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EGFR基因启动子区甲基化状态分析

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DNA甲基化与肺癌临床关系研究进展

DNA甲基化与肺癌临床关系研究进展

等Ｉｌ叫应用甲基化特异性ＰＣＲ技术检测到３４／９０例（３７．７８％）
ＮＳＣＬＣ癌组织ＭＧＭＴ基因促进子甲基化，而无肺癌正常肺 组织未检测到ＭＧＭＴ基因促进子甲基化；９０例ＮＳＣＬＣ的
中位生存期是４．３年．而ＭＧＭＴ基因促进子甲基化阳性组中
位生存期仅为２．６年，两组差异显著（Ｐ＝０．０１７）。故认为
有独立的ＣｐＧ岛。ＮＯＲＥｌＡ启动子高甲基化频率在ＮＳＣＬＣ 中为１８％（３门７）。ＮＯＲＥｌＢ在同细胞系中无甲基化现象。原 发ＮＳＣＬＣ标本中２４％（６／２５）有ＮＯＲＥｌＡ甲基化【ｌ引。
３．２．２．２
ＭＧＭＴ促进子甲基化是独立的ＮＳＣＬＣ不利预后因索，是疾
病进展的重要标记物。Ｋｉｋｕｃｈｉｆ２０ｌ等在ｌ ０３例ＮＳＣＬＣ中检测
ＡＰＣ基因
万方数据
中国血液流变学杂志．２００９；１９（１）
１５５
』，肺腺癌表达分化蛋白．１ｆＤＡＬ，１）基因甲基化，结果显示在
肺腺癌中ＤＡＬ．１基因甲基化阳性发生率随肿瘤临床分期的增 高而逐渐增高『Ｉ期１ ３／３６例（３６．Ｉｌ％），Ⅱ期４／１２（３３．３３％）， ⅡＩ期１４／１７（８２．３５％），Ⅳ期３／３（１００％★Ｐ＝０．００２６】。ＤＡＬ．１ 基因甲基化的肺腺癌的元病生存期和总牛存期也显著缩短
基因异常与肺癌的发生密切相关。ＺｉＳｃｈｂａｕｅｒ－ＭＵｌｌｅｒ等”４｜报 道原发性ＮＳＣＬＣ中３７％出现该基因启动子ＣｐＧ岛甲基化，
肺癌细胞系为６５％。经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和免疫组化分析，ＦＨＩＴ 基因甲基化和其ｍＲＮＡ表达及蛋白缺失密切相关。提示
ＦＨＩＴ基因甲基化参与肺癌的形成，并可以作为危险因子检 测的指标。且ＦＨＩＴ基因可能为烟草致肺癌的靶基因，其肩 动子甲基化可能是肺癌的早期分子事件。

SOCS在神经系统的研究进展

SOCS在神经系统的研究进展

SOCS在神经系统的研究进展罗显华;宋锦宁【期刊名称】《中华神经外科疾病研究杂志》【年(卷),期】2016(015)003【总页数】4页(P280-283)【关键词】细胞因子信号抑制物1;细胞因子信号抑制物3;神经系统【作者】罗显华;宋锦宁【作者单位】西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,陕西西安710061【正文语种】中文【中图分类】R739细胞因子信号抑制物(suppressors of cytokine signaling, SOCS)是一种主要作用于酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路的胞内蛋白，其通过抑制STAT 单体的磷酸化，从而抑制细胞因子信号通过JAK/STAT信号通路的传导。

研究表明，该蛋白家族在神经系统广泛分布，与神经系统的发育分化密切相关；同时在神经系统的创伤、炎症、缺血、癫痫、肿瘤及感染等病理条件下，该蛋白家族均有不同程度的表达变化，SOCS与这些病理过程密切相关。

该蛋白在神经系统病理条件下表达的变化对于神经系统疾病的研究具有重要的意义，有效的利用该蛋白在神经病理条件下表达的变化，将为临床研究和治疗神经系统疾病提供新的方向。

SOCS1、SOCS3是SOCS家族中两个重要的成员，它们是由N区、SH2结构域、C区的SOCS盒三部分组成。

其中N区为可变区，SOCS1、SOCS3相对于SOCS4-SOCS7的N区为短；SH2结构域通过与其它信号蛋白磷酸化的酪氨酸残基相结合，进而调节多种细胞因子的信号转导；C区的SOCS盒为一段保守序列，约由40个氨基酸残基构成[1]。

目前发现的SOCS家族蛋白共有8种，分别是：细胞因子诱导的含有SH2结构域的蛋白(cytokine inducible SH2-containing protein, CIS)、SOCS1-SOCS7。

胶质母细胞瘤切除术后128例预后因素分析

胶质母细胞瘤切除术后128例预后因素分析

胶质母细胞瘤切除术后128例预后因素分析郑宗泰; 尹雷; 王鹏; 陈嘉伟; 林翰; 李炎稳; 周东【期刊名称】《《广东医学》》【年(卷),期】2019(040)011【总页数】5页(P1568-1572)【关键词】胶质母细胞瘤; 预后; 免疫组化; MGMT; EGFR【作者】郑宗泰; 尹雷; 王鹏; 陈嘉伟; 林翰; 李炎稳; 周东【作者单位】广东省人民医院(广东省医学科学院)神经外科广东广州510080; 汕头大学医学院; 广东省中医院脑病六科广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R651; S857.14+1胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤(47.1%)和最常见的胶质瘤(56.1%)[1]。

目前针对GBM的标准治疗方案为肿瘤尽可能最大范围安全切除，术后以Stupp方案治疗[2]。

尽管通过积极的手术治疗和术后辅助治疗，GBM患者的预后仍然不容乐观，5年生存率仅为5.5%[1]。

根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类，分子生物学诊断技术已成为胶质瘤诊断的重要内容之一，并成为胶质瘤精准分类的基础，从而能更好地为患者制定个体化治疗方案和判断患者的预后[3]。

我们应用免疫组织化学技术对GBM中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、P53和Bcl-2进行检测，结合患者的临床特征和随访信息，探究GBM患者手术切除术后预后因素，为GBM治疗方法的选择提供客观依据，具有一定的指导意义。

1 资料与方法1.1 一般资料入组标准：(1)所有患者皆为首次患病；(2)开颅手术前未接受其他治疗；(3)术前无严重心、肝、肾脏等重要器官功能异常；(4)术后病理确诊为GBM；(5)随访资料齐全。

egfr基因报告解读

egfr基因报告解读

EGFR基因报告解读EGFR（表皮生长因子受体）基因是一种重要的癌症相关基因，它在肿瘤的发生和进展中起着重要的作用。

EGFR基因报告是一种通过分析个体携带的EGFR基因突变信息，帮助医生制定个体化治疗方案的检测方法。

本文将从多个方面解读EGFR基因报告，以帮助读者更好地了解其意义和应用。

1.EGFR基因背景知识 EGFR基因位于人类染色体7p12.3上，编码一种膜上受体酪氨酸激酶。

该受体在正常细胞中参与细胞生长、分化和存活等生理过程。

然而，EGFR基因突变或过表达与多种癌症的发生和进展密切相关，特别是肺癌、结直肠癌和乳腺癌等。

因此，对EGFR基因进行分析和检测对于确定治疗方案具有重要意义。

2.EGFR突变的临床意义 EGFR基因突变会导致EGFR信号通路的异常激活，进而促进肿瘤细胞的生长和扩散。

目前已经发现一些特定的EGFR突变与肿瘤的敏感性和抗药性相关。

例如，在非小细胞肺癌患者中，EGFR基因突变对于靶向治疗药物（如吉非替尼）的疗效预测具有重要意义。

因此，EGFR 基因报告可以帮助医生针对患者个体情况，选择最合适的治疗方案。

3.EGFR基因报告的解读 EGFR基因报告通常包含患者的突变类型、突变频率、突变位点等信息。

其中，最常见的EGFR突变类型包括点突变、插入突变和缺失突变等。

通过解读EGFR基因报告，医生可以了解患者是否存在EGFR基因突变，以及突变类型和频率的具体情况。

这些信息有助于指导个体化治疗方案，提高治疗的准确性和有效性。

4.EGFR靶向治疗的应用基于EGFR基因报告的结果，医生可以选择合适的靶向治疗药物。

对于带有特定EGFR突变的患者，如EGFR T790M突变，可以选择奥西替尼作为治疗药物。

而对于EGFR基因突变阴性的患者，则需要考虑其他治疗方案。

EGFR靶向治疗的应用可以提高治疗效果，减少治疗的不必要性和副作用。

5.EGFR基因报告的局限性 EGFR基因报告虽然在个体化治疗中发挥重要作用，但也存在一些局限性。

非小细胞肺癌患者外周血和肺癌组织中ZIC1启动子甲基化检测的临床意义

非小细胞肺癌患者外周血和肺癌组织中ZIC1启动子甲基化检测的临床意义

doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0911·临床研究·非小细胞肺癌患者外周血和肺癌组织中ZIC1启动子甲基化检测的临床意义徐瑶1，刘世国1，张畅1，张黎2，姜姗2，张军霞1，彭黎1Clinical Significance of Detection of ZIC1 Promoter Methylation in Peripheral Bloodand Cancer Tissues of Non-small Cell Lung Cancer Patients XU Yao1, LIU Shiguo1, ZHANG Chang1, ZHANG Li2, JIANG Shan2, ZHANG Junxia1, PENG Li11. Department of Laboratory, The Third People’s Hospital of Hubei Province, Wuhan 430033,China; 2. Department of Pathology, The Third People’s Hospital of Hubei Province, Wuhan430033, ChinaCorrespondingAuthor:LIUShiguo,E-mail:****************Abstract: Objective To investigate the methylation status of ZIC1 gene in peripheral blood and lung cancer tissues of NSCLC patients and its prognostic significance. Methods We took the peripheral blood, cancer tissues and adjacent tissues of 95 NSCLC patients. The peripheral blood of 95 healthy people was taken as control group. MSP was used to compare the detection rate of ZIC1 methylation between peripheral blood and cancer tissues. And we analyzed the correlation of ZIC1 methylation in peripheral blood and cancer tissues with the clinicopathological factors of NSCLC patients. Results The methylation detection rates of ZIC1 in peripheral blood and lung cancer tissues in NSCLC patients were significantly higher than those in peripheralblood of healthy people and adjacent tissues of NSCLC patients (P<0.05), and the sensitivity and specificityof ZIC1 methylation in the diagnosis of tumor tissues were higher. The positive rate of ZIC1 gene methylation in peripheral blood and tumor tissues of NSCLC patients was significantly correlated with tumor diameter,metastasis, stage and pleural effusion (P<0.05). Conclusion The methylation of ZIC1 gene is related to the occurrence, development, metastasis and stage of NSCLC. It may be used as a diagnostic and prognostic indicator of NSCLC.Key words: ZIC1 methylation; MSP; Non-small cell lung cancer; Lung cancer tissueFunding: General Projects of Natural Science Foundation of Hubei Province (No. 2016CFB694); Research Fund Project of Wuhan Health and Family Planning Commission (No. WX16Z07)Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.摘 要：目的 探讨ZIC1基因在NSCLC患者外周血和肺肿瘤组织中的甲基化状态，及其对NSCLC的预后评估意义。

含表皮生长因子受体(EGFR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立

含表皮生长因子受体(EGFR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立

918细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol ImmU n〇l)2020, 36(10) .论著•文章编号：1007 -8738(2020)10 -0918 -06含表皮生长因子受体（E G FR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌 细胞模型的建立梁丹丹、王春苗\李俊莹、覃良淑\粟正英2,侯华新|+G广西医科大学药物分析教研室，广西南宁530021; 2广西国际壮医医院药学部，广西南宁530201)[摘要]目的建立稳定表达人表皮生长因子受体（EGFR)启动子及萤光素酶（Luc)报告基因的三阴性乳腺癌细胞系，并对其 应用进行初步验证。

方法采用基因重组技术，构建含有EGFR启动子以及Luc报告基因的慢病毒载体，并感染MDA-M B231 细胞，经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的MDA-M B231-EGFR-Luc2细胞系；分别采用EGFR激活剂EG F以及抑制剂 吉非替尼处理细胞后检测Luc活性变化。

结果通过基因测序和质粒双酶切鉴定，EGFR基因启动子Luc报告基因-慢病毒表 达载体构建成功，经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Luc的MDA-MB231-EGFR-LU C2细胞；EGF可剂量依赖性的增加细胞中Luc 的活性，而吉非替尼则相反。

结论建立了MDA-M B231-EGFR-Luc2稳定表达EGFR启动子及Luc报告基因细胞系，为高通量 筛选靶向EGFR的抗肿瘤药物提供一类新的细胞模型。

[关键词]表皮生长因子受体；启动子；萤光素酶报告基因；三阴性乳腺癌；MDA-MB231细胞[中图分类号]Q279, R737.9, R392-33, R965 [文献标志码]A表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,E G F R)为跨膜酪氨酸激酶蛋白，是酪氨酸 激酶受体超家族的成员之一。

E G F R调控的信号通 路在细胞增殖、存活、分化、迁移中发挥着关键作 用[1_3]，E G F R在肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌等 多种恶性肿瘤中均呈高表达且与患者的预后不良密 切相关[4_6]。

胆囊癌的诊断与治疗进展

临床肝胆病杂志第39卷第11期2023年11月J Clin Hepatol， Vol.39 No.11， Nov.2023胆囊癌的诊断与治疗进展乐羿，杨豪，刘虎，崔昭扬，赵向宁，安亮，李海珠，张绍庚上海孟超肿瘤医院肿瘤外科，上海 201805通信作者：张绍庚，**********************（ORCID： 0000-0003-0680-2322）摘要：胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，早期症状特异性差，恶性程度极高，进展迅速，难以早期诊断。

胆囊结石、胆囊息肉等被认为是最常见的危险因素。

超声检查是其首选检查，CT、MRI、PET等也各具优势。

胆囊癌缺乏根治性治疗手段，外科手术仍是胆囊癌首选的治疗方式，但其进展迅速，很多患者确诊时已难以行手术治疗，放化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种治疗方式联合，在一定程度上改善了患者预后，但其远期治疗效果仍不理想，因此，预防为主、治疗为辅，早发现、早治疗显得尤为重要。

关键词：胆囊肿瘤；危险因素；诊断；治疗学基金项目：上海市嘉定区卫生健康委科研立项项目（2022-KY-19）Advances in the diagnosis and treatment of gallbladder carcinomaLE Yi， YANG Hao， LIU Hu， CUI Zhaoyang， ZHAO Xiangning， AN Liang， LI Haizhu， ZHANG Shaogeng.（Department of Tumor Surgery， Shanghai Mengchao Cancer Hospital， Shanghai 201805， China）Corresponding author： ZHANG Shaogeng，**********************（ORCID： 0000-0003-0680-2322）Abstract：Gallbladder carcinoma is a common malignant tumor of the biliary system characterized by poor specificity of early symptoms，a high degree of malignancy，and rapid progression，and it is difficult to make an early diagnosis. Gallstones and gallbladder polyps are considered the most common risk factors for gallbladder carcinoma. Ultrasound is the preferred examination，while CT，MRI，and PET also have their own advantages. There is a lack of radical treatment methods for gallbladder carcinoma，and surgical operation remains the preferred treatment method for gallbladder carcinoma； however， due to the rapid progression of this disease， most patients have lost the opportunity for surgery at the time of diagnosis. A combination of various treatment modalities，such as radiochemotherapy，targeted therapy，and immunotherapy， has improved the prognosis of patients to a certain extent， but with an unsatisfactory long-term therapeutic effect. Therefore，it is of particular importance to give priority to prevention rather than treatment and emphasize early identification and treatment.Key words：Gallbladder Neoplasms； Risk Factors； Diagnosis； TherapeuticsResearch funding：Scientific Research Project approved by Health Commission of Jiading District， Shanghai （2022-KY-19）胆囊癌（gallbladder cancer，GBC）是胆道系统最常见的恶性肿瘤，占胆道恶性肿瘤的80%～95%，在消化道肿瘤中死亡率排名第6位［1］。

驱动基因阳性肺癌外周血EGFR甲基化及临床意义

驱动基因阳性肺癌外周血EGFR甲基化及临床意义刘东;李真;王保庆;王自全;王丙武;李庆妍【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2024(53)1【摘要】目的探讨EGFR驱动基因阳性肺癌患者外周血中EGFR甲基化水平与临床意义。

方法运用基质辅助激光电离飞行质谱(matrix-assisted laser desorption/ionisation,time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)法检测32例EGFR驱动基因阳性(EGFR 19del、21 L858R)肺腺癌患者和24例正常对照组外周血中EGFR基因CpG岛甲基化水平,筛选肺癌发生差异性甲基化CpG 位点,并分析其与临床病理特征、EGFR突变亚型的相关性。

结果EGFR在EGFR驱动基因阳性肺癌组中甲基化水平普遍低于正常对照组,其中EGFR#29CpG_2,EGFR#30 CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42在肺癌组中甲基化率(25.7%±2.1%、4.6%±0.4%、2.8%±0.7%、4.4%±0.4%)低于正常对照组(36.5%±4.6%、6.0%±0.6%、4.8%±0.9%、7.1%±0.4%),差异有统计学意义(P<0.05)。

EGFR甲基化与肺癌患者年龄、分化程度、发病位置、TNM分期均无相关性(P>0.05)。

EGFR#30 CpG_25在女性肺癌患者中较男性患者呈现较低的甲基化水平,差异有统计学意义(P<0.05)。

EGFR#30 CpG_25在吸烟组肺癌患者中较不吸烟患者呈高甲基化状态,差异有统计学意义(P<0.05)。

而EGFR#30CpG_8.9.10.11在淋巴结转移组中的甲基化水平要低于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。

查询启动子区及甲基化位点预测 20130914

如何查询基因的启动子区及甲基化位点的预测
案例：NR_028414
打开ncbi，选择”Gene”，输入“NR_028414 ”
查看“Genomic Context”
注意这个基因的位置范围（即45430060..45434643）
在染色体上的方向为正向（从左到右），即位置45430060之前为启动子区域
选择基因示意图
1）向下查看“Genomic regions, transcripts, and products”
2）将鼠标放在Genes的“NR_028412.1”示意图上
3）在弹出的窗口中点击
点击FASTA View
FASTA View的“45430060..45434643”代表的是NR_028412位置
出现该基因的实际序列
45430060代表起始位置
调整显示的位置
按刚才的基因范围调整一下这个数字：
一般起始位置（即45430060）向前推1000BP,向后推1000bp
更改基因范围后得到的序列，可以直接用于甲基化预测
将上面得到的序列，拷贝至以下网站：/cgi-
bin/methprimer/methprimer.cgi
点击submit,进入
结果显示有1000-1500区域段是可能发生甲基化的，后面那个蓝色区域距离有点远，因为这个基因的一号外显子本身是很短的，所以最终选择的片段如下：。

肝癌基因甲基化

肝癌基因甲基化肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其发生和发展与基因甲基化密切相关。

基因甲基化是指DNA分子上的甲基基团与胞嘧啶（C）结合的化学修饰过程。

肝癌基因的甲基化异常会导致基因的失活或过度激活，从而参与肝癌的发生和进展。

肝癌是一种高度复杂的疾病，其发生和发展是多因素、多基因参与的过程。

研究表明，肝癌的发生与基因组DNA的甲基化状态密切相关。

正常细胞中，甲基化主要发生在基因的启动子区域，通过调控基因的表达来维持细胞的正常功能。

而在肝癌细胞中，基因的甲基化状态发生异常，导致一些关键基因的表达发生改变，从而促进肿瘤的发生和发展。

肝癌基因甲基化的异常会引起关键抑癌基因的失活。

抑癌基因是一类能够抑制肿瘤细胞生长和分化的基因。

研究发现，在肝癌组织中，抑癌基因的启动子区域往往存在甲基化修饰，导致这些基因的表达受到抑制。

例如，肝癌细胞中常见的抑癌基因CDKN2A在其启动子区域发生甲基化，导致该基因的表达下调，失去了抑制肿瘤细胞增殖的功能。

肝癌基因甲基化的异常还会导致一些肿瘤相关基因的过度激活。

肿瘤相关基因是一类能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭的基因。

在肝癌组织中，这些基因的启动子区域常常存在甲基化修饰，导致其表达水平上调。

例如，肝癌细胞中常见的肿瘤相关基因FOXM1，在其启动子区域的甲基化状态发生改变后，会导致该基因的过度激活，促进肿瘤细胞的增殖和转移。

肝癌基因甲基化在肿瘤干细胞中也起到重要作用。

肿瘤干细胞是一种能够自我更新和不断分化的细胞群体，具有肿瘤发生和耐药性的能力。

研究发现，肝癌干细胞中的一些关键基因的甲基化状态发生改变，导致这些基因的表达异常。

这些基因的失活或过度激活会导致肿瘤干细胞的异常增殖和分化，进而促进肝癌的发展和转移。

肝癌基因甲基化的异常还与肝癌的临床特征和预后密切相关。

研究表明，肝癌组织中某些特定基因的甲基化程度与肝癌的分型、侵袭性以及预后有关。

例如，肝癌组织中DNA甲基转移酶DNMT3B的高表达与肝癌的侵袭能力和预后密切相关。

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02 23 ； 接受日期： 20100409 收稿日期： 2010No. 2009 CB521800 ） ， 国家重点基础研究发展规划（ 973 计划， 北京自然科学基金（ No. 7062009 ） 项目资助
*
联系人
Tel ：01083911675 ； E-mail ： yxzhang@ ccmu. edu. cn
+ 本实验运用 Bisulfite Sequencing PCR （ BSP ） 方 法 检 测 了 2 种 肿 瘤 细 胞 HeLa （ EGFR ） 和 K562
（ EGFR ） EGFR 基因 － 1 300 ～ + 600 的甲基化状态 . 所检测目的片段共包含 178 个 CpG 位点 . 发现 EGFR 阳性与 EGFR 阴性两种细胞系的甲基化状态不同 ： 宫颈癌细胞系 HeLa 转录起始点附近包括 白血病细胞系 K562 转录起始点附近包括第一外 第一外显子区 （ － 244 ～ + 91 ） 处于非甲基化状态 ， 显子区呈嵌合性的高甲基化状态 . 因此 ， 第一外显子比启动子区的甲基化状态更能反映基因的活化 状况 . 关键词 表皮生长因子受体基因 ； 启动子 ； 甲基化 Q78 中图分类号
ISSN 10077626 CN 113870 / Q
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2010 年 6 月 26 （ 6 ） ：568 ～ 574
EGFR 基因启动子区甲基化状态分析
周少贞 ， 李相辉 ， 张玉祥
Methylation Patterns of the Human EGFR Gene Promoter Region
ZHOU Shao-Zhen ，LI Xiang-Hui ，ZHANG Yu-Xiang *
（ Department of Biochemistry and Molecular Biology ， Capital Medical University ， Beijing 100069 ， China ）
1
1. 1
材料与方法
材料 宫颈癌细胞系 HeLa 、 白血病细胞系 K562 （ 中国
RPMI1640 培 养 基 （ Gibco 公 司 ） ， 科学院 细 胞 库 ） ， FBS ， Hyclone 公 司 ） ， 胎牛血 清 （ fetal bovine serum ， Hyclone 公 司 ） ， 链青 霉 素 （ PS ， 重 亚 硫 酸 钠 （ sodium bisulfite ，Sigma 公 司 ） 、 氢 氧 化 钠 （ Sigma 公 司 ） 、 对 苯 二 酚 （ Hydroquinone ， Sigma 公 司 ） ，LA Taq （ TaKaRa 公 司 ） ， DNA 纯 化 试 剂 盒 （ Macherey-Nagel pMD18 T 载 体 公司 ） ， 矿 物 油 （ Bio-Rad 公 司 ） ， （ TaKaRa 公司 ） . 引 物 合 成 及 测 序 单 位 为 上 海 生 工 生物工程技术服务有限公司 . 1. 2 细胞培养 37 ℃ 的 培 养 箱 中， 在 5% CO 2 ， 用 含 有 10% FBS 1640 培养基对 HeLa 、 K562 细胞进行培养 . 的 RPMI1. 3 细胞基因组的提取 K562 细 胞， 10 000 r / min 离 心 1 培 养 HeLa 、 min ， 收集细胞 . 用 PBS 缓 冲 液 悬 浮 细 胞， 再次离心 收集细胞 . 沉淀加入 0. 4 mL 双 蒸 水 迅 速 吹 散， 加入 0. 4 mL 细胞 裂 解 液， 55℃ 水 浴 过 夜 . 加 RNase A 至 37 ℃ 温 浴 1 h. 加 入 等 体 积 酚 / 终浓度 200 μ g / mL ， 10 000 r / min 离 心 10 氯仿（ 1∶ 1 ） ， 冰上放置 10 min ， min ， 取 上 清， 加 入 等 体 积 氯 仿， 冰 上 放 置 10 min ， 10 000 r / min 离心 10 min ， . 取上清， 加入 1 /10 体 积 的 3 mol / L NaAc 和 2. 5 倍体积的无水乙醇，－ 20 ℃ 4 ℃ 12 000 r / min 离 心 20 min ， 70% 乙 醇 沉淀 2 h ， 洗沉 淀， 室 温 放 置 待 乙 醇 完 全 挥 发 后， 加 入 50 μ L ddH 2 O 溶解 . 1. 4 基因组质量检测 用 DNA / RNA 将抽提后 的 基 因 组 稀 释 100 倍， 微量定量仪 进 行 定 量， 并 对 其 纯 度 进 行 检 测. 提 取 DNA 的 A 260 / 280 比 值 范 围 为 1. 8 ～ 2. 0. 0. 8% 琼 脂 糖 凝胶电泳鉴定基因组 DNA. 1. 5 亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA
Abstract The epidermal growth factor receptor （ EGFR ） is a member of the HER / ERB-B family of transmembrane receptor kinases. Overexpression of EGFR confers advantages in cell proliferation ， survival ，and migration and correlates with decreased survival in multiple solid tumors. However ，our knowledge regarding EGFR expression and regulation is still limited. CpG island hypermethylation is associated with transcriptional silencing. Thus ，we looked into the methylation pattern of EGFR promoter and first exon region using bisulfite sequencing PCR （ BSP ） . The 5′ regulatory sequence of the EGFR gene contains a GC rich promoter without any consensus sequences ，such as TATA or CAAT boxes. Therefore ，transcription starts at multiple initiation sites within the promoter region. Five sets of primers were designed to amplify nt 1300 to + 600 （ relative to ATG ） region （ which contains 178 CpG sites ） of the human EGFR gene and methylation status were investigated in HeLa （ EGFR + ） and K562 （ EGFR － ） cells. The two cell lines have different methylation patterns ： low methylation was found in HeLa cells around the transcription start site ，especially the first exon region from － 244 to + 91 ，and a mosaic dense methylation status in the human leukemia K562 cell line in the same region. Our results indicate that the methylation status of the first exon ，rather than promoter region is a better indicator for the EGFR gene activity. Key words epidermal growth factor receptor gene EGFR ； promoter ； methylation
Received ： February 23 ，2010 ； Accepted ： April 9 ，2010 No. 2009CB521800 ） and Beijing Natural Science Foundation Supported by Major State Basic Research Development Program of China （ 973 Program ， （ No. 7062009 ）
（ 首都医科大学生物化学与分子生物学系 ， 北京 * 100069 ）
摘要
EGFR ） 是 HER / ERB-B 跨膜受体Байду номын сангаас酶家 表皮生长因子受体 （ epidermal growth factor receptor ，
族成员之一 . EGFR 的过表达 促 进 细 胞 的 增 殖 、 存 活 和 迁 移， 与 许 多 实 体 瘤 病 人 的 低 存 活 率 相 关. EGFR 的表达受其启动子 DNA 甲基化调控 . EGFR 的转录沉默与 CpG 岛高甲基化相关 . EGFR 基因 5′调控区包括 1 个富含 GC 的启动子 ， 缺保守序列 TATA 盒和 CAAT 盒 ， 有多个位点可以起始转录 .
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的甲 基 化 状 态 . 实 验 测 序 片 段 覆 盖 EGFR 基 因 － 1 300 ～ + 600 ， 共包 含 178 个 CpG 位 点， 通过对 EGFR 基因表达与不表达 的 两 种 细 胞 系 的 甲 基 化 状 发 现 宫 颈 癌 细 胞 系 HeLa 转 录 起 始 点 态进行分析， 附近即第 1 外显 子 － 244 ～ + 91 处 于 非 甲 基 化 状 态， 白血 病 细 胞 系 K562 第 1 外 显 子 呈 嵌 合 性 的 高 甲基化状态， 由此我们认为， 第 1 外显子比启动子区 的甲基化状态更能反映基因的表达状况 .