植物原生质体的分离及融合
生93沈睿2009012372同组：古梦婷
实验日期：2011年11月2日
一．实验原理
1.原生质体分离
原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和
诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤
1.原生质体的制备
（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
（5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。
（6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。
（7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。
（8）蔗糖漂浮方法：
取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。
用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。
由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。
配平后在700rpm下离心5min。
用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。
2.PEG融和
（1）取一干净、干燥的小平皿，向其中加入一滴原生质体悬液，静置10min。
（2）缓缓加一滴PEG溶液，转动平皿，使其混匀，静置10min，观察原生质体聚集现象。
（3）逐滴滴加高钙高pH值洗液，使其混匀，观察聚集细胞的融合过程。
三．实验结果与分析
1.细胞融合过程
在静置原生质体悬液后，加了一滴PEG溶液，静置后在倒置显微镜下观察（这阶段未进行拍照），只有个别的细胞靠在一起，而且没有融合的迹象。
之后加了一滴高钙高pH值洗液，有较多细胞靠在一起，且在接触面出现融合迹象。
但是并没有发现处在融合中期的细胞，于是又滴加了一滴高钙高pH值洗液，之后观察，看到一些细胞已经完全融合，一些细胞仍处在接触阶段，但还是未观察到处在融合中期的细胞。
之后又加过高钙高pH值洗液，但始终没有观察到融合中期的细胞。
以下展示了一些细胞融合的照片来演示融合的过程。
图1细胞接触图（10×20）
上图在滴过PEG溶液和高钙高pH值洗液后拍摄。
原生质体相互接触，可能是由于细胞在溶液中自由悬浮而相触，也可能是在PEG的作用下靠在一起。
多数原因为后者，因为可以发现图中两个原生质体的接触面已经是平的了，在自然情况下，应以圆弧相切，所以判断有分子间的作用力使细胞膜相贴拢。
图2细胞接触图2（10×20）
进一步地，原生质体的接触面开始变得不如其他部位的膜平整，说明接触面细胞膜已经
起了反应，可能是两个细胞的接触面的磷脂双分子层开始从内部解离并互相结合。
图3细胞融合图（10×20）
图3中的细胞就其大小而言和单个的原生质体差不多，约为55μm，但是很明显可以看出细胞膜上的裂纹（或浅沟），推断它可能是三个较小的原生质体融合而成的一个细胞。
这个细胞已经十分接近完全形态，只要它进一步把细胞膜调整挪动得更为平整即可。
图4细胞融合图2（10×20）
上图为两个正常大小的原生质体融合的结果，虽然接触界面的膜已经消去了大部分，但还是可以看到椭圆体的中间有融合时的痕迹。
它也不是完全体，在膜均匀分布后应该会成为球形。
在追踪原生质体融合的过程时，并没有成功地看到并拍到原生质体融合的过程，可能存在以下几个原因。
其一，可能是滴加的高钙高pH值洗液，从第一滴到第二滴这个跨度已经很大（因为本身滴在平皿上原生质体悬液也只有3-4滴），在这个跃变中，一些相接触的细胞可能失去了活性，而停留在接触的阶段，另一些则在Ca2+的推动下迅速完成融合过程，所以就出现中间阶段没被观测到的结果。
另一个可能原因是我们组悬液中，原生质体含量不是很高（单位体积内个数不多），所以降低了捕捉到原生质体融合中期的概率。
2.实验组与对照组
只加PEG溶液的原生质体悬液中基本观测不到细胞的融合现象，只加高钙高pH值洗液的对照实验漏做了，不过根据理论推断，也观察不到细胞融合。
四．思考题
1.原生质体制备和融合过程中各种试剂的渗透压？
答：酶混合液：接近于等渗，虽然纤维素酶、果胶酶等是溶于蒸馏水配置的，但是加了适当量的甘露醇，所以配成了等渗溶液。
如果不等渗，在经过1h的培养后，细胞应该已死去大半。
洗涤液：等渗，为悬浮细胞的同时保持细胞活性，所以是等渗的。
20%蔗糖溶液：对于植物细胞来说，0.33mol/L的蔗糖溶液是等渗的，相当于11.3%的蔗糖溶液，所以20%的蔗糖溶液是高渗的，会导致细胞脱水。
蔗糖漂浮实验中配平用的水：低渗。
在配平时用水是不得已之举，因为若用等渗的洗涤液配平，就无法使溶液分层了。
PEG溶液和高钙高pH值洗液：配成了等渗或倾向于低渗。
因为这是影响实验的至关重要的一个试剂，如果是高渗，会导致细胞脱水死亡，无法完成细胞融合。
而等渗或适当的低渗可以促进细胞融合，因为细胞融合后，容积会变大，需要从膜外摄入一定量的液体。
2.除细胞融合外，原生质体分离和培养有哪些应用？
答：原生质体的分离和培养还可应用于基础研究如：细胞壁的再生以及各种细胞器在细胞壁再生中的作用；质膜在能量转换，物质转运以及信息传递等方面的作用；病毒侵染机理以及植物与病毒的相互关系。
它还可用于植物生理学研究如：植物生长调节物质的作用、植物代谢及其他生理问题；利用原生质体质膜易碎的特点分离得到大量而完整的细胞核、叶绿体、线粒体和液泡等各种细胞器，从而得到各种细胞器的结构与功能方面比较完善的资料。
五．实验体会
1.关于撕花瓣
一开始听到李老师介绍撕花瓣的窍门（即把镊子伸到维管束下）的时候，没有反应过来维管束是什么，于是在撕花瓣表皮的时候总是不能撕下大片的，很零碎。
后来顿悟，于是把镊子头插到维管束下，顺势一扯就撕下了面积超过1cm2的表皮，但是由于维管束的特殊位置，导致用此法最多撕下4-5片（正面2片，背面2片），所以要想撕到覆盖35mm平皿的一半面积以上，需要小心且耐心地撕。
2.关于红色原生质体
我们小组两人的原生质体悬液，一个做了蔗糖漂浮，另一个没有做。
做蔗糖漂浮的结果并不理想，因为在离心后没有观测到处在上下溶液之间的红色细胞带，可能是因为操作不够快，所以细胞在高渗环境中会胀破。
不过没做蔗糖漂浮的悬液观察的结果，也是缺乏红色原生质体，最后是向其他组的张延庆同学借了一些红色细胞，便于观测。
为什么在我们小组没有成功地得到红色原生质体呢？在第一次离心后，确实可以看到试管底部有红色的原生质体堆积，但在第二次离心、去上清、200μl洗涤液悬浮后却观察不到。
推测可能原因是在第一次去上清后，吹吸堆积物吹得过于猛烈，本就不多的红色原生质体因为破裂而损失殆尽。
六．参考文献
王宏英吴逸常智杰王伟《细胞生物学实验指导》（第二版）清华大学生命科学学院2011年2月。
