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Journal of China Pharmaceutical University2022，53（1）：18-24学报基于生物素连接酶的邻近标记技术在蛋白质组学中的研究进展张雨欣1，丁明2*，柳军1**（1中国药科大学新药筛选中心，南京210009；2中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009）摘要基于生物素酶的蛋白质邻近标记技术是利用融合在感兴趣蛋白上的生物素连接酶对邻近的蛋白质生物素化，通过生物素与链酶亲和素之间的亲和力进行分离，再结合质谱分析鉴定出生物素化蛋白。
该技术能够用于检测弱而短暂的蛋白质相互作用，也给在无膜细胞器和其他不易分离或纯化的亚细胞结构的上的蛋白互作研究提供了新的选择，很好地补充了传统研究蛋白质互作方法的空白。
本文对近几年出现的基于生物素酶的蛋白质邻近标记的技术发展及其应用进行了综述。
关键词邻近标记技术；生物素化；蛋白质相互作用；BioID；BioID2；TurboID；进展中图分类号Q816文献标志码A文章编号1000-5048（2022）01-0018-07doi：10.11665/j.issn.1000-5048.20220103引用本文张雨欣，丁明，柳军.基于生物素连接酶的邻近标记技术在蛋白质组学中的研究进展［J］.中国药科大学学报，2022，53（1）：18–24.Cite this article as：ZHANG Yuxin，DING Ming，LIU Jun.Research progress of proximity labeling technology based on biotin ligase in proteomics［J］.J China Pharm Univ，2022，53（1）：18–24.Research progress of proximity labeling technology based on biotin ligase in proteomicsZHANG Yuxin1,DING Ming2*,LIU Jun1**1Center for New Drug Screening,China Pharmaceutical University,Nanjing210009;2School of Life Science&Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing210009,ChinaAbstract Proximity-dependent biotinylation(PDB)uses biotin ligase fused to the protein of interest to bioti⁃nylate adjacent proteins,purify them with streptavidin beads,and then identify the biotinylated protein by mass spectrometry.This technology can be used to detect transient and/or low affinity interactions,provide a chance to learn more about membrane-less organelles and other subcellular structures that cannot be easily isolated or puri⁃fied,and fill the gap in traditional methods.This article summarizes the technological development and applica⁃tion of PDB in recent years.Key words adjacent protein markers;biotinylation;protein-protein interaction;BioID;BioID2;TurboID;advances蛋白质是生命体中真正发挥作用的物质，大多数蛋白质不能单独发挥作用，它们与其他蛋白质的相互作用决定了细胞的功能。
生物素探针标记方法嘿，咱今儿就来唠唠生物素探针标记方法。
你说这生物素啊，就像是一个小魔术贴，能把咱需要的东西给牢牢粘住。
先来说说这标记是咋回事。
想象一下，咱就像是在一个大迷宫里找特定的宝藏，而生物素就是那个能让我们一下子找到目标的标记。
通过它，我们能精准地识别和追踪我们想要研究的东西。
那怎么给这些东西贴上生物素这个“魔术贴”呢？这可有好几种办法呢！比如说直接标记法，就好像给东西直接贴上一个显眼的标签。
还有间接标记法，就有点像绕了个弯子，但效果也很不错哦。
在进行标记的时候，可不能马虎。
就跟咱出门得穿戴整齐一样，每一个步骤都得认认真真。
得选对合适的生物素，不然就像穿错了鞋子，那可不行。
然后就是反应条件啦，温度啦、酸碱度啦，都得拿捏得恰到好处，不然这标记可就不完美啦。
标记好了之后呢，就可以开始我们的探索之旅啦。
可以用各种方法来检测这个标记，看看我们的目标是不是被准确地找到了。
这就像是找到了宝藏后，得好好确认一下是不是真的宝贝呀。
你想想，要是没有生物素探针标记方法，我们在生物学的世界里该多迷茫呀！好多细微的东西都没法搞清楚啦。
所以说呀，这个方法可真是太重要啦！咱再回过头来看看，这生物素探针标记方法是不是很神奇？它就像是给我们打开了一扇通往微观世界的大门，让我们能更深入地了解那些奇妙的生物现象。
咱可得好好掌握这个方法，才能在生物学的海洋里畅游无阻呀！你说是不是呢？它能帮助我们发现好多以前不知道的秘密呢，多有意思呀！以后咱要是在生物学领域有啥大发现，可别忘了生物素探针标记方法的功劳哟！。
【高中生物】蛋白质可控荧光标记研究方面取得新成果9月21日，angewandtechemieinternationaledition发表了中科院生物物理研究所王江云研究组和林庆研究组合作成果geneticallyencodedcyclopropenedirectsrapid,photoclickchemistrymediatedproteinl abelinginmammaliancells。
该最新研究通过扩展基因密码子，实现了具有光点击活性的非天然氨基酸环丙烯赖氨酸在哺乳动物中的基因编码。
光照条件下，特异位点整合了环丙烯赖氨酸的蛋白质与小分子四唑化合物发生环加成反应，生成荧光活性基团，从而实现了时空可控的对哺乳动物细胞内蛋白特异位点的标记。
与在蛋白质的N端或C端引入融合荧光蛋白的标记方法相比，编码生物正交非天然氨基酸的基因具有许多优点。
例如：（1）小的非天然氨基酸可以插入蛋白质的任何暴露部位，而不会影响蛋白质的活性；（2）通过基因编码可以实现多种标记，可用于研究各种蛋白质翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化等；（3）生物正交标记法可以实时、原位调节蛋白质的功能。
点击化学（clickchemistry）也叫链接化学、速配结合组合式化学，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。
光点击化学的优点是不需要cu(i)催化，而是通过光诱导引发反应。
由于四唑类化合物在光照条件下很容易原位生成氰亚胺1,3-偶极子，该偶极子能够很快与烯烃发生环加成反应，生成具有荧光性质的吡唑啉环加成产物。
基因编码非天然氨基酸的方法在蛋白质中引入非常小的荧光基团，对蛋白质本身的结构和功能几乎没有影响，并且能够更真实地反映蛋白质的行为。
由于环丙烯赖氨酸仅在光照条件下与四唑类化合物反应，该方法为哺乳动物细胞中的时空可控蛋白质标记提供了新的策略和手段。
本文共同第一作者为博士研究生潘彦超。
该研究得到科技部国家重点基础研究973计划、国家自然科学基金委和中国科学院的资助。
【高中生物】Nature Methods新年展望：新蛋白标记今年第一期《NatureMethods》评出了2021的年度技术??单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）。
除此之外，该杂志还对一些热门技术进行了一番展望，包括细胞内蛋白标记、精准光遗传学、高度多重成像、亚细胞图谱分析等等。
荧光化学染料相对较小，具有很好的光物理性质和光谱跨度。
这些特性使荧光染料特别有吸引力，有望替代荧光蛋白进行蛋白标记。
研究者们正在积极开发相应的工具，在活细胞中用染料标记目的蛋白。
对于绝大多数应用来说，荧光染料需要能够实现特异性的标记。
现在已经有一些工具能做到这一点，比如SNAP和Halo标签、FlAsH和ReAsH、和hexahistidine标签。
这些工具主要使用能特异性结合相应染料的小蛋白或多肽，对靶蛋白进行标记。
还有一种方法是在蛋白翻译过程中掺入非天然氨基酸，这些非天然氨基酸本身就发荧光，或者可以通过点击化学（clickchemistry）发出荧光。
（延伸阅读：NatureMethods发表新荧光标记技术）虽然这些方法越来越受欢迎，但它们也遇到了一些问题。
举例来说，荧光染料在多重成像中用处有限，能跨越活细胞膜的染料标记效率低、数量少、质量差。
这类染料的开发目前是一个相当活跃的研究领域。
毫无疑问，未来人们将大大增强荧光染料的标记效率，这会进一步提高定量成像的能力。
可用染料将得到显著改进，这会增加多重化，减少成像所需的光。
全新的蛋白标记方法也将出现在人们眼前。
特异性蛋白标记有助于在固定细胞和活细胞中进行超高分辨率成像。
当分辨率接近几十纳米的时候，标记造成的问题就会凸现出来。
举例来说，用抗体进行标记会使目标结构增加约10nm，而二抗会进一步增大检测目标。
为了解决这一问题，不少研究者正在开发纳米抗体（nanobodies）。
纳米抗体是来自骆驼的小抗体片段，是人们用基因工程方法克隆骆驼重链抗体可变区得到的单域抗体。
与传统IgG抗体相比，纳米抗体具有分子质量小、容易生产、稳定性好、抗原结合力高等特点。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１９７１３２３，３１３７１２８０）作者单位：１００７３０ 北京医院、国家老年医学中心、卫生部老年医学重点实验室通讯作者：戴大鹏，电子信箱：ｄａｉｄａｐｅｎｇ＠１６３．ｃｏｍ；蔡剑平，电子信箱：ｃａｉｊｐ６１＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ一种细胞内快速标记邻近蛋白复合物的新方法刘 健 周 姗 戴大鹏 蔡剑平摘 要 目的 构建可诱导、细胞适用性广的细胞内快速标记邻近蛋白复合物新方法。
方法 体外合成ＴｕｒｂｏＩＤ编码基因，并与Ｔｅｔ－ｏｎ系统一并插入改造后的慢病毒载体，病毒包装后侵染ＨｅＬａ细胞以融合表达ＴｕｒｂｏＩＤ及目的蛋白ＹＢ１或对照蛋白ＧＦＰ。
使用不同浓度的强力霉素处理细胞２４ｈ以诱导融合蛋白的表达，加入５０μｍｏｌ／Ｌ生物素继续培养１５～１２０ｍｉｎ以使Ｔｕｒ ｂｏＩＤ将临近蛋白进行生物素标记，免疫印迹法检测生物素标记的蛋白含量。
结果 成功构建了可诱导的ＴｕｒｂｏＩＤ融合表达慢病毒载体。
获得的病毒侵染ＨｅＬａ细胞，应用０．１２５μｇ／ｍｌ以上的强力霉素即可诱导细胞产生ＴｕｒｂｏＩＤ融合蛋白。
生物素处理１５ｍｉｎ以上可得到大量生物素标记的蛋白。
结论 构建了快速标记邻近蛋白复合物的检测体系———ＴｕｒｂｏＩＤ系统，该系统具有可诱导、生物素标记迅速及细胞适用性广等优点，可广泛应用于大多数动物及人体细胞内蛋白复合物的筛查研究。
关键词 邻近蛋白标记 ＴｕｒｂｏＩＤ 蛋白复合物 生物素化 载体构建中图分类号 Ｒ３３１ 文献标识码 Ａ ＤＯＩ １０．１１９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３ ５４８Ｘ．２０２０．０５．００７ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＯｎｅｉｎＶｉｖｏａｎｄＲａｐｉｄＰｒｏｔｅｉｎ－ＰｒｏｘｉｍｉｔｙＬａｂｅｌｉｎｇＭｅｔｈｏｄ． ＬｉｕＪｉａｎ，ＺｈｏｕＳｈａｎ，ＤａｉＤａｐｅｎｇ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＭＯＨＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｒｉａｔｒｉｃｓ，ＢｅｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７３０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｉｎｄｕｃｉｂｌｅＰｒｏｔｅｉｎ－ＰｒｏｘｉｍｉｔｙＬａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｒａｐｉｄａｎｄｈｉｇｈｌａｂｅｌｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｍａｍ ｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆＴｕｒｂｏＩＤｇｅｎｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｍｏｄｉｆｉｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃ ｔｏｒ，ｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅＴｅｔ－ｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ａｆｔｅｒｐａｃｋａｇｉｎｇ，ｖｉｒｕｓｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｆｅｃｔＨｅＬａｃｅｌｌｓｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｕｒｂｏＩＤｅｎｚｙｍｅ，ｆｕｓｉｎｇｗｉｔｈｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎＹＢ１ｏｒｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｐｒｏｔｅｉｎＧＦＰ．Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｆｏｒ２４ｈｔｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｆｕｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．５０μｍｏｌ／Ｌｂｉｏｔｉｎｗａｓａｄｄｅｄａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ１５－１２０ｍｉｎｔｏａｌｌｏｗＴｕｒｂｏＩＤｅｎｚｙｍｅｔｏｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｐｒｏｘ ｉｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｉｖｏ．Ｔｈｅｎ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｉｎｔｒｅａｔｅｄｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｗｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎ ｓｔｒｕｃｔｅｄａｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｉｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｕｒｂｏＩＤｆｕｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｆｔｅｒｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＨｅＬａｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅＴｕｒｂｏＩＤｆｕｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｔｈｅｍｗｉｔｈｏｎｌｙ０．１２５μｇ／ｍｌｏｒｍｏｒｅｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ．Ａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｕｌｄａｌｓｏｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｆｔｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗｉｔｈｂｉｏｔｉｎｆｏｒ１５ｍｉｎｏｒｌｏｎｇｅｒｔｉｍｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＷｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｒａｐｉｄＰｒｏ ｔｅｉｎ－ＰｒｏｘｉｍｉｔｙＬａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ－ＴｕｒｂｏＩＤｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，ｂｉｏｔｉｎｌａｂｅｌｉｎｇｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｃｅｌｌａｄａｐｔａｂｌｅ．Ｔｈｕｓ，ｉｔｃａｎｂｅｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎｍｏｓｔａｎｉｍａｌｓａｎｄｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌａｂｅｌｉｎｇ；ＴｕｒｂｏＩＤ；Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘ；Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ；Ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ 生物体功能的实现需要蛋白质的参与，其中多数生物学功能的行使必须借助于多种蛋白质间相互配合，组成蛋白质复合物来实现。
邻近标记（pl）方法
邻近标记技术（Proximity Labeling, PL）是一种用于研究蛋白质相互作用的方法。
它克服了传统方法的一些缺点，无需构建文库，对于疏水性和低丰度蛋白互作蛋白的鉴定以及弱/瞬时互作蛋白的分析显示出独特的优势。
通过与质谱技术联用，PL技术可在时空水平上提供动态的蛋白互作网络，为深入理解各种生命过程的分子基础提供了强有力的工具。
2020年12月15日，中国农业大学生物学院张永亮教授课题组联合加州大学戴维斯分校的Savithramma P. Dinesh-Kumar教授在Plant Communications上在线发表了题为Proximity Labeling: An emerging tool for probing in planta molecular interactions 的综述文章，系统地总结了PL技术的原理、发展和应用，强调了其在植物中应用的巨大潜力，为在植物中更高效地使用PL技术来筛选互作蛋白提供了详细的技术参考。
如需了解更多关于邻近标记（pl）方法的信息，建议你查阅相关的学术文献或咨询专业人士。
邻近标记是一种用来研究核酸-蛋白质相互作用的重要方法。
本文将介绍邻近标记的定义、原理和应用，并探讨其在生物医学科学领域中的重要性和发展前景。
一、邻近标记的定义邻近标记是一种利用化学或物理手段将核酸或蛋白质与分子探针或荧光染料等化合物接近结合的技术，以便研究它们之间的相互作用。
这种方法能够帮助科学家们更加全面和深入地了解核酸和蛋白质在生物体内的功能和作用机制，对于生物医学研究具有重要的意义。
二、邻近标记的原理邻近标记的原理主要包括以下几个方面：1. 分子探针的设计：科学家们根据需要设计出具有特定功能的分子探针，这些探针可以与目标分子结合，并在接近结合的过程中产生特定的信号。
2. 核酸/蛋白质标记：将目标核酸或蛋白质进行标记，使其与分子探针结合后能够产生特定的信号，例如荧光信号或化学反应信号。
3. 相互作用的研究：利用分子探针特定的信号，科学家可以通过实验手段研究目标核酸或蛋白质与其他分子之间的相互作用情况，从而了解它们在生物体内的功能和作用机制。
三、邻近标记的应用邻近标记在生物医学科学中有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1. 代谢途径研究：通过对代谢途径中涉及的核酸和蛋白质进行邻近标记，科学家们可以更加全面地了解这些分子之间的相互作用关系，为代谢途径的研究提供重要参考。
2. 生物标志物检测：使用邻近标记技术可以帮助科学家们开发出更加灵敏和准确的生物标志物检测方法，用于诊断和监测疾病，以及评估药物疗效。
3. 药物研发：通过对药物靶点进行邻近标记研究，可以为药物研发提供重要信息，帮助科学家们设计出更加高效和安全的药物。
4. 分子生物学研究：在分子生物学研究中，邻近标记技术也被广泛应用，用于研究核酸和蛋白质的结构和功能。
四、邻近标记技术的重要性和发展前景邻近标记技术在生物医学科学领域的重要性不言而喻，它可以帮助科学家们更加深入地了解生物分子的功能和作用机制，为疾病治疗和药物研发提供重要的信息。
随着生物医学科学的发展，邻近标记技术也将进一步完善和发展，可能会衍生出更多的新方法和应用领域，为人类健康科学发展做出更大的贡献。
生物素邻近标记技术
生物素邻近标记技术是一种生物化学技术，用于将生物素分子与其他分子进行连接。
这种技术是一种非放射性标记法，具有高度灵敏度和特异性，可以应用于分子生物学、免疫学和细胞学等领域。
生物素邻近标记技术通常由两部分组成：第一步是将生物素酰化，形成生物素-NHS酯，其酯化活性很高，容易与其他化合物进行连接；第二步是将生物素-NHS酯与其他分子进行连接，如抗体、蛋白质和核酸，这样就可以生成生物素邻近标记物，可以用于免疫染色、原位杂交等实验。
这种技术具有很高的应用价值，可以帮助科研人员更好地研究生物学问题。
蛋白质全新设计（Protein de novo design）是一种利用计算机辅助设计的方法，通过在蛋白质序列中选择适当的氨基酸，构建出具有特定功能的全新蛋白质分子。
这种方法不依赖于已知的蛋白质结构和序列信息，而是从头开始设计完全新的蛋白质序列，以期望实现特定的功能或性质。
蛋白质全新设计的方法通常包括以下几个步骤：
1.目标定义：确定需要设计的蛋白质的特定功能或性质，例如酶活性、结合亲和力等。
2.模型构建：构建一个计算模型，预测所设计的蛋白质的结构和稳定性。
3.氨基酸选择：选择最适合构建所需蛋白质结构的氨基酸序列，并确定它们的位置和排
列方式。
4.构建蛋白质结构：根据选择的氨基酸序列，构建全新的蛋白质结构。
5.评估和优化：对设计的蛋白质进行评估和优化，以确认其是否满足预期的特定功能或
性质。
蛋白质全新设计的方法使用了计算机模拟技术，可以在较短的时间内设计出具有特定功能的蛋白质分子。
它可以应用于多种领域，如药物设计、生物学研究、能源产业等。
但是，在实际应用中，由于涉及到大量的计算和数据分析，因此需要强大的计算能力和专业知识的支持。
生物素标记蛋白原理
蛋白质疏水性强，使之难以在水环境中进行结合反应，因而影响到蛋白质的研究研发。
生物素标记蛋白质技术应运而生，它是将一种蛋白质与另一蛋白质相互结合，从而使其可以在水环境中稳定凝固形成，间接反应原理就是利用生物素。
生物素标记蛋白技术是将酰胺基化的氨基酸和生物素在二者的两端分别完成结合反应，使得生物素包裹在蛋白质表面，这样就使蛋白质富含电荷，有利于其在水环境中的稳定凝固。
此外，生物素具有很强的分子识别性，能够有效区分不同蛋白质。
生物素标记蛋白技术在实验室常见的应用是生物素标记蛋白质来分析及定位的地图分解。
该技术的应用可以帮助分析出蛋白质的结构和功能。
此外，生物素对非离子蛋白质的结构也有非常积极的影响，能够抑制非离子蛋白质的失活。
生物素标记蛋白技术的发展，极大地促进了蛋白质的研究研发，有助于让我们更加清楚的认识和分析各种蛋白质，研发出各种新的药物。
Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生物素化标记方法—可直接用于原代组织
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研究意义
在生物学研究中，获取某一细胞系的蛋白质相互作用图谱或许并不难，但是直接从原代组织中检测蛋白质组图谱甚至它们之间的相互作用是一个重大的挑战。
近日，来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)的研究团队设计了一种新的生物素标记方法，用抗体代替传统的酶融合，标记靶蛋白邻近的蛋白。
即使用针对靶蛋白的抗体来引导生物素沉积到与其相邻的蛋白质上，通过链霉亲和素磁珠捕获这些蛋白质并用质谱鉴定，样本可以是细胞或原代组织。
该团队使用这种方法检测了多种细胞和组织类型中靶蛋白即核纤层蛋白A的邻近蛋白组成。
有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分都是与分子伴侣或者其它蛋白质组装在一起发挥作用。
蛋白质组装（Protein assemblies）对于所有活细胞的功能都至关重要。
细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络称为蛋白质相互作用组（protein interactome），是动态的，会随着时间、发展阶段、细胞周期进程或组织类型而改变。
因此，表征蛋白质之间的相互作用可以获得靶蛋白质的位置和功能等重要信息。
然而，特定突变对组织特异性蛋白质相互作用组的影响很少被详细研究。
我们都知道单个基因的不同突变可能会导致不同的疾病。
如核纤层蛋白 A / C （LMNA）基因有400多个不同的突变，会产生超过14种不同的表型，这些表型引起不同病症包括脂肪营养不良、肌营养不良和早衰综合症。
然而这些单基因突变与其高度可变表型之间的机制联系尚不清楚。
尤其是组织特异性核纤层蛋白（lamin）的相互作用组也有待阐明。
通过标准的免疫共沉淀（CoIP）分析核纤层蛋白的相互作用组是不切实际的，因为由核纤层蛋白长丝产生的不溶性高阶结构导致无关蛋白的过量沉淀。
已经用各种遗传和生物化学方法来鉴定核纤层蛋白A的相互作用蛋白，如利用生物素化的邻近标记方法、表达高亲和力的OneSTrEP-标签和免疫共沉淀、蛋白芯片等。
虽
然这些方法鉴定了多个已知和新型的相互作用蛋白，但它们的应用仅限于单细胞系。
而且之前基于生物素化的邻近标记方法还需要在细胞系或种系中预先插入融合基因，因此它们不能用于原代人组织样本。
为了克服这些限制，作者开发了一种抗体引导的，基于邻近的标记方法，称为抗体识别生物素化（BAR，Biotinylation by antibody-recognition），可以标记和分离靶蛋白附近的蛋白。
什么是抗体识别生物素化（BAR）方法？
图1 抗体识别生物素化（BAR）方法。
细胞或原代组织样品被固定并透化。
一抗结合感兴趣的靶蛋白，带有HRP的二抗结合一抗。
在生物素-酪胺偶联物（biotin-tyramide）和过氧化氢的孵育下，HRP催化生物素偶联物产生自由基，附着在与靶蛋白相邻的蛋白质上并使其生物素化。
通过与生物素具有高亲和力的链霉亲和素磁珠分离蛋白质，用western印迹和质谱进行分析。
BAR法用于鉴定靶抗原附近的蛋白质（图1）。
在固定的和透化的组织样品中，使用一抗来靶向感兴趣的蛋白质。
在过氧化氢和生物素-酪胺（biotin-tyramide）的存在下，HRP（辣根过氧化物酶）缀合的二抗产生自由基，其导致靶蛋白质的
相邻蛋白质发生生物素化。
使用链霉亲和素（Streptavidin）包被的磁珠来沉淀生物素化的蛋白质，然后通过串联质谱法检测。
作者将该方法应用于线粒体验证了灵敏度和特异性，并成功地利用此方法表征多种细胞系和组织中的核膜（nuclear envelope，NE）组成。
核纤层蛋白是核膜（NE）的重要结构元件。
如（图2）所示，作者应用BAR鉴定了Hela细胞中核纤层蛋白A / C附近的蛋白质。
从超分辨率显微镜可见，生物素成功沉积在核膜（NE）上。
图2 超分辨率显微镜显示NE上的生物素沉积（核纤层蛋白A / C抗体;左）（FITC-抗生物素蛋白;右）。
细胞培养虽然可以模仿整个生物体内发生的相关过程，但在许多情况下并非是有效的。
为了克服这些局限性，作者试图在与核纤层蛋白病相关的原发性人体组织中鉴定核纤层蛋白A / C的相互作用蛋白。
作者成功地在死后组织标本中标记了NE。
如（图3a），肌肉肌原纤维在细胞核中形成凹槽，这不仅与核纤层蛋白A / C 的分布相关，而且与DNA相关。
脂肪样品中的一些细胞核具有甜甜圈形状（图3b），这是以前在细胞培养中但未在原代人组织中报道的表型。
总体而言，骨骼肌组织显示与平滑肌组织的相似程度高于脂肪组织。
这些结果提供了进一步的证据，NE 组成在不同组织之间变化。
图3a，原代人骨骼和平滑肌组织的成像。
用核纤层蛋白A / C抗体（红色;左图）对NE进行成像，用FITC-抗生物素蛋白（绿色;第二幅图像）对生物素进行成像，并用DAPI（蓝色;第三幅）对DNA进行成
像。
b，来自原代人脂肪组织的甜甜圈形状的核。
通过用抗体代替酶融合，这种方法具有以下几个特点。
（1）BAR不需要为每种感兴趣的蛋白质生成单独的细胞系或动物模型。
使用抗体可以防止任何与蛋白质融合有关的假象。
但是标记不区分直接相互作用与近端蛋白质。
（2）可以用于组织特异性蛋白。
BAR在疾病相关的原发性组织中鉴定出某些临床相关的蛋白质，这些蛋白质在先前的研究中未被鉴定，也没有在HeLa细胞中被BAR鉴定为核纤层蛋白A / C相互作用蛋白。
例如，抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物中的突变可导致各种肌肉营养不良，类似于由核纤层蛋白A / C突变引起的肌肉营养不良，作者发现该复合物的多个成员在骨骼肌NE附近被发现（图4）。
鉴于其在核周边的富集，推测该复合物可能在调节肌肉组织的NE形态和核位置方面具有结构性作用。
该复合物的多个成员是跨膜蛋白，复合物甚至有可能渗透到核周间隙中，从而促进与内核膜的蛋白质的相互作用。
（3）可以比较不同条件下靶蛋白的相互作用组。
在表达progerin的HeLa细胞或HGPS成纤维细胞中，BAR可以鉴定新的疾病相关蛋白，如PTRF，之前并不知晓与progerin有关。
之前有报道lamin A调节PTRF转录，PTRF和CAV1抑制NRF2并促进早衰。
本文发现虽然在HeLa细胞中几乎看不到PTRF和CAV1肽，但是这些蛋白质在成纤维细胞以及原代肌肉组织中给出强烈
的信号。
此外，仅在肌肉样品中观察到CAV1的清晰的核膜定位（图5），强调需要探索相关组织中NE组成的变化。
图4 免疫荧光显示在小鼠骨骼肌中定位于核周围（蓝色为DAPI染色的DNA）的肌聚糖（SGCA;绿色）
图5 CAV1在原代人肌肉组织中的免疫荧光图像。
用CAV1抗体显现的CAV1（左）与用DAPI显现的DNA
合并（右）。
总之，在未来的研究中，可以利用这种抗体识别生物素化（BAR）方法直接从患者和对照的临床样本中表征各种蛋白质的相互作用组，从而阐明遗传和非遗传因素（如患者的生活史）对蛋白质相互作用组的影响。
图6 Biotin-tyramide的结构式
原始论文：
Biotinylation by antibody recognition—a method for proximity labeling. Nature Methods.
Published Online 18 December 2017.。
