一种适用于线粒体基因表达分析的cDNA—RAPD方法

RAPD检查方法及意义
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA，是一种利用特定引物与无结构DNA作用，从而扩增出其特異或通用性DNA片段的技术。

它可以扩增出庞大的片段，也可以扩增出裂解服从于经典的单倍体型的微不足道的片段。

RAPD技术借助于PCR（聚合酶链反应）技术，可以仅用少量的DNA，用非特异性引物进行扩增，从而得到很多特定碱基序列，并测定这些片段在不同样本间的差异，有利于生物遗传信息学的研究。

RAPD技术的最大特点之一是能检测大范围内的遗传多态性，可以检测不同的DNA序列，RAPD技术使用的引物一般无特异性，也可以利用这些引物检测基因组中的不同位置的片段，从而在基因组结构与遗传多态性的研究方面，具有很大的潜力。

RAPD技术主要用在生物学的分子标记技术、基因组学、植物种质资源分子识别等方面，在动物育种，植物育种以及遗传改良，在动物种群族群结构研究中。

这种技术可以为鉴定和追踪遗传变异提供快速和高效的证据，为改善品种而进行的育种遗传改良和变异研究提供依据。

分子生物学名词解释分子生物学考试重点一、名词解释1、分子生物学(molecular biology)：分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。

2、C值(C value)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。

在真核生物中，C值一般是随生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物。

3、DNA多态性(DNA polymorphism)：DNA多态性是指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异。

4、端粒(telomere)：端粒是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，它是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体。

5、半保留复制(semi-conservative replication)：DNA 在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。

这样形成的两个DNA分子与原来DNA 分子的碱基顺序完全一样。

一次，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA 的半保留复制。

6、复制子(replicon)：复制子是指生物体的复制单位。

一个复制子只含一个复制起点。

7、半不连续复制(semi-discontinuous replication)：DNA 复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是中断的、不连续的，因此称为半不连续复制。

8、前导链(leading strand)：与复制叉移动的方向一致，通过连续的5W聚合合成的新的DNA链。

9、后随链(lagging strand)：与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5\T聚合合成的新的DNA链。

10、AP位点(AP site)：所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖昔水解酶，它能特异性切除受损核昔酸上N-B糖昔键，在DNA链上形成去嘌吟或去嘧啶位点，统称为AP位点。

11、cDNA(complementary DNA)：在体外以mRNA 为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。

分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。

所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。

广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。

通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。

分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。

2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。

2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。

2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。

2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。

RFLP和RAPD技术原理和操作步骤原理：DNA分⼦⽔准上的多态性检验测定技术是施⾏基因组研讨的基础。

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限⽌断⽚长度多态性)已被⼴泛⽤于基因组遗传图谱构建、基因定位以及有⽣命的物质⾼级演化和分类的研讨。

RFLP是依据不⼀样品种（个体）基因组的限⽌性内切酶的酶切位点碱基发⽣突变，或酶切位点之间发⽣了碱基的插进去、缺失，造成酶切断⽚体积发⽣了变动，这种变动可以经过特别指定探针杂交施⾏检验测定，因此可⽐较不⼀样品种（个体）的DNA⽔准的差别（即多态性），多个探针的⽐较可以稳固建⽴有⽣命的物质的⾼级演化和分类关系。

所⽤的探针为出处于同种或不⼀样种基因组DNA的克隆，位于染⾊体的不⼀样位点，因此可以作为⼀种分⼦标记(马克)，构建分⼦图谱。

当某个性状（基因）与某个（些）分⼦标记协同离合时，表明这个性状（基因）与分⼦标记连锁。

分⼦标记与性状之间交换值的体积，即表达⽬的基因与分⼦标记之间的距离，因此可将基因定位于分⼦图谱上。

分⼦标记克隆在质粒上，可以蕃息及保留。

不⼀样限⽌性内切酶割切基因组DNA后，所切的断⽚类型不同，因为这个，限⽌性内切酶与分⼦标记组成不⼀样组合施⾏研讨。

常⽤的限⽌性内切酶普通是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,⽽分⼦标记则有⼏个甚⾄于上千个。

分⼦标记越多，则所构建的图谱就越达到最⾼限度。

构建达到最⾼限度图谱是RFLP研讨的主重要的条⽬标之⼀。

使⽤随机引物扩增寻觅多态性DNA断⽚可作为分⼦标记。

这种办法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。

尽管RAPD技术诞⽣的时间很短, 但因为其独有特别的检验测定DNA多态性的形式以及迅速、简单⽅便的独特的地⽅,使这个技术已渗透于基因组研讨的多种⽅⾯。

该RAPD技术树⽴于PCR技术基础上,它是利⽤⼀系列(⼀般数百个)不⼀样的随机排列碱基顺着次序的寡聚核苷酸单链(⼀般为10聚体)为引物,对所研讨基因组DNA施⾏PCR扩增.聚丙烯酰胺或⽯花胶糖电泳离合,经EB染⾊或放射性⾃显影来检验测定扩增加产量物DNA断⽚的多态性,这些个扩增加产量物DNA断⽚的多态性反映了基因组相应地区范围的DNA多态性。

RAPD 标记技术。

为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams等于1990 年建立了随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快渗透于基因研究的各个领域。

RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。

对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

优点：与RFLP 相比,RAPD 技术简单,检测速度快,DNA 用量少,实验设备简单,不需DNA 探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。

缺点：当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。

当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD 对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2 +浓度,所以实验的重复性差。

SSR 标记技术。

在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA (Microsatellite DNA) 。

分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。

细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。

质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。

F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。

随机扩增多态性DNA标记技术参考周延清2005.生物实验室系列---DNA分子标记技术在植物研究中的应用. [北京]化学工业出版社P79-130一、引言随机扩增多态性DNA标记技术,检测出核酸碱基序列的变异，并且将这种变异以遗传标记的方式予以应用，使植物遗传学许多方面的研究产生了革命性的变化。

最早检测到的DNA水平的变化是限制性片段长度多态性（RFLP）。

但是，在过去一段时间，聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）极大的影响了分子生物学几乎所有领域，而且基本程序被改进后，可以开发出多种检测核苷酸水平差异的方法。

不过，这些方法大多需要预先知道DNA片段序列的一些信息，以便根据已知的信息设计合成目的的DNA序列两端的引物，通过PCR选择性地扩增目的的DNA。

1990年，Williams等发表了一种检测核苷酸序列多态性的新方法，这种方法以PCR为基础，可不必预先知道DNA序列的信息。

随后，随机扩增多态性DNA技术（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）广泛地应用于植物和其它领域的研究中。

RAPD标记技术由于操作简便、快速、省时、省力、DNA用量少，迅速受到人们重视，并在农、林、医及植物和微生物学的各个领域中得到广泛应用，在基因定位与分离、连锁和系统演化等各方面取得了很大的进展。

二、RAPD标记技术的概念和原理任何生物种都具有特定顺序和结构的遗传物质---------DNA。

由于在生物进化过程中选择性的不同。

生物基因组DNA的不同区域表现出高度保守或高度变异的现象，具有不同的遗传多样性。

随机扩增多态性DNA（RAPD）标记技术是通过分析遗传物质DNA经过PCR扩增的多态性来诊断生物体内在基因排布与外在性状表现的规律的技术，由于片段被引物选择性地扩增，扩增了的片段能在凝胶上清晰地显现出来，这样就可以通过同种引物扩条带的多态性反映出模板的多态性，RAPD只需要一个引物，长度为10个核苷酸左右，引物顺序是随机的，因而可以在对被检测对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。

眼科中RAPD阳性的原理
RAPD（逆行性反应瞳孔缩小）是眼科中一种常见的诊断方法，用于检测视神经损伤。

正常情况下，当光照射到眼睛时，双眼的瞳孔都会同步缩小，这是因为光的刺激通过视神经传导至大脑皮层，再通过神经系统回馈到脑干视束层，并通过交叉运动受损纤维传递给对侧瞳孔收缩神经核。

然后，对侧瞳孔的收缩神经核通过交叉传输回到受损一侧，进而引起受损一侧的瞳孔收缩。

当视神经受损时，在光刺激下，既会有正常的直接反射，也会有异常的逆行性反射。

由于受损视神经导致刺激传导中断或减弱，反射信号无法正常传输，因此受损一侧的瞳孔不能收缩，而对侧健康一侧的瞳孔则会正常收缩。

这种现象被称为RAPD阳性（逆行性反应瞳孔缩小），也称为Marcus Gunn瞳孔现象。

RAPD阳性是一种客观指标，通常通过Swinging Light Test（摇摆光测试）进行检测。

医生会在双眼之间来回摆动光源，观察每次切换时双眼瞳孔的反应。

如果一侧瞳孔的直接反射和对侧瞳孔的逆行性反射不一致，即对光刺激的反应不对称，就说明该眼存在视神经损伤，并且RAPD阳性存在。

RAPD分析技术1 导论聚合酶链式反应（PCR）以其优越性极大地影响到了分子生物学的几乎所有领域，并以其基本程序和DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis），开发出多种检测核苷酸变异的方法。

RAPD（Random Amplifed Polymorphic DNA）就是其中的一种，它是1990年美国杜邦公司科学家J. G. K. Williams和加利福尼亚生物研究所J. Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。

Williams称之为RAPD，Welsh叫它AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）（Welsh J et al, Nucl Acids Res, 1990(18):7213; Williams J G K et al, Nucl Acids Res, 1990(18):6531）。

与常规PCR相比，RAPD主要有以下的自身特点：①无需专门设计RAPD 扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。

引物长度一般为9～10个寡核苷酸。

②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。

③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。

④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。

利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。

RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。

由于RAPD 反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。

有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式：①5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。

1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。

技术路线：不同个体DNA的提取PCR扩增目的片断酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。

由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。

单一引物与反向重复序列结合。

使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：选择随机引物DNA的提取PCR反应凝胶电泳图谱分析RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。

RAPD最大缺点是重复性较差。

RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。

为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg2+浓度等。

只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。

这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。

尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。

该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR 扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。

通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA 的多态性。

分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。

因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP 的分子标记进行作图分析2.RAPD采用随机合成的寡核苷酸（10bp)作PCR的引物，对所研究生物基因组DNA进行PCR 扩增，经过30-40个循环，即可得到大量的DNA片断，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外下显示RAPD带纹。