下载文档原格式
激光共聚焦显微镜要点解析（一）激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察例如Ca2+，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
一、基本原理和功能1.1 基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
1.2 激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能1）“细胞CT”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
2）三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。
例如:可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。
3）将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。
如细胞内游离Ca2+、pH值及其它细胞内离子的实时测定。
荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
第36卷第6期 2017年12月电子显微学报Journal o! Chinese Electron Microscopy SocietyVol. 36,No. 62017-12文章编号= 1000-6281(2017)06-0577-05激光扫描共聚焦显微镜使用中荧光共定位的一种计算方法胡西学，郭宏博，甘雅玲*(国家纳米科学中心，北京100190)摘要激光扫描共聚焦显微镜在形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域得到广泛地应用，荧光共定位计算是该仪器的一种重要应用功能。
共定位计算的结果为肿瘤治疗过程中药物与肿瘤的作用机理研究提供了依据之一，推动了肿瘤精准定位治疗的发展。
随着科技的进步和科研的深入，人们对共定位的分析结果要求越来越高。
本文提出的激光共聚焦显微镜荧光共定位计算方法，通过3D构建和反卷积，获得了更加真实的荧光共定位计算结果。
关键词激光共聚焦扫描显微镜；荧光共定位计算方法；共定位系数；3D构建；反卷积中图分类号：Q631;Q336 文献标识码：A doi：10. 3969/j. issn. 1000-6281. 2017. 06. 010激光扫描共聚焦显微镜是利用激光作为激发光 源、观察被荧光试剂标记的生物样品的一种光学仪 器。
激光扫描共聚焦显微镜采用激光作为激光光 源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和 装置，利用计算机系统对所观察的对象进行数字化 图像的观察、采集、分析和处理[1]。
此系统不仅可 以使用紫外或可见光激发荧光探针,得到细胞或组 织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察 生理信号及细胞形态的变化[2-9]，而且可以动态追 踪一些具有自发荧光药物在细胞内的实时分布、定 位状态[10_13]，并对药物在细胞内的聚集和定位进行 定量分析，为药物与肿瘤细胞的相互作用机理研究 提供更加直观的理论数据[14—16]。
作者在激光扫描 共聚焦显微镜的使用过程中发现，使用者在对药物 与细胞亚细胞器之间进行共定位计算时，仅在调节 焦面、采集图片后，通过设置荧光通道的阈值，消除 图像的背景噪音;使用软件计算获得计算的对象，如 图1所示（该图通过本文实验方法获得）。
用激光扫描共聚焦显微镜定量检测烟草花粉自发荧光强度何川生;卢秀萍
【期刊名称】《中国烟草科学》
【年(卷),期】1998(019)004
【摘要】应用激光扫描共聚焦显微镜对３个类型共６个烟草材料的花粉自发荧光强度进行了定量检测，发现不同类型及品种之间花粉自发荧光强度存在明显差异，应用ＬＳＣＭ检测烟草花粉自发荧光强度可做为烟草品种鉴别的重要依据。
【总页数】3页(P30-32)
【作者】何川生;卢秀萍
【作者单位】云南省烟草科学研究所;云南省烟草科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S572.023
【相关文献】
1.烟草种子不同成熟时期形态特征的激光扫描共聚焦显微镜观察 [J], 卢秀萍;何川生;孔光辉
2.激光扫描共聚焦显微镜在花粉研究中的应用 [J], 刘振国;华子义
3.用激光扫描共聚焦显微镜观察雪松花粉和花粉管 [J], 李国平;黄群策;秦广雍
4.不同类型烟草花粉自发荧光强度比较研究 [J], 何川生;卢秀萍;许介眉
5.激光扫描共聚焦显微镜对一串红花粉粒的三维重建 [J], 丁亮;沈明山;邵寒娟;陈睦传
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
![荧光共聚焦 激光扫描共聚焦[知识研究]](https://img.taocdn.com/s1/m/d4e7f1995a8102d277a22f2e.png)
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。
1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号, 并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中, 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像, 得到的图像是数字化的, 可以在电脑中进行处理, 再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管, 可以将很微弱的信号放大, 灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合, 是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前, 一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜, 它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合, 如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等, 因此被称为万能显微镜, 通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准在现代科学研究中，激光共聚焦拉曼显微镜（以下简称激光拉曼显微镜）已经成为一种常用的分析工具。
激光拉曼显微镜通过激发样品中的化学键振动，可以获得关于样品成分、结构和性质的信息，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
然而，由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准显得尤为重要。
1. 激光拉曼技术的基本原理激光拉曼技术是一种非破坏性的光谱分析方法，通过使用激光和光谱仪来探测样品的分子振动信息。
当激光与样品相互作用时，部分光子被散射，而其余光子则会发生拉曼散射，从而获得特定频率的振动能级信息。
激光拉曼显微镜结合了共聚焦技术，可以实现光学显微镜和拉曼光谱仪的双重功能，不仅能够获得高分辨率的成像，还可以获得高灵敏度的拉曼光谱信息。
2. 制定激光拉曼显微镜检测标准的重要性由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准变得至关重要。
标准化的检测流程和方法可以保证实验数据的可靠性和准确性，同时也有利于不同实验室和研究机构之间的结果比对和交流。
制定检测标准还可以促进技术的进步和应用的普及，推动激光拉曼技术在不同领域的应用。
3. 激光拉曼显微镜检测标准的制定内容激光拉曼显微镜检测标准应包括样品制备、仪器校准、数据采集和分析等多个方面。
在样品制备方面，应该明确样品的准备方法、存放条件和处理步骤，以确保实验的可重复性和可比性。
仪器校准也是非常重要的环节，需要制定相应的校准方法和标准物质，以保证激光拉曼仪器的准确性和稳定性。
对于数据采集和分析，应该规定数据的采集参数、处理方法和结果解释的标准流程，以确保实验结果的可靠性和准确性。
4. 个人观点和总结在我看来，制定激光拉曼显微镜检测标准是非常必要的，可以保证激光拉曼技术在科研领域的可靠性和准确性。
我认为，在制定标准的过程中，应该充分考虑实际应用的需求和特点，同时也应该借鉴国际标准和先进经验，以期制定出通用、实用和可操作的检测标准。
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准的制定对于推动该技术在不同领域的应用具有重要意义。
荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用可以参照相关参考资料
荧光显微镜是一种放大显微镜，它可以用于观察单个细胞或多个细胞，甚至是单个分子。
它的工作原理是，激发光通过荧光技术和特定的滤色片
将被观察物体的荧光分子特定波长的光波吸收，然后通过精密的放大镜头
进行放大，并通过荧光镜板分别输出激发光和发射光，最后将多波长波段
的发射光通过摄像机捕捉，从而形成的荧光图像。
荧光显微镜的优势之一
是它可以用于检查细胞和其内部的结构，可以检测不同的细胞特性，包括
活性、基因型、蛋白质含量和其他蛋白质表达。
激光扫描共聚焦显微镜是一种表面观察技术，它通过光学系统将多束
激光（称为共聚束）聚合到一个点，从而使能量集中到一个空间仅仅几微
米的点上，引起形成激发光，它可以精确地显示表面的形貌、表面缺陷和
细节。
此外，它还可以在极低的功率下，提供精确的材料成分和表面化学
分析，包括成分的化学结构、光谱以及深度分析，同时还能提供室温下的
探针定量分析。
激光共聚焦显微镜分析技术激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）是一种高分辨率的荧光显微镜技术，可以在细胞和组织水平上观察和研究样本的三维结构和功能。
其原理是利用激光束经过一组物镜后，聚焦于样本的一个点上，再通过探测器收集经过样本的反射或荧光信号，然后通过扫描样本的X、Y和Z轴移动，以获取图像的二维和三维信息。
1.高分辨率：激光共聚焦显微镜使用激光束的聚焦原理，可以获得比传统显微镜更高的分辨率。
它可以减少标记物质的模糊和混叠现象，提供更清晰、更详细的图像。
2.3D成像能力：激光共聚焦显微镜可以获取堆叠图像，从而构建三维结构。
通过扫描样本的Z轴，可以获得不同深度的切片图像，再通过软件进行堆叠和重建，得到三维结构信息。
3.实时观察：激光共聚焦显微镜可以实时观察和记录样本的变化过程。
通过快速的扫描速度和高灵敏度的探测器，可以实现对细胞和组织的实时观察，并捕捉瞬间变化的图像。
4.荧光标记：激光共聚焦显微镜可以应用于荧光标记技术，通过使用特定的荧光染料或标记抗体，可以观察和定位特定蛋白质、细胞器和细胞分子的位置和表达水平。
激光共聚焦显微镜分析技术广泛应用于细胞生物学、生物医学研究、药物发现、神经科学等领域。
它可以提供高分辨率的图像和三维结构信息，帮助研究人员深入理解生物学过程和细胞功能。
以下是几个应用激光共聚焦显微镜的案例：1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以观察和分析细胞和组织的形态、结构和功能。
它可以用于观察细胞分裂、细胞移动、细胞器的定位和交互作用等细胞过程的研究。
2.荧光探针研究：激光共聚焦显微镜可以与特定的荧光染料或标记抗体结合使用，用于研究特定蛋白质或细胞分子的位置和表达水平。
通过荧光标记技术，可以观察和定位蛋白质在细胞内的位置和亚细胞结构。
3.三维结构重建：激光共聚焦显微镜可以通过扫描样本的Z轴，获得不同深度的切片图像，并通过软件进行三维堆叠和重建。
激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件研究[ 05-12-18 15:01:00 ] 作者：YuNanshen 编辑：studa9ngns【摘要】目的本文对应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光强度的测定条件做了详细的分析。
方法选择和设置激光扫描共聚焦显微镜的各参数，对用间接免疫荧光法检测改性后的材料表面对人牙龈成纤维细胞分泌细胞外基质纤粘连蛋白FN和I型胶原的影响进行荧光强度的定量。
结果细胞在材料表面接种后FN的荧光染色强度在四组材料之间差异无显著性，说明材料表面化学成分的改变对FN的形成没有明显影响。
但四组材料对I型胶原分泌的影响有差异。
结论选择和设置适合的激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件，可以真实有效的反映实验的结果。
关键词激光扫描共聚焦显微镜荧光强度The research on determine condition of fluorescenceintensity in confocal laser scanning microscopy【Abstract】 Objective To explore the conditions under which fluorescence intensity is determined in confocal laser scanning microscopy.Methods The parameters of confocal laser scanning microscopy were set and the effects of these modifications on the response of the fibro-conglutination albumen and type I collagen of human gingival fibrobˉlasts on indirect immunityfluorescence were observed，and the fluorescence intensity of the effects was measured.Reˉsults After the cells grafted on the material surface，the fluorescence dye intensity of the fibro-conglutination albuˉmen had no notable differ ence in materials of the four groups，the alter of the chemistry component of the material surˉface had no notable influence on the formation of the fibro-conglutination albumen.But the effects of the type I collaˉgen were different in materials of the four groups.Conclusion Setting appropriate conditions for the determination of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy is important in the analysis of the true results of experiˉment.Key words confocal laser scanning microscopy fluorescence intensity激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning miˉcroscopy，CLSM）是20世纪80年代发展起来的目前世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器。
它是在荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置，使用紫外或可见激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，较传统显微镜有着不可比拟的优越性［1］，已广泛应用于分子细胞生物学、生理学、病理学、免疫学、药理学、遗传学等领域，成为这些领域新一代强有力的研究工具，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性。
1 材料与方法1.1 实验用样品分四组。
Ti组:未涂层的对照组;HA组:应用离子束辅助沉积技术在种植体表面沉积羟基磷灰石HA涂层;TCP/HA组:应用离子束辅助沉积技术在种植体表面沉积磷酸三钙/羟基磷灰石TCP/HA复合涂层;RGD组:应用化学方法在纯钛表面共价接枝生物活性肽RGD（Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸）。
样品规格:直径10mm，厚2mm的圆盘形，表面粗糙度Ra值均为0.1μm。
1.2 实验步骤（1）接种到材料表面的细胞分别培养3、24和48h后，PBS 轻轻冲洗3次。
（2）4%福尔马林固定10min，PBS冲洗。
（3）0.1%（V/V）Triton X-100渗透5min，PBS冲洗。
（4）1%的羊血清阻断20min。
（5）分别用下列抗体37℃孵育1h:①兔抗人FN多克隆抗体（1:30稀释，Sigma）;②兔抗人I型胶原多克隆抗体（1:30稀释，Sigma），PBS冲洗3次。
对照组一抗用无荧光的兔血清。
（6）用TRITC标记的羊抗兔IgG（1:30稀释，Sigma）37℃孵育1h，PBS冲洗3次。
（7）激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS-NT，Germany）取图，每个试样随机选择30个细胞测量细胞荧光强度。
取图条件:①激发光波长:567nm，②扫描方式:xyz，③物镜:40倍干镜（NA为0.75），④激光功率:（20±2）mw，⑤扫描强度:50%，⑥光电倍增管的增益（PMT）:852，⑦探测针孔:2.02，⑧扫描次数:4。
1.3 统计学方法实验结果用SPSS10.0for Windows软件包处理，单因素方差统计分析，P<0.05时具有统计学差异。
2 结果2.1 细胞外基质FN的形成四种材料表面细胞的胞浆内都可见到红色的FN 荧光染色。
在细胞核的周围染色较深，有较强的荧光强度，细胞胞浆的四周荧光强度逐渐降低。
说明FN产生的部位位于细胞浆内，其形成量在核周较多，而胞浆的外围逐渐减少。
定量对比四种材料表面细胞FN的生成量，显示在检测的各个阶段差异无统计学意义（P>0.05）（见表1）。
表1 材料表面细胞FN生成量的荧光强度比较（略）注:所有结果组间比较，P>0.052.2 I型胶原的形成在细胞接种后3h，钛和RGD表面的细胞几乎没有I型胶原的分泌;TCP/HA表面可见红色较强的I型胶原荧光染色区，分布在细胞的胞浆内，细胞核无染色;HA材料表面也可见红色荧光阳性染色区，但没有TCP/HA的染色重。
荧光强度比较结果显示，HA和TCP/HA组的荧光强度比Ti和RGD组的大，差异有统计学意义;TCP/HA比HA表面的荧光强度大，差异有统计学意义（P<0.05）;Ti和RGD组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
细胞培养至24h，可见四种材料表面都有红色的I型胶原阳性染色，分布在细胞核周围的胞浆内。
定量比较四组间的细胞分泌I型胶原的荧光强度，显示TCP/HA 组比Ti组高，差异有统计学意义（P<0.05），其他各组间差异无统计学意义（P>0.05）。
随着培养时间的延长，各组材料表面细胞分泌的I型胶原含量逐渐增加，至48h，各种材料之间I型胶原的荧光染色强度差异无统计学意义（P>0.05）。
见表2。
表2 三组材料表面细胞I型胶原生成量的荧光强度比较（略）注: ˇ 为同Ti组相比，P<0.05，ˇˇ 为同Ti组相比，P<0.01; △ 为同HA组相比，P<0.05; ## 为与RGD相比，P<0.013 讨论3.1 激光扫描共聚焦显微镜的原理及功能激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源，对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的。
焦平面的点同时聚焦于照明针孔和探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通荧光显微镜图像模糊的缺点。
另外在显微镜的载物台上加一个微量步进马达，可使载物台沿着Z轴上下移动，将样品各个层面移到照明针孔和探测针孔的共焦面上，样品的不同层面的图像都能清楚地显示，成为连续的光切图像，实现了“光学切片”（Optical sectioning）的目的。
激光扫描共焦显微镜的功能主要分为两大类，即图像静态采集和动态扫描。
其中图像静态采集又可分为多荧光探针标记样品的图像采集，无损伤连续光学切片图像的采集，即“细胞CT”，三维图像重建，荧光强度定量分析。
图像的动态扫描功能可分为xyt、xyzt和xt扫描，即观察细胞内离子动态变化，荧光漂白恢复（FRAP），荧光能量共振转移（FRER）等。
其中荧光强度的定量是一项非常重要的功能。
3.2 荧光强度的定量在生物医学中的作用由于多数荧光探针对被标记物的标记均为特异性标记，即荧光探针的亮度即荧光强度可以反映被标记物相对含量的多少。
因此利用这一功能可以对单个细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、 DNA、RNA和受体分子含量、成份进行定量测定。
还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。
此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的定量信息。
由于荧光强度的定量在生物医学中起着如此重要的作用，因此对进行荧光强度定量的样品测试就有非常严格的要求。
进行荧光强度定量的样品测试条件如下。
3.3 对样品制备的要求一个好的开端是成功的一半，样品制备的好坏更是荧光定量的关键之一。
对要求进行荧光强度定量的样品，如来源为组织，应采用冰冻切片，可以减少非特异性的荧光信号。
如来源为培养的细胞，为了不将细胞压扁，盖玻片与载片之间用甘油与PBS混合液（9:1）封片。
甘油还具有抗荧光淬灭的作用。
为防止仪器在设定取图条件时对样品产生的荧光淬灭发生，在样本制备时，最好做好各样品的平行样。
3.4 仪器各参数的选择及要求进行荧光强度定量的样品，在图像获取时，要求各样品的取图参数值保持一致。
具体相关参数如下。
3.4.1 物镜（Objective）物镜是成像质量关键要素之一。
荧光进入物镜的通透量的多少与物镜的光透射率有关，而物镜的光透射率与数值孔径（NA）的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此应尽量选择高数值孔径的物镜，即通常应选择油镜或水镜。
