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产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20 C〜-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻融（尽量不超过5次）。
表120 gM储存液的配置参考使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。
细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24〜72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。
注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。
Ribobio-siRNA分类汇总
siRNA是一种高效特异的基因缺失性研究工具，已经广泛应用于各种真核生物的基因功能研究，药靶发现及药物筛选。
近年来，多种临床试验表明靶向致病基因的RNAi药物具有治疗困扰人类多年疾病的巨大潜力。
siRNA包括：
常规siRNA：常规化学合成siRNA双链，特异性靶点设计，覆盖人、小鼠、大鼠全基因组的所有基因，适合进行各种细胞RNAi实验.
对照siRNA：siRNA对照是完整RNAi实验的重要组成部分，主要包括：转染对照、阳性对照、阴性对照、空白对照。
这些对照产品将帮助研究人员进行siRNA转染条件优化，验证基因沉默实验流程准确性，对siRNA诱导的基因沉默效果进行特异性分析，保证RNAi实验的顺利完成。
单基因套装siRNA：针对每个基因设计三对siRNA，确保筛选细胞水平高效沉默效率的siRNA.
siRNA文库：基于siRNA文库的基因功能筛选方法可以实现高通量、低成本、超快速的功能筛选，大大加快功能基因组研究步伐。
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化学修饰siRNA：RNA化学修饰可显著改变寡核酸理化性质，进而影响寡核酸的功能，有利于深入研究寡核功能.挥作用
动物实验siRNA：锐博生物开发的特殊siRNA化学修饰技术，有效增强siRNA稳定性，且修饰不影响siRNA发挥作用.
验证有效siRNA：针对常见基因验证有效的siRNA，经过qPCR有效性验证，确保70%以上的mRNA水平沉默效率。
锐博生物-ribobio专业生物科研公|司。
miRNA产品使用说明RN：R10034.5 产品简介micr ON™ miRNA mimic是miRNA模拟物，化学合成的成熟miRNA双链，即用型；micr OFF™ miRNA inhibitor是miRNA抑制物，化学修饰的成熟miRNA互补单链，即用型；micr ON™ miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA 激动剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型；micr OFF™ miRNA antagomir是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择miRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM，miRNA inhibitor浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。
注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。
荧光siRNA产品使用说明RN：R11077.1 产品简介荧光标记的siRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法。
荧光标记的siRNA转染细胞后，可以直接使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，确定是否有效转染及转染效率的高低。
荧光标记的siRNA还可用作追踪siRNA在胞内的定位及分布的情况。
运输保存产品以冻干粉的形式储存于棕色管中，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装避光保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考注：所有过程请注意避光！使用方法使用前须知1）我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。
表2 锐博生物荧光标记siRNA可选荧光2）请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。
3）储存、使用过程中及检测过程中请注意避光。
4）检测前请先熟悉检测仪器的操作，若使用荧光显微镜或激光共聚焦检测，检测时不宜同一位置曝光时间过长，应对好焦后马上拍照，防止曝光时间过长而荧光淬灭。
1，转染具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。
以下为以riboFectTM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例：a. 稀释siRNA：用50μl 1X riboFectTM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。
b. 混合液制备：加入5μl riboFectTM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。
c. 将riboFectTM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。
siRNA产品使用说明RN：R10043.5 产品简介常规化学合成siRNA为21~25nt的双链小分子RNA，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高通量筛选试验，可选择siRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的siRNA初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以ribo FECT™ CP Reagent 转染 siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表2。
1）接种细胞a.贴壁细胞：以Hela细胞为例，接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基（v1）的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到30~50%。
b.悬浮细胞：以THP1细胞为例，接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基（v1）的24孔板培养孔中。
siRNA 使用说明siRNA 使用说明1.介绍siRNA（小干扰RNA）是一种能够特异性沉默靶基因表达的双链RNA分子。
本文档旨在提供关于siRNA的详细使用说明，包括实验前准备、实验步骤和数据分析等内容。
2.实验前准备2.1 选择siRNA：选择适合的siRNA靶向靶基因。
可以通过文献研究或生物信息学预测来确定siRNA的序列。
2.2 siRNA合成与纯化：合成和纯化siRNA应该由可靠的供应商进行。
确保合成的siRNA纯度高且无附加污染物。
2.3 细胞培养：选用适当的细胞系，并且按照常规细胞培养方法将其培养在适宜的培养基中。
3.实验步骤3.1 载体转染：将siRNA与特定的转染试剂混合，并按照转染试剂的说明书将其转染入细胞中。
注意控制组设置。
3.2 RNA干扰效率检测：根据靶基因的表达情况选择适当的方法检测siRNA的干扰效果，如定量PCR或Western blot等。
3.3 功能检测：根据实验需要，选择适当的功能检测方法，如细胞增殖、凋亡、迁移或侵袭等。
4.数据分析4.1 干扰效果分析：对实验结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并计算干扰效果的百分比。
4.2 功能检测结果分析：对功能检测结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并进一步解释其生物学意义。
5.附件本文档涉及的附件包括实验记录表、数据分析表和相应的图表。
请在需要时参考附加的文件。
6.法律名词及注释6.1 siRNA：小干扰RNA，一种双链RNA分子，用于特异性沉默靶基因表达。
6.2 RNA干扰：通过siRNA分子的特异性结合和降解，抑制靶基因的转录和翻译过程。
6.3 转染：将外源DNA或RNA导入靶细胞以实现外源基因的表达或干扰基因的沉默。
6.4 培养基：一种用于细胞培养的含有营养物质和生长因子的液体或固体培养基质。
7.结束语感谢您阅读本siRNA使用说明，希望本文档能帮助您顺利进行siRNA实验。
引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。
本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。
通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。
正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。
2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。
siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。
二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。
根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。
2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。
3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。
三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。
2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。
3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。
四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。
2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。
3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。
五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。
2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明产品介绍与其它转染试剂比较，siRNA-mate 转染效率高、细胞存活率高、毒性小。
可广泛用于瞬时和稳定转染，也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。
转染试剂保存在4℃，有效期2 年。
重要提示1. 细胞的状态：转染时贴壁细胞的密度以30 - 50%为佳，而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。
细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。
2. siRNA 的质量：使用高纯度的siRNA 也是转染成功的关键。
在转染前需确定siRNA 的含量和纯度，实验过程中需要使用DEPC 处理过的耗材和试剂，注意避免RNase 污染。
3. 血清的影响：在制备siRNA-mate和siRNA 形成复合体过程中不能添加血清，建议用OPTIMEM 或其他无血清培养基（如DMEM、RPMI-1640 等）稀释siRNA 和转染试剂，以达到复合物形成的最佳效果。
但是，在随后的转染过程中，血清的存在并不影响复合体的转染效果。
4. 转染试剂的用量：对于一定量的siRNA 建议尝试按照推荐剂量的siRNA-mate 转染试剂进行优化，以确定最佳的转染效率。
以24 孔板为例，每10pmol siRNA 可使用0.5 μl，1 μl，1.5 μl 和2 μl 转染试剂作为初步实验条件。
操作流程（24 孔板）以24孔板为例，若要检测基因沉默的效果，推荐最低siRNA 终浓度10 nM；若要在显微镜下从荧光强度看转染效率，因荧光信号被检测到需要一定的敏感度，推荐siRNA 终浓度50 nM。
遵循以下操作方法可以高效地将siRNA 转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。
但是对某些特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也许需要单独特别优化。
A. 细胞铺板贴壁细胞数量：在转染实验之前的18 - 24 个小时，在每个孔的500 μl 生长培养基中加入1.5 - 3.5 × 104 个细胞（确保转染时细胞密度在30- 50%）。
siRNA产品使用说明RN：R10043.3产品简介常规化学合成siRNA为21~25nt的双链小分子RNA，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考注：如需进行高通量筛选试验，可选择siRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞均匀分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的siRNA初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以ribo FECT TM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1）接种细胞a. 贴壁细胞：转染前一天，接种1×105细胞至含有500μl完全培养基的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到50~80%。
注：1）不同细胞生长速度不同，接种细胞的数量需要依据经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布于培养基表面。
b. 悬浮细胞：接种1×105~5×105个细胞至含有500μl完全培养基的24孔板。
2）转染步骤对于每个转染样品，请按以下步骤准备：a. 稀释siRNA：用50μl 1X ribo FECT TM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵b. 混合液制备：加入5μl ribo FECT TM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。
锐博生物阴性对照siRNA阴性对照siRNA简介：与靶基因无同源性，并最小化与其他基因的同源性，避免引起脱靶效应，是整个RNAi实验的基本参照。
阴性对照siRNA描述：-- 特殊设计的阴性对照siRNA、-- 不靶向任何已知的人、小鼠、大鼠基因-- 无任何化学修饰-- 通过基因芯片检测证明最小脱靶效应适用于人、小鼠、大鼠的RNAi实验阴性对照，其他物种亦可使用。
阴性对照siRNA实验数据：阴性对照分为两类，通用型阴性对照和Scramble阴性对照。
前者经过大规模的数据分析其与全基因组所有基因的同源性，并通过大量实验验证，适合作为大部分siRNA实验的通用型阴性对照。
siR-Ribo™Negative Control阴性对照是通用型阴性对照，使用软件分析并实验验证，与人、小鼠、大鼠等物种的基因同源性最小，是一个通用性较强的阴性对照，正式实验统计中常采用该对照进行siRNA沉默效率计算。
阴性对照siRNA应用实例：1) Li S, Xie H, Li S, Kang YJ.Copper stimulates growth of human umbilical vein endothelial cells in a vascular endothelial growth factor-independent pathway.Exp Biol Med (Maywood). 2012 Jan 1;237(1):77-82. Epub 2011 Dec 20.2) Guo WH, et al. Overexpression of SUMO-1 in hepatocellular carcinoma: a latent target for diagnosis and therapy of hepatoma. J Cancer Res Clin Oncol. 2010 May 26.3) Wang Q, Zhang W, Liu Q, Zhang X, Lv N, Ye L, Zhang X.A mutant of hepatitis B virus X protein (HBxDelta127) promotes cell growth through a positive feedback loop involving 5-lipoxygenase and fatty acid synthase.Neoplasia. 2010 Feb;12(2):103-15.广州市|锐博生物科技|有限|公|司，专业，提供阴性对照siRNA。
PROTOCOLsiRNA resuspension protocol Note: This protocol is written for siRNA, but may also be applied to microRNA mimic and hairpin inhibitor resuspension.1.Briefly centrifuge tubes containing siRNA to ensure that the siRNApellet is collected at the bottom of the tube.2. Resuspend in RNase-free 1x siRNA Buffer (See note below) for thedesired final concentration using volumes listed in Table 1.a.For example: for 10 nmol of siRNA and a 20 µM stock concentration,add 500 µL 1x siRNA Buffer.3.Pipette the solution up and down 3-5 times, avoiding the introductionof bubbles and securely seal tubes (or multi-well plates).4. Place the solution on an orbital mixer/shaker for 30 minutes atroom temperature.5. Briefly centrifuge tubes containing siRNA to ensure that the solution iscollected at the bottom of the tube.6. Verify the concentration of siRNA using UV spectrophotometry at260 nm. For siRNA, 1 µM = 13.3 ng/µL. For microRNA mimic, 1 µM=14.1 ng/µL, and microRNA hairpin inhibitor, 1 µM=18.5 ng/µL see FAQs for additional information.7. RNA may be used immediately, or aliquoted into smaller volumes tolimit the number of freeze-thaw cycles. Resuspended siRNA should be stored at -20 °C in a manual defrost or non-cycling freezer. Storage at4 °C is suitable for up to 6 weeks.Notes•Synthetic RNAi reagents should be resuspended in RNase-free solutions.We recommend 1x siRNA Buffer (diluted from 5x siRNA Buffer,Cat #B-002000-UB-100). For short-term storage, RNase-free water(Cat # B-003000-WB-100) is also appropriate for resuspension ofconcentrated stocks.•Salts present in buffer are known to affect the absorbance reading of RNA. For the most precise readings, dissolve in 4 volumes of sterile RNase-free water for spectrophotometric analysis. Then adjustwith addition of 5x siRNA Buffer appropriately to desired finalconcentration of siRNA adjusting to 1x siRNA Buffer. Please see the FAQ section on page 2.•To dilute the 5x siRNA Buffer to 1x siRNA Buffer, mix four volumes of sterile RNase-free water with one volume of 5x siRNA Buffer. The composition of the 1x siRNA Buffer is 60 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7.5, and 0.2 mM MgCl2.•5x siRNA Buffer is not intended for in vivo applications, as it has not been optimized for physiological conditions. Instead, an appropriately buffered RNase-free solution should be used.Technical considerations•For efficient siGENOME™ siRNA, ON-TARGETplus™ siRNA, or miRIDIAN™microRNA Mimic and Hairpin Inhibitor delivery, we stronglyrecommend following the instructions provided by the manufacturer for the delivery method of choice (such as transfection reagent,or electroporation) and taking measures to test and optimize theconditions best suited for the cell line or culture selected. Reviewprotocols using DharmaFECT™ transfection reagents or Accell™ siRNA delivery.Table 1. Recommended siRNA resuspension volumes and concentrationssiRNA Amount(nmol)1x siRNA Buffer to be added (µL) fordesired final concentration100 µM Stock20 µM Stock1.010502.0201005.0502501010050020200100050500Exceeds tube volume 1001000This protocol is written for siRNA, but may also be applied to microRNA mimic and hairpin inhibitor resuspension.For detailed recommendations for resuspension of siRNA/ microRNA in plates, please see our siRNA Library Guidelines.If you have any questions, contactt +44 (0) 1223 976 000 (UK) or +1 800 235 9880 (USA); +1 303 604 9499 (USA)f + 44 (0)1223 655 581w /contact-us or /service-and-support Horizon Discovery, 8100 Cambridge Research Park, Waterbeach, Cambridge, CB25 9TL, United KingdomAll trademarks are the property of Horizon Discovery Company unless otherwise specified. ©2018 Horizon Discovery Group Company—All rights reserved. First published June 2014. UK Registered Head Office: Building 8100, Cambridge Research Park, Cambridge, CB25 9TL, United Kingdom.V 7 -0 4 1 8•Assays for mRNA level, protein level, or phenotypic change may be performed to assess silencing effects. Because RNAi is an mRNA-specific event, we highly recommend assaying for reduction at the mRNA level using reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). Typical time points for detecting target knockdown with lipid-mediated siRNA or microRNA mimic delivery are 24-48 hours for mRNA and 48-96 hours for protein. Accell siRNA delivery is typically assessed at 72 hours or longer. Time course studies are recommended to identify optimal time points for assessing knockdown.Frequently asked questions (FAQs)How do I quantitate the resuspended siRNA?RNA is most accurately quantified by measuring its absorbance at 260 nm (A260) with a dual beam spectro-photometer.How do I calculate the concentration of the siRNA sample?Use Beer’s Law, A260 = (ε)(C)(L) where ε is the extinction coefficient (from the Product Transfer Form),C is the siRNA concentration, and L is the path length of the cuvette. Calculate the final concentration of the resuspended siRNA by solving for C and multiplying by the dilution factor.Why does the calculated amount of RNA in solution diff er from that on the Product Transfer Form?Salts present in 1x siRNA Buffer (or other resuspension solution) are known to cause a decrease in the absorbance reading of RNA.Differences in instrumentation for quantifying RNA may lead to differences in apparent values.Dual beam UV-VIS spectrophotometers are recommended.Sample is too concentrated. Absorbance values are most accurate between 0.15 and 0.6 andwithin the linear range of a standard curve.Sample is too diluted. Measurements with dilutions of small volumes (1-1.5 μL) are more susceptible to variation.Sample may not be fully resuspended. Heat samples to 95 ºC for 1-3 minutes and allow to coolfor 30-45 minutes to reanneal complementary strands.The siRNA has been at room temperature for a week. Will the siRNA still be okay?Yes. Samples are shipped as dried pellets and are stable at room temperature for 2-4 weeks. Upon receipt, we recommend that all samples should be stored at -20 °C or -70 °C to -80 °C.What is the average molecular weight of a siRNA, miRIDIAN™ Mimic , or miRIDIAN Hairpin Inhibitor?The average molecular weight (MW) of a siRNA is 13,300 g/mol. The average MW of a miRIDIAN mimic is 14,100 g/mol.The average MW of a miRIDIAN hairpin inhibitor is 18,500 g/molHow do I convert between nmol to µg of siRNA?Multiply the number of moles by the MW on the Product Transfer Form, or the average MW for your oligo. For example, 5 nmol of siRNA would be: (5 nmol)(13,300 g/mol)(mol/109 nmol)(106 µg/g) = 66.5 µgView additional Frequently Asked Questions (FAQs).。
⼴州市锐博⽣物科技有限公司SiRNA与RNAi实⽤实验技术⼿册⼴州市锐博⽣物科技有限公司SiRNA 与 RNAi 实⽤实验技术⼿册 RNA 是⽣物体内最重要的物质基础之⼀，它与 DNA 和蛋⽩质⼀起构成⽣命的框架，但长久以来，RNA 分⼦⼀直被认为是⼩⾓⾊。
然⽽，⼀系列发现表明——这些⼩分⼦ RNA 事实上操纵着许多细胞功能。
近年来的研究表明，将与mRNA 对应的正义RNA 和反义RNA 组成的双链RNA(dsRNA)导⼊细胞，可以使mRNA 发⽣特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA ⼲扰（RNAi ）。
它可通过互补序列的结合反作⽤于 mRNA ，从⽽关闭或调节基因的表达。
甚⾄某些⼩分⼦ RNA 可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。
RNA ⼲扰（RNAi ）是在线⾍中发现的，在 1998 年的⼀篇 Nature 论⽂中被公诸于众。
此后，科学家们还明⽩，RNAi 还有其他形式，它既是⼀种了解基因功能的强⼤⼯具，⼜是很多⽣物的基因组所采⽤的⼀种在演化上来讲很古⽼的防卫⽅法。
⼀、siRNA 和 RNAi 的概念双链 RNA 经酶切后会形成很多⼩⽚段，称为 siRNA ，这些⼩⽚段⼀旦与信使 RN A(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA 失去功能，即不能翻译产⽣蛋⽩质，也就是使基因“沉默”了，双链 RNA 对基因表达的阻断作⽤就被称为 RNA ⼲扰（RNA interference, RNAi ）。
⼆、RNAi 的分⼦机制⽬前 RNAi 的作⽤机理主要是在线⾍，果蝇，斑马鱼等⽣物体内阐明的。
⽣物体内的双链 RNA 可来⾃于 RNA 病毒感染、转座⼦的转录产物、外源导⼊的基因。
这些来源的双链 RNA 诱发了细胞内的 RNAi 机制，结果是病毒被清除、转座⼦的表达被阻断、外源导⼊基因表达被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
锐博生物阴性对照siRNA阴性对照siRNA简介：与靶基因无同源性，并最小化与其他基因的同源性，避免引起脱靶效应，是整个RNAi实验的基本参照。
阴性对照siRNA描述：-- 特殊设计的阴性对照siRNA、-- 不靶向任何已知的人、小鼠、大鼠基因-- 无任何化学修饰-- 通过基因芯片检测证明最小脱靶效应适用于人、小鼠、大鼠的RNAi实验阴性对照，其他物种亦可使用。
阴性对照siRNA实验数据：阴性对照分为两类，通用型阴性对照和Scramble阴性对照。
前者经过大规模的数据分析其与全基因组所有基因的同源性，并通过大量实验验证，适合作为大部分siRNA实验的通用型阴性对照。
siR-Ribo™Negative Control阴性对照是通用型阴性对照，使用软件分析并实验验证，与人、小鼠、大鼠等物种的基因同源性最小，是一个通用性较强的阴性对照，正式实验统计中常采用该对照进行siRNA沉默效率计算。
阴性对照siRNA应用实例：1) Li S, Xie H, Li S, Kang YJ.Copper stimulates growth of human umbilical vein endothelial cells in a vascular endothelial growth factor-independent pathway.Exp Biol Med (Maywood). 2012 Jan 1;237(1):77-82. Epub 2011 Dec 20.2) Guo WH, et al. Overexpression of SUMO-1 in hepatocellular carcinoma: a latent target for diagnosis and therapy of hepatoma. J Cancer Res Clin Oncol. 2010 May 26.3) Wang Q, Zhang W, Liu Q, Zhang X, Lv N, Ye L, Zhang X.A mutant of hepatitis B virus X protein (HBxDelta127) promotes cell growth through a positive feedback loop involving 5-lipoxygenase and fatty acid synthase.Neoplasia. 2010 Feb;12(2):103-15.广州市|锐博生物科技|有限|公|司，专业，提供阴性对照siRNA。
siRNA产品使用说明RN：R10043.5 产品简介常规化学合成siRNA为21~25nt的双链小分子RNA，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高通量筛选试验，可选择siRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的siRNA初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以ribo FECT™ CP Reagent 转染 siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表2。
1）接种细胞a.贴壁细胞：以Hela细胞为例，接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基（v1）的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到30~50%。
b.悬浮细胞：以THP1细胞为例，接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基（v1）的24孔板培养孔中。
siRNA使用说明（2009-08）名称：常规化学合成siRNA。
产品简介：常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。
产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。
保存和使用：保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上；冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。
开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。
例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。
注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。
（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。
使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理；特别提示：荧光标记siRNA要求避光。
使用方法：1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。
（siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。
2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）：(1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。
注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。
而细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。
(2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液（试剂的用量和体积，请参照“实验指导”）：a. 稀释转染试剂lipofectamine2000（以下称lipo2000）：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基（Opti- MEMⅠ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min；b. 稀释siRNA：用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA，轻轻混和；c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述（b）稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。
注意：稀释好的lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。
(3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和；(4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间（24～96h）。
沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h。
可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过37℃培养4～6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。
注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h后必须换成完全培养基（含血清、含抗生素），以确保细胞生长。
3. mRNA 水平的检测：siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。
一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。
检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。
4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体（针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体）或报告基因系统检测，检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。
一般说来，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般从48h开始检测，在36、48、72、96h，甚至更长时间之后多点采样。
实验指导表1、使用lipofectamine2000（invitrogen）转染siRNA 用量参考（siRNA 转染浓度为10-100nM）V1：细胞培养液体积；V2: siRNA-lipo2000混和液总体积 加入转染试剂的量/孔孔板 siRNA 的终浓度20μM siRNA 的量/孔 siRNA 稀释体积 (Opti-MEM) （lipo2000） lipo2000稀释体积(Opti-MEM) 每孔中总体积(V1+V2) 100nM0.5μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)50nM0.25μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)30nM0.15μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)20nM0.1μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL))96-well 10nM0.05μL 25μL 0.25μL 25μL 100μL （50μL+50μL)100nM2.5μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)50nM1.25μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)30nM0.75μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)20nM0.5μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)24-well 10nM0.25μL 50μL 1μL 50μL 500μL(400μL+100μL)100nM5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 50nM2.5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 30nM1.5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 20nM1μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 12-well 10nM0.5μL 100μL 2μL 100μL 1mL （800μL+200μL) 100nM10μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 50nM5μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 30nM3μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 20nM2μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL) 6-well 10nM 1μL 250μL 5μL 250μL 2mL (1500μL+500μL)表2、使用lipofectamine2000（invitrogen）siRNA 与DNA 共转染用量参考（siRNA 转染浓度为10-100nM） 孔板培养体积 质粒DNA 20μM siRNA siRNA/DNA 稀释体积(Opti-MEM)Lipo2000(μl) / 稀释体积 siRNA-DNA-lipo 2000总体积 96-well100μL 10-100 ng 0.05-0.5μL 25μL 0.2-0.5μL in 25μL 50μL 24-well500μL 100-200 ng 0.25-2.5μL 50μL 0.5-1.5μL in 50μL 100μL 12-well1 ml 200-500 ng 0.5-5μL 100μL 1.0-3.0μL in 100μL 200μL 6-well2 ml 500-1000 ng 1-10μL 250μL 2.5-6μL in 250μL 500μL 转染小贴示（以24孔板为例）：a. 24孔板每个孔的细胞培养总体积是500μL。
由于siRNA-lipo2000混和液的体积是100μL，转染前可以先将原细胞培养基（500μL）吸弃，更换为400μL 无抗生素（可含血清）的新鲜培养基，使得培养基体积与siRNA-lipo2000混和液体积之和刚好达到500μL。
转染时，各用50μL Opti MEM Ⅰ来分别稀释lipo2000和siRNA，对于24孔板，lipo2000用量是1μL/孔；siRNA 用量则根据所选用转染浓度而异（详见“实验指导”）。
b. 稀释lipo2000和siRNA 操作要点：lipo2000稀释后需要室温放置5min，才能与稀释好的siRNA 混合，因此，可以先稀释lipo2000，在静置期间再稀释siRNA。
两者稀释完毕，轻轻混合混匀，注意在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，过度用力可能会破坏脂质体的结构，以及siRNA-lipo2000混合物的形成。
上述混合液至少需要放置20min（室温），才能加到细胞培养板中，但是最长时间不能超过4-6h。
lipo2000用毕，请置于4℃冰箱，小心保存。
c. 混合液加板要点：siRNA-lipo2000混合液加入细胞培养板时，建议采用慢慢滴加的方法，从而防止局部脂质体浓度过高，对细胞造成损伤。
滴加完毕，轻轻摇动培养板，使混合均匀。
d. 在某些情况下（如转染效率不佳），可以尝试在血清饥饿的状态下转染，也就是转染前将原培养基换成400μL opti-MEM I 稀释液（无血清无抗生素的培养基），使得整个转染过程中，细胞都是处于无血清状态，注意这种情况下，转染完4～6h，必须进行换液操作。
e、在实验时，要求所有器具都应该是RNase-free的。
细胞培育基无法去除RNase，也无需对细胞培养基进行特殊处理，siRNA在转染时与培养基接触时间较短，另外siRNA-脂质体混合物的形成，对siRNA也有一定的保护作用。
f. 转染完成后在37℃的CO2培养箱培养24-72h，直到可以检测为止。
g. 对于筛选有效siRNA或需要首先确定有效转染浓度的实验，我们建议首先使用24孔板（3～5次实验）进行预实验，在正式实验开始后，请使用12孔板或6孔板（甚至更大的培养板），以确保后续实验过程中有足够RNA或蛋白量用于沉默效果的检测。
转染前后换液操作：1) 转染前换液：a. 如果细胞容易污染，在转染前一天铺板时，不能使用无抗生素的培养基，则经过18～24h培养后，在转染前务必要吸弃原培养基，更换成无抗生素的新鲜培养基（可以含有血清）。
