成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较

常用实验动物各种处死方法（一）大鼠和小鼠１脊椎脱臼法：右手抓住尾巴将动物放在鼠笼盖或粗糙的表面上向后拉，用左手拇指和食指用力向下按住鼠头，使颈椎脱臼（脊髓与脑髓拉断），动物立即死亡。

２断头法：此法适用于鼠类小动物。

用剪刀在颈部将鼠头剪断，并使颈部对准容器，以免血液四溅。

由于脑脊髓离断且大量出血，动物立即死亡。

３击打法：此法适用于大鼠、家兔等。

抓住动物尾部，提起，用力摔击头部，或用木捶用力捶其后脑部，动物痉挛后即处死。

４急性失血法：常剪断动物的股动脉，放血致死。

如果正在做手术性或解剖性实验，可剪断颈动脉，腹主动脉或剪破心脏放血。

可采用摘眼球法，右手取一眼科弯镊，在鼠右或左侧眼球根部将眼球摘去，并将鼠倒置；头向下，大量失血而致死。

５化学药物致死法：在一密闭容器内，预先放有浸有全身麻醉作用的乙醚或氯仿的棉花，将动物投入容器内，使动物吸入麻醉药而致死。

也可皮下注射士的宁（马钱子碱），注射量为小鼠０.７６～２.０ｍｇ／ｋｇ，大鼠为３.０～３.５ｍｇ／ｋｇ。

（二）狗、猫、兔、豚鼠１空气栓塞法此法适用于较大动物的处死。

向动物静脉内注射注入一定量的空气使之发生空气栓塞，形成严重的血液循环障碍而死。

兔、猫用此法处死需注入20～40ml空气，犬致死的空气剂量为80～150ml。

一般注如入后动物能很快死亡。

本法的优点是处死方法简单、迅速。

缺点是由于动物死于急性循环衰竭，各脏器淤血十分明显。

２急性失血法先使动物麻醉、暴露股三角区或腹腔，再切断股动脉或腹主动脉，迅速放血。

放血时可用湿纱布擦，或用少量自来水冲洗切口，以保持其畅通，动物在３～５分钟内即可死亡。

采用此法动物十分安静，对脏器无损害，但器官贫血比较明显。

小鼠等小动物可采用颈总动脉大量失血而致死的方法。

犬等大型动物要先麻醉后放血，要使放血的切口保持通畅，一般在股三角区横切约lOcm的切口，切断股动、静脉，便大量失血而死。

３破坏延脑法对家兔可用木捶用力捶其后脑部，损坏延脑，动物痉挛后死亡。

符合伦理的大鼠处死方法引言在大鼠的实验研究中，由于某些原因，我们常常需要对大鼠进行处死。

然而，在科学研究中，伦理问题一直备受关注。

本文将介绍一些符合伦理的大鼠处死方法，以确保对实验动物的尊重和避免不必要的痛苦。

1.麻醉和无痛处死方法为了尽可能减少大鼠的痛苦，我们可以首先使用麻醉剂将其处于无痛状态，然后再进行处死。

常见的麻醉和无痛处死方法包括：1.1.麻醉剂注射通过静脉或腹腔注射麻醉剂，如异氟醚或类似的麻醉剂，可以迅速使大鼠处于麻醉状态。

确保给予适量的麻醉剂，以充分麻醉大鼠并避免意识恢复。

1.2.快速颈部脱臼这是一种常用的无痛处死方法。

将大鼠的颈部抓紧，迅速向上用力扭转，使颈椎脱臼。

这一方法能够快速有效地使大鼠处于死亡状态，同时使大鼠避免痛苦。

1.3.高浓度二氧化碳（C O2）处死将大鼠置于密闭的容器中，逐渐充入高浓度的二氧化碳（C O2）。

CO2会引起缺氧和窒息，将大鼠迅速处死，避免痛苦。

2.合理的处死流程除了选择符合伦理的处死方法外，合理的处死流程也是非常重要的。

下面是一些建议的处死流程：2.1.事前准备在处死大鼠之前，必须做好充分的准备工作。

例如，清洁处死设备，准备好所需的处死工具和药物。

2.2.安全操作在进行处死操作时，一定要确保操作场所的安全。

避免操作过程中产生的意外事故，确保自身和他人的安全。

2.3.专业操作处死大鼠应由经验丰富的操作人员进行，以确保操作的准确性和高效性。

操作人员应具备相应的专业技能和知识。

2.4.注意观察在处死过程中，要时刻观察大鼠的反应变化。

确保它们在处死过程中没有出现异常反应，以免造成额外的痛苦。

结论为了确保伦理原则的尊重和科学研究的可靠性，在大鼠实验中，选择符合伦理的处死方法至关重要。

麻醉和无痛处死方法可以减少大鼠的痛苦，合理的处死流程则确保操作的安全和准确性。

通过遵循这些指导原则，我们可以更好地进行实验研究，同时保护实验动物的福利和利益。

大鼠完全性脊髓横断及坐骨神经损伤后运动终板变化作者：段强彭卫华1 樊继军席学礼陈磊【摘要】目的研究完全性脊髓横断及坐骨神经损伤后损伤平面以下乙酰胆碱酯酶(AChE)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide ，CGRP)在骨骼肌运动终板中的变化。

方法选取57只雌性大鼠，30只制作成完全性脊髓损伤及修复模型，24只制作成坐骨神经损伤模型，通过AchE组化染色、镀银染色和CGRP免疫组织化学法观察脊髓损伤和坐骨神经损伤后AChE、CGRP在运动终板分别1 w、1、3、6、12个月的改变。

结果脊髓损伤后1 w、1个月AChE组织化学显示与正常运动终板相比无明显变化(P>0.05)。

至3、6、12个月与正常相比有统计学差异(P<0.05);但12个月与6个月相比无统计学差异。

脊髓损伤后3个月时，CGRP免疫染色阳性部分与正常组相比有明显统计学差异(P<0.01)。

至6、12个月CGRP免疫阳性染色部位与正常相比有统计学意义(P<0.05)。

而坐骨神经损伤后AChE 含量下降，终板退变，CGRP含量明显降低甚至消失，镀银染色未发现改变。

结论脊髓损伤后功能相关蛋白含量下降，终板发生退变，退变程度明显较周围神经损伤后轻，这对于改善损伤脊髓功能后恢复运动功能提供了可能。

【关键词】运动终板;乙酰胆碱酯酶;降钙素基因相关肽;脊髓损伤;坐骨神经运动终板是运动神经元末梢与肌纤维连接的特化结构，损伤后其运动功能的恢复要依赖于运动终板结构的保存、再生、重建及其正常生理功能的恢复。

运动终板的病理变化和功能与选择的治疗方法、治疗效果的评价存在着密切的关系。

目前对于神经系统损伤后尤其是脊髓损伤后损伤平面以下联系效应器(骨骼肌)的神经乃至运动终板发生怎样的变化及变化程度文献报道亦有差异〔1，2〕，本研究采用组织化学、免疫组化等方法研究脊髓及坐骨神经损伤后乙酰胆碱酯酶(AChE)、降钙素基因相关肽(CGRP)在骨骼肌运动终板中的变化，探讨脊髓损伤后损伤平面以下骨骼肌的功能情况，为改善损伤后脊髓功能的研究奠定基础。

实验动物处死(鼠，兔类)标准操作规程(SOP)目的：遵循安乐死的原则，在不影响动物实验结果的前提下，使实验动物短时间无痛苦地死亡。

主体内容：一、颈椎脱臼（断颈）处死法此法是将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。

操作时实验人员用右手抓住鼠尾根部并将其提起，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，用左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离，实验动物立即死亡。

二、断头处死法此法适用于鼠类等较小的实验动物。

操作时，实验人员用左手按住实验动物的背部，拇指夹住实验动物右腋窝，食指和中指夹住左前肢，右手用剪刀在鼠颈部垂直将鼠头剪断，使实验动物因脑脊髓断离且大量出血死亡。

三、击打头盖骨处死法主要用于豚鼠和兔的处死。

操作时抓住实验动物尾部并提起，用木锤等硬物猛烈打击实验动物头部，使大脑中枢遭到破坏，实验动物痉挛并死亡。

四、放血处死法此法适用于各种实验动物。

具体做法是将实验动物的股动脉、颈动脉、腹主动脉剪断或剪破、刺穿实验动物的心脏放血，导致急性大出血、休克、死亡。

如兔等大动物应在轻度麻醉状态下，在股三角做横切口，将股动脉、股静脉全部暴露并切断，让血液流出。

操作时用自来水不断冲洗切口及血液，既可保持血液畅流无阻，又可保持操作台清洁，使实验动物急性大出血死亡。

五、空气栓塞处死法处死兔类常用此法。

向实验动物静脉内注入一定量的空气，形成肺动脉或冠状动脉空气栓塞，或导致心腔内充满气泡，心脏收缩时气泡变小，心脏舒张时气泡变大，从而影响回心血液量和心输出量，引起循环障碍、休克、死亡。

一般空气栓塞处死法注入的空气量兔为20~50ml。

六、过量麻醉处死法此法多用于处死豚鼠和家兔。

快速过量注射非挥发性麻醉药（投药量为深麻醉时的30倍），或让动物吸入过量的乙醚，使实验动物中枢神经经过过度抑制，导致死亡。

七、毒气处死法让实验动物吸入大量CO2等气体而中毒死亡。

实验动物的取血标准操作规程(SOP)目的：规范实验动物(家兔、狗，豚鼠，)取血的方法和途径,主体内容：（一）家兔1．耳缘静脉取血法选好耳缘静脉，拔去被毛，用二甲苯或酒精涂擦局部，小血管夹夹紧耳根部，使血管充血扩张。

脊髓全横断模型大鼠损伤区白细胞介素17的表达马超1，徐震2，王卓强2，邓诗源11徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室，江苏省徐州市221000；2解放军第309医院麻醉科，北京市100091Interleukin-17 expression in the injured site of a rat model of complete spinal cord transectionMa Chao1, Xu Zhen2, Wang Zhuo-qiang2, Deng Shi-yuan11Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou Medical College, Jiangsu Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Applied Technology, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 2Department of Anesthesiology, the 309 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China摘要背景：现阶段，针对已知的炎性递质的干预措施对于减轻脊髓继发损伤的效果局限。

白细胞介素17是重要的促炎性细胞因子，在中枢神经系统疾病发病机制中的作用正逐渐受到关注。

目的：观察急性脊髓损伤模型大鼠白细胞介素17 mRNA和蛋白表达的变化规律。

方法：健康雄性SD大鼠随机分为2组：模型组制作大鼠脊髓完全横断模型，假手术组仅剪开硬脊膜而不伤及脊髓实质。

开放后测定肢运动功能评分观察急性脊髓损伤对大鼠运动功能的影响，苏木精-伊红染色观察脊髓损伤后不同时间点组织病理学改变，实时荧光定量PCR、Western blot分别检测各组大鼠脊髓损伤后不同时间点白细胞介素17 mRNA和蛋白水平表达变化。

结果与结论：开放后肢运动功能评分结果：假手术组大鼠BBB评分均为20-21分，脊髓损伤1，2 d大鼠BBB评分均为0分，损伤后7 d BBB评分为0-3分(P < 0.05)。

Western blot 试验操作步骤一、蛋白样品制备1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中3 1000rpm，离心10min4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细胞转入EP管中5 4℃，4000rpm，离心5min6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净）7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液(10mg组织/100ul)若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ;蒸馏水至50ml; 混匀后4℃保存】8 4℃裂解30-45min，每5min振荡一次9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。

10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明）每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×）11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。

二、SDS-PAGE的配制：1 试剂及配制：（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。

（2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。

（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。

周时后肢３个关节均可见轻微到广泛的活动，ＢＢＢ评分为（５．１４±０．８０）分，其中１只大鼠ＢＢＢ评分达７分。

２．３大鼠脊髓损伤组织学变化建模后４周时，对照组大鼠脊髓硬脊膜光滑、完整，表面无瘢痕、粘连。

挫伤组及横断组可见损伤区脊髓变细，硬脊膜表面不光滑，瘢痕形成。

镜下见对照组大鼠ＨＥ染色可见白质内神经纤维沿脊髓纵轴方向排列有序，灰质细胞分布均匀、排列紧密，灰白质界限清晰，细胞分布均匀，纤维排列有序（图１）。

ＮＦ２００免疫组化可见沿脊髓纵轴方向排列有序的呈棕黄色的阳性神经纤维（图２）。

挫伤组大鼠ＨＥ染色可见脊髓组织部分坏死崩解造成的组织碎片、碎屑，灰白质界限不清，白质内神经纤维排列紊乱，可见较大空洞形成（图３）。

ＮＦ２００免疫组织化学染色脊髓腹侧面可见沿纵轴方向排列的呈棕黄色的阳性神经纤维，但在坏死、瘢痕区未见明显阳性纤维（图４）。

横断组脊髓断端几乎完全被瘢痕填充，连接脊髓断端（图５），瘢痕内无再生神经纤维（图６）。

裹ｌ３组大鼠后肢运动ＢＢＢ评分法观察结果（分．ｚ士ｓ）注：分组对大鼠后肢功能ＢＢＢ评分的影响有统计学意义（Ｆ＝９０．６２０．Ｐ＝０．０００）｝且评分时间与分组有交互作用（Ｆ＝１６．８５４，Ｐ＝０．０００），３组两两比较差异均具有统计学意义（Ｐｚ０．０００）圈１对照组脊髓纵切（ＨＥＸ４０）圈２对照组脊髓纵切（ＮＦ２００×４０）圈３挫伤组脊髓纵切（ＨＥ×４０）田４挫伤组脊髓纵切（ＮＦ２００×４０）圈５横断组脊髓纵切（ＨＥ×４０）图６横断组脊髓纵切（ＮＦ２００Ｘ４０）３讨论理想的ＳＣＩ模型应具备以下三方面条件：（１）临床相似性，即制作的ＳＣＩ模型应与临床相近似，尽量接近人类的情况；（２）可调控性，即可根据实际需要调整损伤强度，复制出不同损伤程度的ＳＣＩ模型；（３）可操作性与可重复性，即对ＳＣＩ模型制作的各关键步骤客观化、定量化，使其可信度高、可实施性强，能反映客观问题［２］。

关于成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较【关键词】脊髓切断术关键词: 脊髓切断术;神经纤维;空洞;轴突再生;大鼠摘要:目的比较成年大鼠4种脊髓全横断方法对后肢运动功能及脊髓组织学的影响. 方法 32只成年SD大鼠分为A，B，C和D4组，每组8只，分别以4种不同方法全横切T9脊髓.A组以尖刀片自左向右横行一次性切断脊髓;B组将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入并分别向两侧缓慢细心切断脊髓;C组将一丝线穿过脊髓腹侧硬膜外腔，以长刃显微剪一次性完全横断脊髓，并将丝线由断端间隙中拉出;D 组以尖刀片自脊髓背侧至腹侧分层快速划断脊髓，再抬起脊髓两断端以验证横断的完全性.术后1h肉眼观察脊髓形态变化，8wk时评估截瘫后肢自发性运动功能恢复后，处死动物，取脊髓损伤节段，行连续矢状冰冻切片，小鼠抗神经丝抗体免疫组化染色，光镜下观察有无神经纤维的残留或再生，以及空洞及瘢痕的形成. 结果A，B两组术后脊髓肿胀、外翻，8wk时分别有50%，38%的动物出现程度不等的功能恢复，镜下可见成束残留纤维和大量空洞.C，D两组术后脊髓外观良好，8wk时无功能恢复和残留纤维，但有少量神经丝免疫反应再生纤维.与D组相比，C组断端间隙较大且空洞较多. 结论经作者创新的D组方法，横断完全、损伤较小，为简便易行、效果可靠的脊髓全横断手术方法.Keywords:cordotomy;nerve fibers;cavities;axonal regen-eration;ratAbstract:AIM To compare the effects of four spinal cord transecting methods on spontaneous motor recovery in para-plegic hindlimbs and histological changes within the spinal cord in adult rats.METHODSThirty-two adult male SD rats were pided into Groups A，B，C and D（n=8for each group，which received one of the four methods of spinal cord transection at T9）.In Group A，the spinal cord was tran-sected with a sharp blade along the inner wall of the vertebral channel.The blade in Group B，however，was vertically in-serted through the cord at midline and guided to slowly and carefully cut the bilateral halves of the cord separately.In Group C，the cord was cut with a pair of long-edge microscis-sors，and the completeness of the transection wasverified by guiding a surgical suture through the ventral extradural space before and pulling the suture out through the gap betweenthe2stumps of the transected cord.The cord of Group D an-imals was dissected with a sharp blade in quick gashes，and complete transection was checked by uplifting one of the stumps.The appearance of the exposed spinal cord was ob-served with naked eyes1h after the surgery，and thelocomo-tor recovery of the hindlimbs was evaluated with the BBB rat-ing scale at8wk after surgery before sacrificing all animals.The damaged spinal cord segments were sectioned sagittally，prepared for anti-neurofilement immunostaining，and ob-served under a light microscope for any possible remaining and regenerating nerve fibers as well as the formation of cavi-tation and scars.RESULTS Spinal cord edema andectropi-on could be encountered1h after the surgery，and50%and38%animals showed different degrees of locomotor recovery and corresponding remaining nerve fibers with many scars and cavities8wk following the surgery in Groups A and B.As for Groups C and D animals，a better appearance of the cord without much edema and ectropion was observedat1h and no locomotor recovery could be revealed at8wk.A few neurofilament-positive regenerating，but not remaining，fibers were observed within the lesion site.Group C animals had a wider gap between the two stumps of the transected spinal cord and more cavities in the injured spinal segments than those animals in Group D.CONCLUSION The authors’innovated transecting method in Group D is easy and reliable because of its properties of the completeness of tran-section and relatively milder injury to the spinal cord.0 引言脊髓全横断是脊髓损伤修复研究的重要模型，但国际上目前尚无公认、统一的全横断模型，而不同的横断方法可直接影响横断的完全性、脊髓损伤的程度及修复的效果［1］ .我们探索、改良、创新并比较了4种不同的横断方法，试图建立一种简便易行、横断完全、损伤较轻的脊髓全横断模型.1 材料和方法1.1 材料成年雄性SD大鼠32只，体质量200～250g（第四军医大学实验动物中心提供），随机分为A，B，C和D4组，每组8只.1.2 方法戊巴比妥钠（50mg・kg-1 ）ip麻醉动物，纵行切开背部皮肤，钝性分离皮下和肌肉组织，咬除T9～10棘突并去除椎板至横突根部，暴露T10～11节段脊髓，纵行剪开硬脊膜后，分别以4种不同方法横断各组动物脊髓.A组:用锋利尖刀片自左向右紧贴椎管内骨壁横向切断脊髓，并沿两断端间隙反复切割;B组:将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入至腹侧椎管内骨壁，然后分别切断两侧脊髓组织，沿两断端间隙反复切割;C组:首先以特制微型引导器将一段5号丝线自右向左穿过脊髓腹侧硬膜外腔，轻牵丝线提起脊髓，以长刃显微手术剪一次性完全横行剪断脊髓，将丝线由脊髓断端间隙中拉出确认脊髓完全横断;D组:以尖刀片自脊髓左侧迅速轻划至中线处，划开软脊膜及部分脊髓组织.再在同一平面由右侧快速轻划至中线，沿这一切口以同样方法依次分层切断脊髓，最后抬起脊髓两断端，确认脊髓完全横断.各组动物均在术后1h观察脊髓外观的变化，之后逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤.所有手术和观察均在手术显微镜下完成.术后8h内im甲基强的松龙40mg，2wk内im青霉素（16万U・d-1 ）并po呋喃坦啶水溶液（500g・L-1 ），每日早晚2次按摩膀胱排尿，隔日悬吊鼠尾以减轻截瘫后肢的受压、水肿及皮肤擦伤.于术后8wk观察、记录动物于平面场地上的爬行，以一种新的用Basso，Beattie和Bresnahan三人姓氏首写字母命名的BBB体系［2］评估后肢运动功能的变化.小于4分为无运动功能恢复，正常运动功能则为21分.较其他既往常用的评估方法，这一体系可更为敏感地反映脊髓损伤后后肢运动功能恢复的轻微变化.运动功能评估后立即过量麻醉处死动物，40g・L-1 多聚甲醛常规灌注固定，取脊髓损伤区多个节段，连续矢状冰冻切片（厚14μm）.小鼠抗神经丝抗体（Sigma公司，1∶2000）免疫组化染色，Olympus BX60显微镜下观察.2 结果A组脊髓明显肿胀，切口不整、外翻，断端间隙较大，对合差;B组动物脊髓轻微肿胀，背侧切口不整、外翻，两断端间隙较小，对合尚可;C组脊髓无明显肿胀，切口最为平整、边缘无外翻，对合良好，但断端间隙较大（1.5～2.0mm）;D组脊髓无明显肿胀，切口较整齐、断端间隙小（<1.0mm），对合最佳.2.1 肢运动功能截瘫后A组编号为1，2，4和7的4只动物有运动功能恢复，BBB评分为5，11，8和6，其余4只BBB评分<4，无运动功能恢复.B组3只动物（编号为3，5和7）后肢出现不同程度的自发性运动功能恢复，BBB评分为5，7和10，另5只动物仅有后肢关节轻微反射运动，BBB评分<4，无运动功能恢复.C，D两组动物均无运动功能恢复，BBB评分<4（Tab1）.表1 实验鼠术后8wk BBB最高评分略2.2 形态学变化 4组动物脊髓损伤区正常结构遭破坏，形成范围、形态各异的瘢痕组织，两侧脊髓实质内散布大小、数量不一的空洞及点状或串珠状神经丝免疫反应溃变纤维，并与散在其间和损伤区内少量长度与生长方向不同、纤细柔软的神经丝免疫反应新生纤维形成鲜明对照.A，B组脊髓损伤区瘢痕组织不规则，A组空洞形成的严重程度甚于B组.有后肢运动功能恢复的动物，其脊髓腹侧或腹外侧均可见数量不等、成束的神经丝免疫反应纵行纤维（Fig1，2）.C，D两组损伤区横行瘢痕组织将脊髓组织完全隔断，未见神经丝免疫反应残留纤维，C组空洞形成程度明显轻于A，B组（Fig3）.D组脊髓两断端吻合佳，瘢痕组织增生轻，空洞形成不明显（Fig4）.图1 －图4 略3 讨论我们尝试以不同方式全横断脊髓，旨在找出最大限度减小脊髓原发性及继发性损伤的最佳手术方法.A和B两组缓慢的切割方法仍对柔软的脊髓造成明显的挤压伤，使脊髓受到较大的扰动，加重了原发性和继发性损伤，尤以A组为甚.C组脊髓断端最为平整，术后短期内亦未见明显肿胀.但采用特制的微型引导器由硬膜外穿丝线时，常引起脊髓周围血管丛较多的出血，并可能对脊髓腹侧造成撞击伤.另外，以长刃显微剪一次性横行剪断脊髓时，脊髓有较为明显的挤压变形，极有可能造成脊髓更为严重的继发性损害，因为损伤区及其周围形成大量空洞和瘢痕的形态学表现，确实与术后1h肉眼观察征象极不相称.D组采用锋利刀片快速分层横断方法，术后1h观脊髓断端虽不如C组整齐，但脊髓同样无明显肿胀，且断端间隙甚小，吻合满意.镜下观察也是4组中最为满意的.由于椎管内壁粗糙不平，虽经刀片反复切割仍易造成脊髓腹侧或（和）腹外侧组织的漏切，且难以在术中获知脊髓是否被完全切断，于是A和B两组分别有50%，40%的动物出现不同程度的神经纤维残留和运动功能恢复.残留神经纤维导致运动功能恢复的原因在于神经元的自我调整和轴突出芽，促进了脊髓内局部神经环路的解剖学塑形及其与上下行通路的突触联系［3］ .C和D两组在术中足以证实横断的彻底性，无须连续切片证明.由于C 组在以微型引导器穿线时易致出血及腹侧脊髓损伤，因而D组应为损伤最小的可靠方法.尽管Tatsushi等发现锐利的切割可减轻新生大鼠的延髓水肿，并使切断的锥体束纤维获得满意再生.本实验虽明显减轻了D组成年大鼠的脊髓损伤，却并未在再生纤维的形态和数量上取得优于其他组的结果，成年哺乳动物的再生神经纤维难以逾越损伤造成的瘢痕和空洞.因此，必须求助于其他手段诱导再生纤维通过损伤区，恢复已遭破坏的神经联系［4］ .参考文献［1］Tatsushi I，Saburo K，Kaoru K.Spontaneous regeneration of the pyramidal tract after transection in young rats ［J］.Neurosci Lett，1998;247:151-154.［2］Basso DM，Beattle MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats ［J］.J Neu-rotrauma，1995;12（1）:1-21.［3］Zhang Z，Guth L，Steward O.Mechanisms of motor recovery after subtotal spinal cord injury ［J］.Exp Neurol，1998;149:221-264.［4］Li Y，Field PM，Raisman G.Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells ［J］.Science，1997;227:2000-2002.。

第1篇一、实验目的1. 观察脊髓横切后的生理现象。

2. 了解脊髓横切对机体运动和感觉功能的影响。

3. 掌握脊髓横切实验的操作步骤。

二、实验原理脊髓是中枢神经系统的重要组成部分，具有传导神经冲动、调节运动和感觉的功能。

脊髓横切实验可以模拟脊髓损伤，观察脊髓横切后机体运动和感觉功能的改变，从而了解脊髓的生理功能。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠（体重20-25g）2. 实验仪器：手术显微镜、手术刀、剪刀、镊子、缝针、缝线、生理盐水、酒精、碘伏等3. 实验试剂：0.9%氯化钠溶液、2%戊巴比妥钠溶液、2%碘伏溶液四、实验步骤1. 实验动物准备：选取健康小鼠，用2%戊巴比妥钠溶液进行麻醉，待动物完全麻醉后，固定于手术台上。

2. 背部皮肤消毒：用碘伏对实验动物背部皮肤进行消毒。

3. 背部皮肤切开：用手术刀在实验动物背部正中切开皮肤，长度约为2-3cm。

4. 分离肌肉组织：用剪刀剪开肌肉组织，暴露脊髓。

5. 脊髓横切：用手术刀在脊髓正中横切脊髓，注意避免损伤脊髓周围的神经和血管。

6. 缝合伤口：用缝针和缝线将皮肤和肌肉组织缝合，确保缝合牢固。

7. 观察脊髓横切后的生理现象：观察实验动物的运动和感觉功能改变，包括行走、肢体活动、疼痛反应等。

8. 实验动物恢复：待实验动物清醒后，观察其恢复情况。

五、实验结果与分析1. 脊髓横切后，实验动物的运动功能受到影响，表现为肢体活动不协调、步态不稳等。

2. 脊髓横切后，实验动物的感觉功能受到影响，表现为对疼痛反应减弱或消失。

3. 随着时间的推移，实验动物的运动和感觉功能逐渐恢复，但恢复程度因个体差异而异。

六、实验结论1. 脊髓横切实验可以模拟脊髓损伤，观察脊髓横切后机体运动和感觉功能的改变。

2. 脊髓横切对机体运动和感觉功能有显著影响，但具有可恢复性。

3. 脊髓横切实验为研究脊髓生理功能和损伤修复提供了实验依据。

七、实验讨论1. 脊髓横切实验中，实验动物的运动和感觉功能受到不同程度的影响，这与脊髓横切损伤的程度有关。

Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)脊髓损伤的行为学评分脊髓损伤的行为学评分1、BBB法评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。

将动物放置于平台上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。

评分分三部分第一部分为0一7分,评判动物后肢各关节活动第二部分为8一13分,评判后肢的步态及协调功能第三部分为14一21分,评判运动中爪的精细动作,三项满分为21分.实验动物分别在损伤后第周进行评分"Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评分及脚印分析术前3 d，每天由2 人分别对动物进行BBB 运动功能评分。

术后1 d、3 d 及每周对动物进行BBB 评分。

评分2 人不了解实验进程及分组情况。

在实验过程中，对BBB 评分大于8 分的动物进行脚印分析：将动物的前后足分别用绿红2 种染料标记后，置于预先铺有白纸的7.5 cm×100 cm 的跑道中，使动物从一端跑到另一端，计算大鼠同侧前后足中心的距离（interlimb coordination，ILC）及后肢第3 足趾的外旋角度(angle of rotation，AR)进行分析。

分数特征说明0无可观察到的后肢运动HL：（hind-limb，HL）后肢11或2个HL关节轻度活动轻度：≤5%关节活动范围21个HL关节大幅运动和另一关节轻度活动大幅：＞50%关节活动范围32个HL关节大幅运动2个关节：通常为髋和膝4所有3个HL关节轻度活动3个关节：髋、膝、踝；第3个关节通常为踝52个HL关节轻度运动和第3个关节大幅运动62个HL关节大幅运动,第3个关节轻度活动7所有3个HL关节大幅运动8不负重拖动或足置于不负重位拖动：节律性伸展3个HL关节,身体侧卧9足底仅位于负重位,或偶尔/频繁/持续以足背负重步行,无足底负重步行负重：足底负重位时或仅在后躯干抬高时,HL伸肌收缩10偶见负重步行,但前、后肢不协调偶尔:＞5%且≤50%：步行：足底负重触地，HL前置使足底再次触地11由频繁到持续负重步行,但无前一后肢协调频繁：51%-94%观察期；持续：95%-100%观察期12由频繁到持续负重步行,偶见前一后肢协调6%-50%协调运动13由频繁到持续负重步行,频繁前一后肢协调51%-95%协调运动14持续协调足底步行,优势爪在刚触地和抬起时旋转频繁足底步行,持续前一前肢协调,偶尔足背侧旋转：当其触地或抬起时后爪内或外旋15持续协调足底步态,当前肢向前时无或偶有伸趾,优势爪在刚触地时平行平行：后爪在刚触地或抬起时与躯干平行伸趾：听趾，拖踏音，及足音中无趾拖踏音16持续协调足底步态,频繁伸趾,优势爪触地时平行，抬起时旋转频繁伸趾：一半以上足音中无趾拖踏音17持续协调足底步态,频繁伸趾,优势爪在触地及抬起时均平行18持续协调足底步态,持续伸趾,优势爪在触地及抬起时均平行持续伸趾：4min观察期中仅有≤4次趾拖踏音19基本内容同18，尾在部分或全部观察期中垂20基本内容同18，尾持续上翘，但躯体不稳尾上翘：不触地：躯体不稳：当快速移动时,重心侧移,出现摇摆、倾斜、滑倒21基本内容同20，且躯体持续稳定躯体持续稳定：无滑倒,骨盆环与尾在运动时保持一直线B B B表评分项目表2、斜板实验(Rivline ta l.,1 977):总体评估四肢肌力。

实验动物的处死⽅法1．颈椎脱⾅法：是⼤、⼩⿏最常⽤的处死⽅法。

⽤拇指和⾷指⽤⼒往下按住⿏头，另⼀只⼿抓住⿏尾，⽤⼒稍向后上⽅⼀拉，使之颈椎脱⽇，造成脊髓与脑髓断离，动物⽴即死亡。

2．空⽓栓塞法：主要⽤于⼤动物的处死，⽤注射器将空⽓急速注⼊静脉，可使动物致死。

当空⽓注⼊静脉后，可在右⼼随着⼼脏的跳动使空⽓与⾎液相混致⾎液呈泡沫状，随⾎液循环到全⾝。

如进⼊肺动脉，可阻塞其分⽀，进⼊⼼脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发⽣严重的⾎液循环障碍，动物很快致死。

⼀般兔与猫可注⼊10～20ml空⽓。

狗可注⼊70～150ml空⽓。

3．急性⼤失⾎法：⽤粗针头⼀次采取⼤量⼼脏⾎液，可使动物致死。

豚⿏与猴等皆可采⽤此法。

⿏可采⽤眼眶动、静脉⼤量放⾎致死。

具体⽅法参看本章第五节，⼤、⼩⿏眼眶动、静脉的取⾎⽅法。

狗和猴等在⿇*醉状态下，暴露出动物的颈动脉，在两端⽤⽌⾎钳夹住，插⼊套管，然后放松近⼼端的钳⼦，轻轻压迫胸部，尽可能⼤量放⾎致死。

狗也可采⽤股动脉放⾎法处死。

硫喷妥钠 20～30mg／kg静脉注射，狗则很快⼊睡，然后暴露股三⾓区，⽤利⼑在股三⾓区作⼀个约10cm的横切⼝，将股动、静脉全部切断，⽴即喷出⾎液，⽤⼀块湿纱布不断擦去股动脉切⼝处的⾎液和凝块，同时不断⽤⾃来⽔冲洗流⾎，使股动脉切⼝保持通畅，动物3～5min内可致死。

4．吸⼊⿇*醉致死法：应⽤⼄醚吸⼊⿇*醉的⽅法处死。

⼤、⼩⿏在20～30秒陷⼈⿇*醉状态，3～5min 死亡。

应⽤此法处死豚⿏时，其肺部和脑会发⽣⼩出⾎点，在病理解剖时应予注意。

5．注射⿇*醉法：应⽤戊巴⽐妥钠注射⿇*醉致死。

豚⿏可⽤其⿇*醉剂量3倍以上剂量腹腔注射。

猫可采⽤本药⿇*醉量的2～3倍药量静脉注射或腹腔内注射。

兔可⽤本药80～100ml／kg的剂量急速注⼊⽿缘静脉内。

狗可⽤本药100mg／kg静脉注射。

6．其它⽅法：⼤、⼩⿏还可采⽤击打法、断头法、⼆氧化碳吸⼊法致死。

具体操作为右⼿抓住⿏尾提起动物，⽤⼒摔击⿏头部，动物痉挛致死，或⽤⼩⽊锤⽤⼒击打头部致死。

BBB评分BBB评分的定义：将动物放入以开口盆，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。

BBB评分(Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale, BBB scale) ,(大鼠脊髓损伤)评分标准：0分：无可见后肢运动。

1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节。

2分：一个关节大幅活动或一个关节大幅活动且有另一关节轻微动。

3分：两个关节大幅活动。

4分：后肢全部三个关节可轻微活动。

5分：两个关节轻微活动，第三个关节可大幅活动。

6分：两个关节大幅活动，第三个关节可轻微活动。

7分：后肢全部三个关节可大幅活动。

8分：非承重情况下可以爪掌面着地。

9分：足底仅位于负重位，或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行。

负重：足底负重位时或仅在后躯干抬高时，HL伸肌收缩。

10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作。

11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作。

12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作。

13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作。

14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。

17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。

18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。

19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。