《造血干细胞》课件

(fluorescence activated cell sorting, FACS)、流式细胞仪 分离、免疫吸附系统（包括淘洗技术、免疫吸附柱 层析、免疫磁珠等）等方法将被标记的CD34+细胞
其中，FACS FACS系统造血干细胞（CD34+） FACS 分选纯度达到95%，但是，成本较高，仪 器也较贵，而免疫磁珠分离 免疫磁珠分离系统分离量大， 免疫磁珠分离 分离纯度和细胞质量也能够满足临床要求， 已经被临床工作者接受。
此外，用原代胚胎成纤维细胞、骨髓基质细胞 胚胎成纤维细胞、 胚胎成纤维细胞 或一些相关的细胞系等作饲养层细胞，可为造血 干／祖细胞的体外扩增和分化提供适宜的造血微 环境，在造血细胞的分化、发育中起至关重要的 作用。Hagihara等研究证实，用鼠基质细胞HESS5作饲养层，在有人重组细胞因子存在时，可有效 扩增造血干／祖细胞，特别是CD34+CD38-细胞， 并有助于分化成DCs的原始骨髓干细胞快速而持久 的产生。
造血干细胞移植
造血干细胞是血液成分之一，是生成 各种血细胞的最起始细胞，存在于骨髓、 胚胎肝、外周血及脐带血中。它既具有高 度自我更新能力，又具有进一步分化各系 统祖细胞的能力。近代输血就利用这两种 能力，对受血者用放射或大剂量化学药物 使其免疫系统受抑再输入献血者的造血干 细胞，让它在受血者骨髓内"定居下来， 分化增殖"，这即是造血干细胞移植 造血干细胞移植。 造血干细胞移植
造血干细胞进一步分化发育成不同 血细胞系的定向干细胞。定向干细胞多 数处于增殖周期之中，并进一步分化为 各系统的血细胞系，如红细胞 红细胞系、粒细 红细胞 粒细 单核巨核细胞系 胞系、单核-吞噬细胞 单核 吞噬细胞系、巨核细胞 巨核细胞 以及淋巴细胞 淋巴细胞系。 淋巴细胞
由造血干细胞分化出来的淋巴细胞有两 个发育途径，一个受胸腺 胸腺的作用，在胸腺素 胸腺素的 胸腺 胸腺素 催化下分化成熟为胸腺依赖性淋巴细胞，即T T 细胞；另一个不受胸腺，而受腔上囊 腔上囊（鸟类） 细胞 腔上囊 或类囊器官 类囊器官（哺乳动物）的影响，分化成熟为 类囊器官 囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞，即 细胞。并分别由T、B细胞引起细胞免疫及体 B细胞 液免疫。如机体内造血干细胞缺陷，则可引起 严重的免疫缺陷病。
通常先利用密度梯度离心 密度梯度离心等方法去除待分离物 密度梯度离心 中的红细胞和成熟粒细胞等成分，获得单个核细胞， 从而使CD34+细胞初步富集 CD34+细胞初步富集 CD34+细胞初步富集；然后利用CD34分子特 异的抗体标记单个核细胞，通过荧光激活细胞分选
与未被标记的CD34—细胞分离开来，即获得纯化的 CD34+细胞。
造血干细胞的检测方法
确认小鼠造血干细胞的唯一标准仍然是多 长期体内重建造血能力（ 年来一直沿用的长期体内重建造血能力（Long长期体内重建造血能力 LongLTR）检测。即：将细胞移植 term repopulation, LTR）检测 给经致死剂量照射的受者，如果能够使受者恢 复长期各系造血，并且移植第二受者仍可重建 其造血系统，那么就证明植入的细胞中确实含 有造血干细胞。
造血干细胞的分离纯化
近年来，造血干细胞表面标志研究的发展 丰富了干细胞分离纯化的手段。根据造血干细 胞的表面标志，可通过免疫细胞化学、流式细 免疫细胞化学、 免疫细胞化学 胞仪、分子杂交和PCR PCR等多种细胞生物学和分 胞仪、分子杂交 PCR 子生物学手段来检测造血干细胞。正如上述所 提及的，现大多仍然基于对CD34+细胞的富集 CD34+细胞的富集 CD34+ 来筛选造血干细胞。
小鼠脾集落实验
但是，由于异体移植存在免疫排斥的问题， 多年来对人骨髓细胞造血活力的检测一直依赖于体 外实验。近年来，随着动物模型的不断发展，使研 究人造血干细胞体内重建造血活力成为可能 体内重建造血活力成为可能。在这 体内重建造血活力成为可能 些动物模型中，最为可靠的是绵羊子宫内胎羊移植 系统。该系统是在胎羊免疫系统发育前于子宫内将 人的造血细胞移植给胚胎羊，在小羊出生后，通过 追踪其体内人不同血细胞系的分布和比例来判断移 植的人造血干细胞是否具有长期重建多系造血的能 力。
另外，也可以利用造血干细胞大多处于静止 期，对活体染料拒染的特性对其进行富集纯化 富集纯化。 富集纯化 例如，采用RNA结合染料Pyronin Y、线粒体结合 染料Rhodamine 123或DNA结合染料Hochest 33342 均可用于造血干细胞的纯化。新近，还有人根据 造血干细胞移植后迅速向骨髓归巢 向骨髓归巢的特性，建立 向骨髓归巢 了一种体内分离造血干细胞的方法，这是利用造 造 血干细胞的功能特性来对其进行分离的。 血干细胞的功能特性
造血干细胞来源 造血干细胞来源
一般造血干细胞来源于：
① ② ③ ④
外周造血干细胞。 骨髓造血干细胞。 脐带血造血干细胞。 胎盘来源造血干细胞
中华骨髓库目前主要开展外周血造血干细胞采 集。目前，全国只有汉氏联合开展采集胎盘造 血干细胞，并且获得国家相关专利证书。
不同来源造血干细胞的比较： 不同来源造血干细胞的比较：
特征
※造血干细胞有两个重要特征：
其一，高度的自我更新或自我复制能力；
其二，可分化成所有类型的血细胞。
分裂方式
正常情况下，造血干细胞 造血干细胞经过不对称性有丝分 造血干细胞 不对称性有丝分 裂成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的 全部特征，即自我更新(self-renewal)。自我更新 使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变， 因而又称为自我维持 自我维持(self-maintenance)。另一个 自我维持 子细胞可能由于基因表达模式发生改变而使得细胞 特征出现变化，从而逐步走上分化 分化的道路。 分化
现已知道，造血干细胞不是纯一的细胞群 体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些 不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型 和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定 的差异。
造血原理
人类造血干细胞首先出现于胚龄第2～3周的 卵黄囊，在胚胎早期（第2～3月）迁至肝、脾， 第5个月又从肝、脾迁至骨髓。在胚胎末期一直到 出生后，骨髓成为造血干细胞的主要来源。具有 多潜能性，即具有自身复制和分化两种功能。在 胚胎和迅速再生的骨髓中，造血干细胞多处于增 殖周期之中；而在正常骨髓中，则多数处于静止 期（G0期），当机体需要时，其中一部分分化成 熟，另一部分进行分化增殖，以维持造血干细胞 的数量相对稳定。
造血干细胞的可塑性是指除可以分化为各系 各系 造血干细胞的可塑性 血细胞外，还可以分化为多种非造血组织 非造血组织的细胞， 血细胞 非造血组织 如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、 神经细胞、 神经细胞 骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、 血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。目前 血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞 对造血干细胞多向分化的机制仍不清楚，对这一机 制的探讨以及对造血干细胞定向分化的调控将大大 扩展其在临床上的应用。因为这不仅可以绕过用人 的胚胎干细胞作为移植治疗的细胞来源，而且可以 减轻异基因移植带来的免疫排斥问题。
人的造血干细胞表面标志 表面标志包括CD34+、 CD34+、 表面标志 CD34+ CD38－、Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、 －、Lin－、Thy CD38－、Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、 LFA-1+、CD45RA－、CD71－ －、CD71 LFA-1+、CD45RA－、CD71－等。人类造血干 细胞还对5-氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。
造血干／ 造血干／祖细胞的体外培养和诱 导分化
分离纯化后的造血干／祖细胞培养 方法有多种，可采用液体或半固体培养基， 后者可用甲基纤维素或琼脂作为支撑物， 培养基中可含／不含血清。G0期干细胞对 细胞因子的刺激不敏感，而进人增殖周期 细胞因子 的干／祖细胞却依赖细胞因子 细胞因子，培养基中 细胞因子 加人不同的细胞因子 细胞因子及组合可诱导造血干 细胞因子 细胞向不同的方向分化。
造血干细胞
Hematopoietic Stem Cell HSC） （HSC）Biblioteka 夏育宏2012.4
造血干细胞的定义： 造血干细胞的定义：
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell,HSC)是一小群具有 造血干细胞 高度的自我复制 多向分化潜能 自我复制和多向分化潜能 自我复制 多向分化潜能的最原始的造血细胞。 通俗地讲，造血干细胞 造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所 造血干细胞 有造血细胞和免疫细胞的起源。因此是多功能干细胞， 医学上称其为“万用细胞”，也是人体的始祖细胞。 干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是 机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的祖宗细胞。
虽然CD34+细胞不全是造血干细胞，但是 造血干细胞应全部表达CD34分子，所以通过筛 选CD34+细胞至少可以使造血干细胞得到富集。 随着造血干细胞的分化成熟，CD34表达水平逐 渐下降，成熟血细胞（Lin+）不表达CD34。 而 最近的一些研究显示，CD34+Lin-造血细胞又起 源于CD34-Lin-。CD34表面标志从无到有，又从 有到无，充分显示了造血干/祖细胞产生、发育、 分化和成熟的全过程。
造血干细胞的可塑性
一种成体干细胞可以生成另一个组织的特 化细胞的能力，即成体干细胞具有一定跨系、 甚至跨胚层分化的特性，称其为干细胞的可塑 干细胞的可塑 成体干细胞的横向分化。横向分 性，又被称为成体干细胞的横向分化 成体干细胞的横向分化 化的发现在干细胞研究中具有革命性意义。它 打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎 或受精卵的限制，为干细胞治疗疾病提供了新 途径。
CD34是人们普遍认同的造血干／祖细胞的 CD34 代表性表面标志，随细胞分化成熟逐渐减少甚 至消失。CD34抗原分子量为105—120KD，为高 高 度糖基化的I型跨膜糖蛋白。CD34+造血细胞是 度糖基化的I型跨膜糖蛋白 一组异质性细胞群体，可进一步分化为CD34+ CD38+和CD34+ CD38-两个亚群。CD34+细胞群中 90％为祖细胞，极少为造血干细胞。