水稻原生质体细胞核及原生质体融合体的 简易染色观察法

综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。

它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。

1954年，植物单细胞培养才获得成功。

Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；I960年Jones等建立了微室培养法。

同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。

随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。

实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。

是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。

高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，20〜50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醛键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可昨为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

1.从科研文献中找出各类显微镜的细胞图像，截图说明图像科学含义，并列出参考文献一.普通光学显微镜细胞生物学杂志第26卷第3期水稻原生质体细胞核及原生质体融合体的简易染色观察法向太和* , 王利琳( 杭州师范学院生命科学学院, 杭州3 1 0 0 3 6 )二.暗视野显微镜微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 50(10) :1366 －1372; 4 October 2010 ISSN 0001 －6209; CN 11 －1995 /Q分离自蜜蜂(Apismellifera)的三株螺原体的基本特性回丽静，钟志平，胡冰，杨冰，纪燕玲，于汉寿* (南京农业大学，农业部环境微生物工程重点开放实验室，南京210095)三.荧光显微镜中华医院感染学杂志2010 年第20 卷第11期乙胺丁醇耐药基因embB突变的杂交荧光显微观测陈庆海1 , 黄君富1 , 府伟灵1 ,张雪2 , 匡红1 , 王珂1( 1.第三军医大学第一附属医院检验科, 重庆400038; 2.解放军第452医院检验科, 四川成都610021)四.激光共聚焦显微镜激光生物学报第16卷第1期2007年2月不同应变对骨髓间充质干细胞系细胞骨架影响的研究*赵红斌1, 2, 张西正1*, 吴金辉1, 郭勇1, 毛雁1(1 .军事医学科学院卫生装备研究所, 天津300161;2 . 兰州军区总医院, 甘肃兰州730050 )五.相差显微镜华西口腔医学杂志第28 卷第 4 期2010 年8 月West China Journal of Stomatology Vol．28 No.4 Aug.2010小鼠增强型绿色荧光蛋白-过氧化物酶体增长因子活化受体γ2融合表达重组腺病毒的构建及表达廖丽姿1 肖金刚1 杨苗苗1 孔子任1 孙钦策2 田卫东1 （1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川成都610041；2.四川大学生命科学学院，四川成都610064）六.微分干涉显微镜植物生理学报植物生理学报Plant Physiology Journal Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1082~1088多胺生物合成抑制剂D-精氨酸对拟南芥幼苗根系生长的影响高红, 陈春丽* 华中农业大学生命科学技术学院, 武汉430070七.扫描电镜昆虫天敌NATURAL ENEMIES OF INSECTS第26 卷第 4 期2004 年12 月侧沟茧蜂触角感觉器的扫描电镜观察陈新芳1 高燕2 章潜才1( 1.华南农业大学测试中心 2.华南农业大学资源环境学院广州510642)八.透射电镜昆虫学报ActaEntomologicaSinica，August 2013，56( 8) : 960 －964粉尘螨生殖系统超微结构的透射电镜观察王月明1，2，刘晓宇1，黄礼年2，孙新3，刘志刚1，* ( 1．深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，广东深圳518060; 2．蚌埠医学院第一附属医院呼吸科，安徽蚌埠233000; 3．蚌埠医学院寄生虫学教研室，安徽蚌埠233000)九.冰冻蚀刻1 9 8 9年12月复旦学报（自然科学版）第82 卷第4 期菠菜类囊体膜的亚微结构和功能张克荣孙鸿乔高国肖吴成军苗玉渠吕美筱(生物化学系) 陈仲宜蔡同润胡德珍王子斌(分析测试中心)2.以《DNA时代——老化与死亡》为例，举出科学家用哪些研究手段开展了细胞衰老的研究？思考开展科学研究可分为几个阶段步骤？分别做什么？研究手段：访谈、个案研究、实验法、观察法阶段步骤：1.提出问题：根据一些现象提出问题2.作出假设：根据自己已有的知识和生活经验对问题的答案作出假设3.制定计划：设计探究的方案，包括选择材料、设计方法步骤等4.实施计划：按照探究方案进行探究，得到结果5.得出结论：分析所得的结果与假设是否相符，从而得出结论．。

水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。

现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。

本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。

一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。

或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。

注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。

制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。

2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。

通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。

质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。

二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。

50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。

基于 VBL 增白剂细胞染色的水稻原生质体细胞壁变化检测柳琳;陈越;陈玲;李维蛟;程在全【摘要】The rice cells stained with fluorescent whitening agent VBL were observed by fluorescence microscope with 345nm excitation wavelength and 430nm emission wavelength to observe elimination and regeneration of rice cell walls during preparation and culture process of rice protoplasts rapidly and accurately.The blue fluorescence around cells represents distribution equality and intensity fluorescence at early stage,gradually mal-distribution and dim fluorescence,and finally the blue fluorescence disappears, which indicates that cellulose is gradually eliminated by enzymolysis, but the blue fluorescence performance in the protoplast culture process is just the opposite of the protoplast preparation process.In conclusion,the fluorescent whitening agent (VBL)can be used in rapid and accurate detection of rice protoplasts during the preparation and culture process.%为快速、准确地观察水稻原生质体制备及培养过程中水稻细胞壁的去除和再生情况，利用荧光增白剂 VBL 细胞壁染色液对细胞进行染色，制片后置于激发波长为345 nm、发射波长为430 nm 的荧光显微镜下观察。

水稻原生质体分离及转化水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。

溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2?2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。

2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。

水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。

现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。

本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。

一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。

或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。

注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。

制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。

2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。

通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。

质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。

二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。

50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。