要⽅便和简单得多。被培养的动物细胞是⾮常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进⾏研究可以帮助⼈类揭开⽣、⽼、病、死的规律，探索优⽣、抗衰⽼和防治各种疾病的途径和机制，也可以⼈为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于⼈类健康长寿的⽅向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分⼦机制⾮常重要的实验⼿段，被⼴泛应⽤于医学、⽣物技术、基因⼯程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他⽣物技术⽆可⽐拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因⼦分析；便于⼈们直接对细胞结构、细胞⽣长及发育等过程的观察；在⽣物学的各个领域（如分⼦⽣物学、细胞⽣物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被⼴泛应⽤。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有⼀定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体的状况；细胞培养得到的产物少。
实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养
引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外 模拟体内的生理环境， 使离体的细胞在体外生长和繁殖， 并且维持其结构和功能 的一种培养技术。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 从供体获得组织细 胞，在无菌条件下， 用胰蛋白酶消化或机械分散等方法， 将动物组织分散成单个 细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。 当培养的动物细胞 生长增殖达到一定密度， 形成致密的单层细胞时， 用胰蛋白酶将细胞消化分散成 单细胞，从一个容器中以 1：2 或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法， 称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
细胞培养的意义 :具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控 制，便于单因子分析； 便于人们直接对细胞内结构、 细胞生长及发育等过程的观 察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤 学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性： 在脱离机体复杂环境下， 细胞培养条件与躯体环境有一 定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物 少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最 适PH、营养条件和培养基质等。
1.实验材料 ：
实验室购买的雄性小鼠、 13.5 天孕鼠。
DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCI 8.00g,
Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH 2P04 0.20g，pH 调至 7.2，超纯水定容到 1000mL， 分装，121 C灭菌20 min）
2. 实验步骤 ：
2.1 处死小鼠
用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上, 使小鼠前 肢接触铁笼（后肢悬空） ,左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。左手拇指、食 指用力向下按压鼠头及颈部, 同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方, 造成颈椎 脱臼，造成小鼠立即死亡。 当小鼠停止抽搐，松开左手。将整个小鼠浸入盛有 75% 乙醇的烧杯中。
第1篇
一、实验目的
本实验旨在通过对原代细胞的分离、培养和鉴定，掌握原代细胞培养的基本操作流程，了解原代细胞的生物学特性，并对其进行准确的鉴定，为后续的细胞生物学研究奠定基础。
二、实验原理
原代细胞是指直接从生物体内提取的组织细胞，经过分离、培养后形成的细胞群体。原代细胞保留了其来源组织的遗传和生物学特征，能够反映生物体内细胞的真实状态。本实验采用组织块培养法分离原代细胞，通过显微镜观察细胞形态、生长状态以及进行细胞表面标志物的检测，对原代细胞进行鉴定。
三、实验材料与仪器
1. 实验材料
- 新鲜的组织样本
- 无菌培养皿、培养瓶
- DMEM培养基
- FBS（胎牛血清）
- 0.25%胰蛋白酶
- 10% FBS DMEM培养基
- 抗体（CD45、CD34等）
- 试剂：二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体、DAB显色剂等
2. 实验仪器
- 超净工作台
- 倒置显微镜
- 恒温培养箱
- 冰箱 - 低温高速离心机
- 分光光度计
四、实验方法
1. 组织块培养
（1）将新鲜的组织样本置于无菌培养皿中，用无菌手术刀将其切成1mm×1mm×1mm的小块。
（2）将组织块置于培养皿中，加入适量DMEM培养基，用移液枪吹打使其分散。
（3）将分散后的组织块转移至无菌培养瓶中，加入适量DMEM培养基和FBS，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
2. 细胞传代
（1）当细胞生长到约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞。
（2）消化后的细胞用10% FBS DMEM培养基终止消化，离心收集细胞。
（3）弃去上清液，加入适量DMEM培养基重悬细胞，按1:2的比例传代。
3. 细胞形态观察
（1）取部分细胞悬液，滴于载玻片上，进行染色。
（2）用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
4. 细胞表面标志物检测
（1）将细胞用PBS洗涤，离心收集细胞。
（2）加入抗体，4℃孵育1小时。
常见细胞种类及培养基
在细胞生物学研究中，细胞培养是一个重要的实验技术，能够使细胞在人工环境中生长并繁殖。在进行细胞培养实验时，选择适合的细胞种类和培养基非常重要。以下是一些常见的细胞种类及其对应的适宜培养基的介绍。
1.人类胚胎肾细胞（HEK293）
HEK293细胞是最常用的哺乳动物细胞系之一，广泛应用于分子生物学和生物医学研究。这些细胞具有良好的转染效率和细胞生长能力，适用于蛋白质表达、病毒复制和分泌蛋白的研究等领域。常见的HEK293培养基包括DMEM（Dulbecco修改的最小培养基）和Opti-MEM。
2.黑色素瘤细胞（A375）
A375细胞是人类的恶性黑色素瘤细胞系，广泛用于研究黑色素瘤的发生机制、治疗方法和抗肿瘤药物的筛选。这些细胞对细胞外基质的附着能力较强，在培养基中会形成有丝分裂的细胞凸起。常用的A375细胞培养基包括RPMI 1640（罗斯威尔 Park Memorial Institute）和DMEM。
3.人类胚胎肺纤维母细胞（MRC-5）
MRC-5细胞是一种常用的人类胚胎肺纤维母细胞系，通常用于研究呼吸系统疾病、病毒感染和疫苗培养等。这些细胞具有良好的生长性能，易于进行转染实验和病毒感染模型的建立。常见的MRC-5细胞培养基包括MEM（最小必需培养基）和DMEM。
4.小鼠肌肉细胞（C2C12） C2C12细胞是小鼠肌肉细胞的一个常用细胞系，广泛应用于肌肉发育和再生研究。这些细胞可以在培养基中分化成多核肌肉纤维，并模拟肌肉形成和运动等生理过程。常见的C2C12细胞培养基包括DMEM和FBS（胎牛血清）。
5.原代细胞
原代细胞是从组织或器官中直接分离并进行培养的细胞，与细胞系相比，原代细胞具有更接近体内环境的特点，常用于药物筛选、代谢研究和组织工程等领域。原代细胞的适宜培养基因品类繁多，如原代肝细胞可培养在Williams E培养基中，原代小鼠皮肤纤维母细胞可在MEM中进行培养。
