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酿酒酵母及其代谢途径的研究进展随着人们生活水平的提高，酒成为人们聚会、社交的重要工具，而酿酒酵母则是酒的重要原料之一。
酿酒酵母作为一个微生物，它的代谢途径、基因调控以及发酵机制一直是研究者们的关注点。
本文将对近年来酿酒酵母及其代谢途径的研究进展进行探讨。
1. 酿酒酵母的功能及分类酿酒中常用的酵母分为酿酒酵母和物理酵母。
国际上通行的分类标准认为，酿酒酵母主要分为两类：Saccharomyces cerevisiae和Saccharomyces bayanus。
其中，Saccharomyces cerevisiae是最早被人们利用的酿酒酵母之一，其主要生长温度为16-20℃，被广泛应用于葡萄酒、啤酒、米酒以及烧酒等多个领域；Saccharomyces bayanus则生长温度较低，一般在8-14℃之间，常被应用于白酒等特殊领域。
除了被广泛应用于酒精行业外，酿酒酵母还有其他许多应用。
例如，在医药、食品、原料化学等领域，酵母的代谢途径和基因调控也得到了较广泛的研究。
在医药领域，酿酒酵母的代谢途径被应用于抗癌药物的研究；在食品领域，酿酒酵母的代谢途径则可以用来制造高值化合物的食品添加剂；在原料化学领域，酿酒酵母可以被用来代替化学试剂制造生物合成产品。
2. 酿酒酵母代谢途径的研究进展2.1 糖代谢途径酿酒酵母的代谢途径中糖代谢途径一直是研究者们关注的焦点之一。
传统的观点认为，糖代谢途径主要由葡萄糖进入酵母细胞，随后进入糖酵解途径或糖异生途径，最终产生能量和酒精。
近年来，随着基因测序技术以及代谢组学技术的发展，人们对酿酒酵母的糖代谢途径有了更深层次的认识。
例如，人们通过对酿酒过程中的代谢物进行分析，发现丙酮酸和二氧化碳等代谢产物的产生与酵母产生的酒精的量密切相关，这提示酿酒酵母的糖代谢途径与其酒精产生的机制有关。
此外，一些研究发现，酵母在不同的培养环境下糖代谢途径的表现也有所不同。
例如，在氧气充足的环境下，酵母可以将葡萄糖转化为生命活动所需的原料，产生的乳酸可以被用来维持酸碱平衡；而在氧气不足的情况下，酵母会将葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳，以产生能量。
酿酒酵母的选育及其应用研究进展0前言酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae ）一直作为面包和馒头以及酿造葡萄酒和啤酒等产品的发酵菌株.随着石油资源的日益枯竭以及环境的持续恶化，能源和环境问题成为了全球关注的焦点.为了缓解能源危机给经济和环境带来的影响，各国一方面提高能源的利用率，另一方面大力开发新型能源.由于生物能源具有绿色性和可再生性，因此成为研究的热点与重点.研究发现[1]，通过酿酒酵母发酵代谢生产乙醇，然后将乙醇进一步脱水后再加上适量的变性剂就可获得变性燃料乙醇.因此，利用酿酒酵母发酵技术将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇，已成为解决世界能源危机和开发生物能源的重要手段.燃料乙醇俗称酒精，是国民经济中十分重要的工业产品，用途十分广泛，如在食品行业用于配制各类白酒、果酒、药酒等；在化工行业用于合成化工产品（橡胶、苯胺、乙二醇等）；在燃料方面用于替代日益匮乏的石油资源，可有效减少环境污染，市场前景广阔；在医药工业用于提取医药制剂和作为消毒剂；染料生产、国防工业等也需要大量酒精；同时酿酒酵母中还含多种生理活性物质和营养成分，可用于食品和动物饲料的添加剂，不仅能提高其营养价值，而且还具有医疗保健功能，治疗机体因消化不良或维生素缺乏而引起的一些疾病.此外，酿酒酵母与动、植物同为真核生物，具有很多相同的细胞结构，并且具有生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特点，在生命科学研究中被用作真核生物研究的模式生物.选育出优良的酿酒酵母菌种不仅能提高产品的产量和质量、降低生产成本、增加企业的利润和市场竞争力，还能缓解能源危机、减轻环境污染.因此，对酿酒酵母进行研发与利用具有重要的经济价值和科研意义.人们急切盼望获得具有多种优良特性的酿酒酵母菌株，尤其是转化乙醇能力强的酿酒酵母，其研究意义十分深远.1酿酒酵母研究进展酿酒酵母是人类使用较早的微生物之一，广泛用于食品和医药等领域.酿酒酵母是单细胞生物，同时也是一种典型的真核细胞模型和重要的模式生物，其生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特性使酿酒酵母更方便于进行基因工程和遗传学研究.酿酒酵母作为传统的乙醇代谢菌株，具有耗糖快、遗传背景清晰、发酵工艺成熟和体内重组能力高效等特点，因此是生物质能源发酵的首选菌株.酿酒酵母全基因组测序早在1996年已完酿酒酵母的选育及其应用研究进展王卫国，张仟伟，赵永亮，李瑞静，林强，李晓丹，陶宜辰，王卫（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）摘要：酿酒酵母中含有蛋白质、氨基酸、维生素、可食纤维以及微量元素等多种生理活性物质和营养成分，具有营养、保健和医疗等功能.此外，酿酒酵母还是酒精酿造的主要菌种，而酒精又是食品、医药、化工、燃料等工业的主要原料，因此，酿酒酵母在酿造、食品、医药保健、饲料、能源化工、环境保护和生命科学研究等领域中应用广泛，是一种十分重要的工业微生物资源.但由于目前很多企业缺少优良的酿酒酵母菌株，导致发酵的产品成本高、质量差.因此选育出具有多种优良特性的酿酒酵母具有巨大的经济价值和研究意义.综述了酿酒酵母菌种的筛选、育种及鉴定方法和目前的研究应用概况.关键词：酿酒酵母；菌种选育；菌种鉴定；应用概况中图分类号：TS201.3文献标志码：A河南工业大学学报（自然科学版）Journal of Henan University of Technology （Natural Science Edition ）第36卷第6期2015年12月Vol.36，No.6Dec.2015收稿日期：2015-06-18基金项目：河南省产学研合作项目（132107000061）作者简介：王卫国（1962-），男，河南汝州人，教授，研究方向为生物工程与生物制药.文章编号：1673-2383（2015）06-0104-09网络出版网址：/doc/b615913606.html,/kcms/detail/41.1378.N. 20151223.1630.038.html 网络出版时间：2015-12-2316:30:32 DOI:10.16433//doc/b615913606.html,ki.iss n1673-2383.2015.06.019第６期王卫国，等：酿酒酵母的选育及其应用研究进展成，是第一个完成基因组测序的真核生物.它包含16条染色体，全长为12068kb.编码专一性蛋白质的ORF（开放阅读框）有5885个，平均每个长度约为1450bp，只有极少数长度超过4500bp，最长的ORF约为14730bp，位于Ⅻ号染色体上，其功能尚不清楚[2].另外，酿酒酵母基因组的测序显示：其基因重组频繁地发生在高GC含量区.随着酿酒酵母全基因组测序的完成，对其基因的功能分析进入了一个新的阶段，相应的各种研究技术也随之迅速发展起来，如酿酒酵母表达系统的建立、酿酒酵母基因敲除技术、酿酒酵母基因定位技术、酿酒酵母双杂交技术、酿酒酵母功能基因芯片技术等，为研究酿酒酵母体内代谢合成乙醇机制以及分子传导通路等提供了便捷、高效的技术手段.但采用酿酒酵母菌株发酵也存在一些问题，如酒精耐受性低、不耐高温等.我国农产品资源丰富，但是利用率很低，如何提高生物能源乙醇的产率是当前亟需解决的问题.目前世界上90%的乙醇是通过酿酒酵母发酵生产的[3]，因此构建高转化率乙醇发酵菌株是燃料乙醇生产的重中之重.利用基因工程或代谢工程手段修饰或阻断酿酒酵母副产物的合成，提高乙醇产率是构建工程菌的主要策略.目前，酿酒酵母相关研究的主要方向是：⑴优良菌株的选育.工业上乙醇发酵的主要菌株是酿酒酵母，选育出发酵性能强、繁殖速度快、耐高浓度乙醇、适应性强的菌株是研究的主要方向.⑵发酵工艺优化.⑶基因工程菌的构建，通过生物工程技术选育和构建大量耐高温、耐乙醇等适应性强、高乙醇产量的菌株，如敲除酿酒酵母副产物代谢关键基因，促进乙醇的合成.酿酒酵母菌种质量的好坏对发酵工业的影响巨大，如何获得耐高渗透压且酒精发酵速率快、耐酒精和耐高温等特性的酵母菌种是目前研究热点.2酿酒酵母的选育酿酒酵母的选育包括筛选和育种两个部分.酿酒酵母菌株的筛选主要是通过杜氏管发酵试验，在高酒精度、渗透压、二氧化硫以及低温等条件下，根据产气量的多少和快慢来对酿酒酵母的耐酒精性、耐渗透压性、耐二氧化硫性、耐低温性等几个重要指标进行评价，从而对酿酒酵母进行特定筛选.随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，酿酒酵母的育种方法也在不断更新，自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程育种都是目前常用的育种手段，但各有利弊.在菌种的选育时需要多种不同的育种方法配合使用，才能达到理想的效果[4-7].2.1自然选育自然环境中存在多种低剂量的诱变物质，如宇宙射线和各种短波辐射等，可使野生酿酒酵母菌株发生低频率的基因突变.在不经过人工处理的情况下直接对酿酒酵母菌群进行筛选的育种方法叫做自然选育.Li等[8]从葡萄汁样品中分离出32株酿酒酵母，分别对其发酵特性进行评价，结果显示其中一株命名为MMf9的野生酿酒酵母不仅发酵速率快、产甘油快，而且对高温、乙醇、渗透压、pH耐受性好.由此看来，自然界中确实存在着优良酿酒酵母的野生菌株，通过人工的分离和筛选，有可能获得具有优良性状的野生酿酒酵母菌株.自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的.但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，从自然界直接筛选的野生酿酒酵母，很难具有理想的特性.然而，近年来为了获得安全、无外源遗传损伤且有地域风格的菌株，很多国家开始重新重视自然选育.2.2诱变育种诱变育种是指用物理、化学诱变剂和生物诱变剂作用于酿酒酵母细胞，使其基因的突变率大大提高，然后筛选出符合人们特定需求的优良酿酒酵母菌株，进而培育出新品种的育种方法.根据诱变方式的不同可分为3种[9-11]：物理诱变、化学诱变和航天诱变.2.2.1物理诱变紫外线、微波、超声波以及能引起电离辐射的射线或快中子等物理诱变因素都会增大酿酒酵母菌株DNA的碱基发生错配率，从而提高酿酒酵母的基因突变率.Son等[12]对一株啤酒酵母进行紫外线诱变筛选抗老化能力的菌株，筛选获得一株A27菌株，其发酵能力比诱变前提高了15.8%.Bourens 等[13]以絮凝性弱而其他发酵指标皆可的啤酒酵母菌为出发菌株，以激光-氯化锂为复合诱变剂诱变啤酒酵母得到一株絮凝性适中的啤酒酵母，絮凝性为37.9%，比原菌株提高了1.61倍.物理诱变具有操作简单、高效、无污染、变异率高和易推广等优点.但有些物理诱变方法如高压、超声波和高能离子束以及X射线等方法虽诱变效果很好，但电离性和穿透力都很强，如果不是专业的技术人员在相应的设备中操作，危险性较大.2.2.2化学诱变用化学诱变剂处理酿酒酵母，从而使酿酒酵母的基因突变率大幅提高，然后根据育种目标培育出新品种.Theis等[14]以啤酒酵母X为出发菌105第３６卷河南工业大学学报（自然科学版）株，用亚硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）连续诱变，通过初筛及复筛，得到一株产蛋白酶A活力低的啤酒酵母突变株GM235.与出发菌株X相比，GM235发酵的啤酒正丙醇含量高于出发菌株，蛋白酶A活力降低了19.83%，异戊醇和总高级醇分别降低了5.03%和4.87%.化学诱变育种是一种经济方便的育种方法，并且不同化学诱变剂对染色体、基因等的诱变还具有专一性.但是化学诱变剂大多是致癌物质，使用者必须做好防护措施.2.2.3航天诱变航天诱变育种是指利用高空气球或往返式航天器等能达到的空间环境对酿酒酵母的诱变作用而进行育种的方法.Vigentini等[15]对经航天诱变的啤酒酵母菌进行复壮，并对复壮后的酵母菌株从细胞大小、菌落形态、发酵力以及增殖情况等几方面进行了筛选.试验结果表明，诱变后菌株的发酵力、生长速度均优于出发菌株.航天诱变育种是集航天、生物、育种等技术为一身的尖端育种方法，具有育种周期短、突变率高、安全无污染等优点. 2.3原生质体融合育种原生质体融合是指将两个不同的酿酒酵母细胞通过酶解脱壁，在高渗条件下形成球形原生质体，然后由聚乙二醇（PEG）促融.原生质融合育种是利用两株酿酒酵母细胞质间相互融合时两套基因组会发生接触与交换，导致基因组间进行遗传重组，从而获得融合了两亲本优良性状的新酿酒酵母菌株的一种育种方法.Stanley等[16]将生产用的两种啤酒酵母分别进行单倍体化，再利用PEG 进行融合.经试验证明融合子是一株口味独特、发酵度高、絮凝性强、遗传性能稳定的啤酒酵母新菌株.Clemente等[17]用F-20-7与酒类酒球菌SD-2a 进行融合，获得的融合子降解苹果酸的能力高达85%，比已有报道的最高降酸率高出7%，与酒球菌的降酸能力不相上下.由此可知，原生质体融合育种可使基因重组的频率大幅提高.此外，原生质体融合育种还克服了远缘杂交不亲和等难题.2.4杂交育种杂交育种是指将具有不同优良性状的酿酒酵母个体间进行杂交，使控制优良性状的遗传物质进行重新组合，然后在其杂种后代中分离挑选出具有双亲优良性状纯合子的育种方法.Pawel等[18]用选自乳清的酿酒酵母与葡萄汁酵母为亲本进行杂交，获得的杂合子同时具有分解苹果酸能力强和生成乙酸能力弱的特点，其降酸能力提高了20%左右.Kapsopoulou等[19]曾将一株絮凝性强酵母与一株不产SO2的酵母杂交获得了一株絮凝性比较强且不产SO2的酵母，并用于生产中.杂交育种不仅扩展了变异范围，而且克服了酿酒酵母菌株在经历长期诱变剂处理后造成的菌株生长活力降低、生长周期变长、孢子量锐减、代谢缓慢、产量和性状难以继续提高等缺陷，并且杂种后代的生活能力、适应性和抗逆性都很强.但杂交育种还存在着不易产生新的基因且操作方法复杂、对技术和设备要求高、优良性状的分离和育种的周期长等不足.2.5基因工程育种基因工程不仅能改变原有的基因，甚至能创造新的物种.基因工程在微生物育种方面的技术目前已经相当成熟[20-24].基因工程就是在分子水平上将具有某种优良性状的外源目的基因（遗传物质片段）在体外经限制性内切酶与连接酶的“剪接”作用后，再与特定载体构成重组分子，然后插入酿酒酵母菌基因的特定位置中，并使这个目的基因能在酿酒酵母细胞内进行稳定的复制、转录、翻译和表达的一种育种技术.Caruso等[25]从S. cerevisae和S.nvarum品系中克隆编码乙醇乙酰转移酶的基因，转导至酵母细胞中，乙醇乙酰转移酶表现出高活性，提高了啤酒中乙酸戊乙酯和乙酸乙酯等产香气物质的生成，啤酒的香味更强烈.基因工程育种最大的优点是不受种属限制、可按照人们的需要对菌种进行定向改造.但是，基因工程育种对技术要求高，且外源基因的表达可能影响酿酒酵母的酿造特性，还有可能引起生态危机.2.6代谢工程育种代谢工程是指通过基因工程的手段改变酿酒酵母细胞的代谢途径[26].利用代谢工程方法对酿酒酵母进行改造育种时，首先要分别从酿酒酵母细胞的基因、RNA、蛋白质、代谢物、代谢通量等多个层次对酿酒酵母的代谢流量及代谢控制进行定量且系统的分析，寻找出最佳的代谢途径，然后再利用DNA重组技术和相关遗传学手段对酿酒酵母的细胞进行遗传修饰，例如改变酿酒酵母基因的结构、删除不良基因或加入新的优良基因等，从而合理设计出细胞的代谢途径.Hontz等[27]利用构建酵母菌-大肠杆菌穿梭质粒，将柄状毕赤酵母依赖木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因导入酿酒酵母菌体内，获得的转化子能同时有效的将木糖和葡萄糖转化为乙醇.代谢工程育种能扩展代谢途径、重新分配代谢流、转移或构建新的代谢途径，从而改变酵母菌种的底物利用，提高生产可操作性，减少有害副产物产生.106第６期3酿酒酵母的鉴定方法3.1传统鉴定传统的酿酒酵母的分类鉴定主要根据细胞繁殖类型，产孢子状况，菌落的颜色、大小和形态等，以及生理生化试验，再参照《酵母菌的特征和鉴定手册》和《微生物分类学》，进行相关菌种的鉴定.传统鉴定不仅工作量大、周期长、操作复杂且鉴定结果的重复性差[28-30].3.2现代分子鉴定现代分子鉴定法主要以核酸作为研究对象，研究的是基因型，而非表现型，因此能反映其遗传本质[31-33].现代分子鉴定法具有稳定性好、易确定同源关系、便于计算机分析等优点，不仅提高了鉴定的准确度，而且缩短了鉴定时间.近年来，随着分子生物学的高速发展，兴起了很多新的酿酒酵母鉴定方法，接下来对几种常见的酿酒酵母现代分子鉴定方法进行简单介绍.3.2.1DNA同源性分析不同酿酒酵母菌株之间的亲缘关系越远，那么它们之间共有的相同核苷酸序列就越少.研究表明[34]，同源率在70%以上代表同一种，同源率在40%～70%之间的代表同一种内亲缘关系比较远的菌株，在40%以下则被认为代表不同的种.采用分子杂交的方法就可以找到两株酿酒酵母之间的DNA同源序列，进而可知道同源百分率的高低. DNA 同源性分析方法不仅可以区分不同的酵母菌种，而且还能区分酿酒酵母种内不同菌株的亲缘关系远近.3.2.2脉冲电场凝胶电泳核型分析酿酒酵母的核型是指染色体的条数及大小，核型间接地反映了酿酒酵母所含有的遗传物质的多少及其组织形态，且会随物种的分化而变化[35-37].脉冲凝胶电泳核型分析是利用琼脂糖凝胶电泳可在凝胶中分离出完整的酿酒酵母染色体DNA，之后便可测定酿酒酵母细胞染色体条数及每条染色体DNA分子的大小.Andrea等[38]通过脉冲电场凝胶电泳分析并发现，在电泳核型上，酿酒酵母、贝酵母和巴氏酵母与少孢酵母具有很显著的差异.此方法是一种快捷、方便、有效的辅助手段.但在进行分类鉴定时必须以形态、生理、生化等指标为基础.3.2.3核糖体DNA序列分析酿酒酵母的核糖体RNA中包括26S、18S、5.8S 和5S4种不同沉降系数的核糖体RNA片段，其对应的基因片段在遗传上既相对稳定性又有一定的突变性.大亚基上的26S rDNA分子可分为D1、D2、…、D12等多个区域，但D1/D2区域序列的长度适中，适于酿酒酵母的鉴定.此外，酿酒酵母的ITS基因具有进化速度快、多态性等特点，适合亲缘关系较近菌株间的鉴定[39-42].Escot等[43]从酿酒葡萄产区采集了99份葡萄果粒利用菌落特征、细胞形态、生理生化特征结合26S rDNA D1/D2序列进行鉴定，成功将菌株鉴定.Romano等[44]通过26S rDNA D1/D2区域分析的方法，分析鉴定了自甘肃莫高葡萄酒厂分离的29株非酿酒酵母菌.核糖体DNA序列分析法在酿酒酵母菌种分类鉴定中效果很好.3.2.4PCR-RFLPDNA限制性内切酶作用片段多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）是指每种DNA限制性内切酶都有特定的作用位点，酿酒酵母5.8S rRNA基因及两侧的转录间隔区（ITS）具有显著的种间差异性，将PCR扩增的基因组DNA用特定的限制性内切酶酶解后电泳分离可获得高度多态性的图谱，通过与模式菌株的图谱比较从而对菌株进行鉴定.Patel等[45]用5.8S-ITS 区域的PCR-RFLP方法结合ITS序列分析，得到东北山葡萄酒发酵酵母的19种酶切图谱，进行的分子鉴定的结果与已知的酵母种类完全一致.由此说明此方法鉴定结果准确、简便、快捷.除上述几种方法外，DNA G+C摩尔百分含量分析、等位酶分析、线粒体DNA限制性酶切分析、DNA微卫星分析、DNA的RAPD分析、巢式PCR 扩增、rDNA序列分析、可溶性蛋白酶分析、显微傅里叶变换红外光谱分析等[46-49]也是酿酒酵母现代分子鉴定的常用方法.4酿酒酵母的应用概况酿酒酵母虽然形态简单但其代谢产物多、生理结构复杂且富含多种生理活性物质和营养成分，在酿造、医药保健、饲料、能源化工以及生命科学研究等领域中广泛应用.4.1酿酒酵母在酿酒工业中的应用由于酿酒产业是我国的支柱产业之一，因此酿酒酵母在国民经济中有着举足轻重的作用[50].酿酒酵母所酿酒的种类繁多，如白酒、啤酒、黄酒和果酒等，并且形成了各种类型的名酒，如贵州茅台酒、绍兴黄酒、青岛啤酒和张裕解百纳等.一般来说，酒的品种不同，所用的酿酒酵母以及酿造的工艺也不同.但就算是同一类型的酒，不同的地区也有独特的酿造工艺和不同的风味[51].王卫国，等：酿酒酵母的选育及其应用研究进展107第３６卷河南工业大学学报（自然科学版）4.2酿酒酵母在医疗保健中的应用我国古代就有用酿酒酵母来治疗疾病的记载[52]，中医将其称为“神曲”.现代医药上将酿酒酵母制成酵母片，即市售的食母生片，可用于提高新陈代谢机能，治疗消化不良症、肝脏疾病和药物中毒以及白血球减少症和肝炎等疾病.另外，酿酒酵母还可作为一些微量元素的载体，如在酵母培养过程中，添加硒可用于治疗克山病、大骨节病和防止细胞衰老，添加铬的酿酒酵母可用于治疗糖尿病等.在医药生产中，可从酿酒酵母细胞中提取凝血脂、麦甾醇（纤维素的前体）、卵磷脂、核酸、核苷酸、多糖、氨基酸、谷胱甘肽和核苷类药物等多种生化药物[53].此外，利用现代分子生物学技术可以制备相应的基因重组酵母育苗，为攻克及预防相关疾病提供试验支撑.4.3酿酒酵母在饲料生产中的应用酿酒酵母蛋白质含量高达50%以上，在畜牧业中一直作为单细胞蛋白的主要来源而被广泛使用.单细胞蛋白是从含蛋白的微生物中提取的蛋白质，具有促进动物的生长发育、缩短饲养期、增加肉量和蛋量、改善肉质和提高瘦肉率、改善皮毛的光泽度和增强幼禽的抗病能力的作用.此外，酿酒酵母还存在于动物肠道中，不仅可以提高反刍动物对饲料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白等有机物和磷酸的消化率，增强机体的免疫力，还能提高饲料中矿物质利用率，有助于动物充分利用饲料中的养分.随着家畜摄入酿酒酵母量的增加，酿酒酵母会在家畜的肠胃道上大量繁殖，可有效改善家畜肠胃的菌群结构，增强家畜的免疫力和抗病力.4.4酿酒酵母在能源化工中的应用酿酒酵母在能源化工中主要用于生产酒精，酒精除了可作为“绿色”燃料外还是许多化工行业中不可缺少的基础原料和溶剂，如合成橡胶、聚丙乙烯、乙二醇、冰醋酸、苯胺、聚氯乙烯、乙醚、脂类、环氧乙烷和乙基苯等化工产品.另外，酒精还是香料、染料、油漆、树脂等工业生产部门必不可少的有机溶剂，还可作为珠宝、钟表等的洗涤剂.酒精也是生产和加工油漆和化妆产品中不可缺少的溶剂.我国农副产品资源丰富，把农副产品用于工业酒精生产也是农产品深加工和保护环境的一条有效途径[54].4.5酿酒酵母在生命科学研究中的应用酿酒酵母与动、植物同为真核生物，且全基因组比较小、遗传背景相对清楚，因此被广泛作为真核模式生物[55].通过对酿酒酵母基因进行连锁分析、定位克隆和测序验证等一系列检测后就可获得与人类某些疾病相关的基因序列，使构建精细的遗传图谱成为可能，可大大提高人类基因遗传性疾病（如糖尿病、小肠癌等）的诊断和治疗水平.酿酒酵母作为真核生物的模式菌株，与分子生物学技术结合后会使人类对真核生物的功能基因组信息、生物信息学、蛋白组学、DNA芯片、基因敲除、药物基因等方面的研究更加深入，同时还有助于菌株的改良.5存在的问题和解决办法5.1存在的问题目前酿酒酵母在选育和研究应用中还存在以下问题：⑴酿酒酵母各种耐受性的机理还不清楚，有关耐低温、耐酒精、耐高渗等的研究很多，虽然在应用研究上，通过添加培养基成分、改变培养条件以及菌种选育等方式已使酿酒酵母各种耐受性大大提高，但耐受性的机理还不清楚.⑵研究和应用还局限于传统领域，还需扩展.⑶缺少酿酒酵母在工业生产中不同胁迫因素之间相互影响的研究，酿酒酵母在工业生产中除了受乙醇的毒性影响外，还受到高温、高渗透压等胁迫因素的影响，目前的研究大都是单一胁迫因素对乙醇发酵性能的影响，很少研究各胁迫因素之间的联系.⑷已取得研究成果未能在生产中应用，例如啤酒废酵母对重金属的生物吸附应用没能在实际生产生活中大规模。
酿酒酵母的酒精代谢途径的研究及其在酿酒中的应用酿酒是人类发明的一项历史悠久且具有深厚文化背景的技艺。
在酿酒过程中，酵母起到了至关重要的作用。
酿酒酵母通过代谢葡萄糖生成乙醇和二氧化碳，从而实现了葡萄酒、啤酒等饮料的制作。
酿酒酵母的酒精代谢途径研究对于提高酒的品质、改善酿酒过程、保障酿酒质量具有重要作用。
本文将从酿酒酵母的酒精代谢途径、代谢调控机制和在酿酒中的应用三个方面分别进行讨论。
一、酿酒酵母的酒精代谢途径酿酒酵母的酒精代谢途径一般被分为两条途径：Embden-Meyerhof-Parnas途径和Pentose-Phosphate Pathway途径。
在Embden-Meyerhof-Parnas途径中，葡萄糖被磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，并在一系列酶催化下生成丙酮酸、乳酸和乙醇等代谢产物。
而在Pentose-Phosphate Pathway途径中，酵母通过氧化葡萄糖酸生成NADPH和核糖酸，从而支持细胞内的生物合成反应。
二、酿酒酵母酒精代谢调控机制在酵母的酒精代谢途径中，有许多重要的调节机制可以控制代谢途径，从而使代谢途径更加适应不同的环境条件。
其中包括以下几个方面：1. 糖分信号通路：糖分信号通路是酵母细胞感应环境中糖分浓度的机制。
当酵母细胞感应到较高的糖浓度时，会抑制代谢酒精途径，从而使酵母细胞将能量用于细胞生长和分裂。
2. 能量信号通路：能量信号通路是酵母细胞对ATP/ADP比率的响应机制。
当细胞内ATP/ADP比率较低时，会激活腺苷酸脱酸酶和腺苷酸酰化酶，从而活化酒精代谢途径，并产生更多的ATP。
3. 线粒体透氧调控机制：线粒体透氧调控机制指的是线粒体氧化磷酸化链中的电子传递受到调节的过程。
线粒体透氧调控机制可以影响酵母细胞的 ATP 出口、线粒体内K+/H+交换等过程，从而影响酒精代谢途径的活性。
三、酿酒酵母酒精代谢途径在酿酒中的应用酿酒酵母的酒精代谢途径在酿酒过程中经常被应用，尤其是在生产工业级别酒精时更为重要。
酿酒酵母代谢途径和生理特性的研究及应用酿酒酵母是酿造酒类中最常用的微生物之一，其代谢途径和生理特性的研究及应用对于酒类工业的发展具有重要意义。
本文将介绍酿酒酵母的代谢途径和生理特性的研究现状和应用领域。
1. 酿酒酵母代谢途径的研究酿酒酵母的代谢途径是指其在酿酒过程中产生的代谢产物和反应途径。
对于酿酒酵母的代谢途径的研究，可以从以下几个方面入手。
首先是酵母的糖代谢途径。
酿酒酵母主要利用葡萄糖发酵产生乙醇、二氧化碳和热能，乳酸和丙酮也是主要代谢产物之一。
酒类工业中，常常需要调节酿酒酵母的糖代谢途径，以实现酒精度和口感的调整。
因此，酿酒酵母的糖代谢途径的研究对于酒类工业的发展非常重要。
其次是酵母的芳香化合物代谢途径。
芳香化合物是酒类中重要的风味成分，其产生主要依赖于酿酒酵母的代谢途径。
酵母中的代谢酶可将氨基酸代谢成酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在发酵过程中生成类似于肉桂醛、苯乙醇等多种芳香化合物。
因此，对于酿酒酵母的芳香化合物代谢途径的研究非常重要，有助于提高酒类的风味特性。
最后是酵母的氧代谢途径。
氧气是酿酒酵母生存所必须的，但是过多的氧气也会影响酵母的代谢途径，对于酒类的品质产生负面影响。
因此，对于酿酒酵母的氧代谢途径的研究非常重要，有助于提高酿酒酵母的适应性和生存能力，从而提高酿酒的效率和品质。
2. 酿酒酵母生理特性的研究除了代谢途径的研究外，酿酒酵母的生理特性研究也非常重要。
酿酒酵母的生理特性包括生长速度、耐受温度、耐受pH值等方面。
首先是生长速度的研究。
酿酒酵母的生长速度会受到发酵过程中的各种因素的影响，包括糖浓度、氨基酸含量、酸碱度、温度等等。
研究酿酒酵母的生长速度，可以为酒类生产提供更加科学的方法和准确的数据支持。
其次是耐受温度的研究。
酿酒酵母需要在相对恒定的温度下进行生长和发酵，过高或过低的温度都会影响酿酒酵母的生长和发酵过程。
因此，研究酿酒酵母的耐受温度，有助于制定酿酒的最适温度，并提高酵母的生存能力和适应性。
酿酒酵母发酵过程中各类代谢物质代谢途径及其调控机制研究酒是人类在几千年的历史中所创造的一种美酒。
酒的制作过程中，必不可少的一个元素就是酵母。
酒酵母是一种单细胞真菌，可以将糖类等有机物质转化为乙醇、二氧化碳等有机物。
在发酵过程中，酒酵母需要调节各类代谢物质的代谢途径，以维持整个发酵过程的正常进行。
本文将介绍酿酒酵母发酵过程中各类代谢物质的代谢途径及其调控机制的研究。
一、酿酒酵母的代谢途径简介酿酒酵母的代谢途径主要包括三个方面：糖类代谢途径、脂类代谢途径和氮素代谢途径。
1、糖类代谢途径糖类代谢途径是酿酒酵母在发酵过程中最为重要的代谢途径。
在糖类代谢途径中，酿酒酵母可以将葡萄糖、果糖等糖类分子转化为乙醇、二氧化碳和能量等有机物质。
糖类代谢途径主要包括三个部分：糖酵解途径、三羧酸循环和氧化磷酸戊糖途径。
2、脂类代谢途径脂类代谢途径主要是指酿酒酵母在发酵过程中通过β-氧化、格丽尔酯途径等途径，将脂肪酸代谢为能量和生长所需的脂类物质。
酿酒酵母在糖类能源不足的情况下，会启动脂类代谢途径维持生物体的正常代谢过程。
3、氮素代谢途径氮素代谢途径主要是指酿酒酵母在发酵过程中将胺基酸和氨基化合物等通过转移和合成等途径，合成生物体所需的蛋白质和核酸等物质，从而完成代谢过程。
二、酿酒酵母代谢途径调控机制酿酒酵母的代谢途径调控机制可以由多种因素参与，如细胞内外环境因子、代谢产物均有影响。
其中，下面我们将具体说明几个调控机制。
1、酒精脱氢酶（ADH）和乙醇酸脱氢酶（ALDH）调控ADH和ALDH是酿酒酵母在糖类代谢途径中最为重要的代谢酶。
ADH能够将葡萄糖、果糖等糖类分子转化为乙醇；而ALDH则能够将乙醇进一步氧化为乙酸。
这两种脱氢酶在整个代谢途径中起到非常重要的调控作用。
2、代谢通路中枢调控代谢通路中枢调控是指通过酶活性的调节和代谢产物的交互作用，来调控酿酒酵母在代谢途径上的分化发育和维持生长，以适应各种环境的需要。
比如，在整个糖类代谢途径中，酿酒酵母可以通过调节各种关键酶的活性，来影响代谢物质的转化和积累。
酿酒酵母的代谢和发酵调控机制的研究一直是酿酒工业和生物工程领域中的热点问题。
酿酒酵母是一种单细胞真菌，广泛存在于自然界中，也是酿酒和面包生产等行业中重要的微生物。
酿酒酵母的代谢通路非常复杂，包括糖、酒精、脂肪酸、氨基酸等多种代谢途径。
其中，糖代谢是酿酒酵母最为重要的代谢途径之一。
对于酿酒过程来说，糖是产酒的主要来源，而且也是调节酵母发酵速率和产生酒精的关键因素。
在酿造葡萄酒和啤酒等过程中，酵母细胞会通过糖酵解作用将葡萄糖转化成乙醇和二氧化碳。
这个过程是通过酿酒酵母的发酵途径和调控机制来完成的。
酿酒酵母通过三种不同的代谢途径来将葡萄糖转化成乙醇和二氧化碳。
这些代谢途径分别是糖酵解、异路线偏好途径和呼吸途径。
糖酵解是酿酒酵母的主要代谢途径之一。
它的主要功能是将葡萄糖转化成乳酸、乙醇和二氧化碳。
这个过程是通过一系列内源性发酵酶完成的，包括磷酸戊糖激酶、三磷酸甘油酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和乙醛脱氢酶等。
异路线偏好途径是酿酒酵母在缺氧条件下的代谢途径。
这个途径的主要功能是将葡萄糖转化成琥珀酸或乳酸，从而产生ATP能量。
值得一提的是，这个途径对于提高酵母的耐受性和生存能力有重要的作用。
呼吸途径是一种氧化代谢途径，能够利用细胞内氧气来转化葡萄糖。
这个途径的主要功能是将葡萄糖氧化成二氧化碳和水，从而产生更多的ATP能量。
除了代谢途径外，酿酒酵母还通过调控机制来确保代谢途径的高效运行。
这种调控机制通常包括迟滞效应、负向调控和正向调控等。
迟滞效应是指酵母在繁殖前期对葡萄糖的吸收速度比在繁殖高峰期要慢。
这个调控机制的主要作用是确保酿酒酵母在繁殖过程中充分利用葡萄糖。
负向调控是一种控制代谢途径的机制，通过这种机制可以控制代谢途径中关键酶的活性和基因表达。
这个机制通常由特定的信号通路负责，并且可以通过信号反馈机制将酵母代谢途径的效应与周围环境相互协调。
正向调控是另一种控制代谢途径的机制，通常通过提高代谢途径中关键酶的活性和基因表达来实现。
19卷5期2003年9月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.19 N o.5September 2003收稿日期:2003201216,修回日期:2003204202。
基金项目:国家自然科学基金委员会与中国节能投资公司联合研究基金资助项目(N o.50273019)。
3通讯作者。
T el :8625312836438428105;Fax :86253128565610;E 2mail :bxm @酿酒酵母木糖发酵酒精途径工程的研究进展沈 煜 王 颖 鲍晓明3 曲音波(山东大学微生物技术国家重点实验室,济南 250100)摘 要 途径工程(Pathway engineering ),被称为第三代基因工程,改变代谢流向,开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。
利用途径工程理念,对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )代谢途径进行理性设计,以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围,使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分,是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一。
这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展。
关键词 途径工程,木糖,酒精,酿酒酵母中图分类号 T Q92 文献标识码 C 文章编号100023061(2003)0520636205 途径工程是利用分子生物学原理,分析细胞代谢网络,通过合理设计的DNA 重组,完成细胞特性改造的应用性学科[1]。
途径工程在分析代谢途径的基础上,定性地改变细胞内代谢流走向,调整原有代谢网络,进而提高特定代谢物的产量。
外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达,可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线,以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特征[2,3]。
发展可再生清洁能源、保护生态环境已成为人类必须面对的两大课题,燃料酒精被公认为最有发展前景的可再生清洁能源之一。
汽油中添加10%～15%酒精的复合燃料———汽油醇(G as ohol ),是良好的无铅汽油,在一些欧美国家已经开始使用这种燃料。
2001年4月国家计委决定十五期间将在大中城市逐步推广使用车用乙醇汽油(汽油醇),这一政策的出台必将给燃料酒精的发展带来极大的商机。
目前,国内外均以淀粉质和糖蜜为原料生产酒精,底物成本在生产总成本中占有很大的比例,在欧美发达国家为40%左右[4],而在中国这一数值高达60%～70%。
因此开发用于燃料酒精生产的廉价原材料是这一能源领域研究的主要方向之一。
地球上最丰富的可再生资源———木质纤维素,是光合作用产物,充分将其中可利用成分转化为燃料酒精,不仅可以提供清洁能源,而且有利于推动太阳光能的转化利用,同时促进大气中C O 2的循环[1],减少由矿物燃料燃烧造成的C O 2净排放。
木糖是半纤维素的主要组成部分,在植物纤维材料水解液中占30%左右,是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分[4,5],以木糖为底物转化酒精的研究,是酒精途径工程研究的热点之一。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )是传统的酒精生产菌株,具备良好的工业生产性状[4,6],其全序列已测定,遗传操作技术也已经成熟[7]。
但是,酿酒酵母由于缺乏木糖代谢途径最初将木糖转化为木酮糖的酶而不能利用木糖。
酒精代谢属于初级代谢,大部分反应为多数微生物相同的公共代谢途径,因此拓展酿酒酵母对木糖的利用只需加入有限的几种酶,反应即可实现[1]。
自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条,其一,在某些真菌中,在木糖还原酶(X ylosereductase ,XR )和木糖醇脱氢酶(X ylitol dehydrogenase ,X DH )的共同作用下完成,XR 和X DH 分别需要NADPH 和NAD +作为辅酶;其二,在某些细菌中,通过木糖异构酶(X ylose is omerase,XI )直接转化为木酮糖。
酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系[8,9],木酮糖经过木酮糖激酶(X ylulokinase ,XK )磷酸化生成52磷酸木酮糖,而进入磷酸戊糖途径(PPP ),然后以中间产物62磷酸葡萄糖和32磷酸甘油醛进入酵解途径(E MP ),最终在厌氧条件下生成酒精。
通过途径工程理念,对酿酒酵母代谢途径进行理性设计,使其具有共发酵葡萄糖和木糖产生酒精的能力,提高酒精得率,是当前转化木质纤维素类生物质生产燃料酒精的研究热点之一[2,10,11]。
酿酒酵母木糖酒精发酵途径工程的研究主要从三个方面展开:①引入木糖的代谢途径,包括木糖向木酮糖的转化以及强化下游代谢流向酒精生成的方向;②木糖的运输系统;③其他与木质纤维素材料发酵生产酒精相关的代谢途径改造。
1 木糖代谢途径的引入酒精发酵涉及的是细胞正常生理生化过程的基础代谢途径,阻断基础代谢途径势必导致细胞代谢异常甚至死亡。
因此初级代谢的途径工程通常采用代谢流扩增和底物谱拓展的所谓“加法战略”,而尽量避免实施途径阻断和基因敲除的“减法战略”操作[1]。
基于这一理论基础,在酿酒酵母中重组表达糖代谢的相关酶基因,引入木糖代谢途径是主要的研究方向。
1.1 木糖向木酮糖的转化从木糖向木酮糖的两条转化途径,均在酿酒酵母中进行过尝试。
许多研究表明[10-14],在酿酒酵母中同时表达真菌的木糖还原酶基因(XY L1)和木糖醇脱氢酶基因(XY L2)可以使酿酒酵母获得利用木糖的能力。
K otter[12]的研究表明,在厌氧条件下,带有Pichia stipitis来源的XY L1、XY L2的酿酒酵母转化子将木糖转化成了大约等摩尔的木糖醇和乙醇,推测在重组酿酒酵母中表达的XR和X DH所需辅助因子不平衡是酒精产生受到限制的原因之一。
Ligthelm等[13]进一步证明木糖醇随氧气量的下降而增加。
由于缺氧条件下不能使NAD+再生,加入电子受体则可以阻止木糖醇的产生,同时使乙醇生成量有所提高[14]。
酶学研究显示,代谢过程中还原乙偶姻或者糖醛需要NADH,因此在木质纤维素水解物中含有糖醛或者加入乙偶姻将有利于木糖的乙醇发酵[15]。
虽然某些菌中的木糖还原酶可以利用NADPH、NADH两种还原型辅酶,但动力学研究表明,XR与NADPH的亲和力大[16,17],结果仍然会引起NADH的积累。
Vandeska等[18]发现Candia boilinii的XR利用NADH比利用NADPH作辅酶时有更高的活性,但后继工作尚未见报道。
Metzger等[19]将从Thermoanaerobium brockii的乙醇脱氢酶基因中得到的NADP 识别序列引入XY L2,试图改变X DH对NAD的特异性需求。
突变的酶可以利用NAD和NADP,并且两者的表观Km相同。
在木糖基本培养基上,带有突变的XY L2和XY L1共同表达的酿酒酵母转化子能够生长。
Anderlund等[20]将XR和X DH 两种酶的基因用一小段DNA连接在一起,在酿酒酵母中成功得到具有双功能酶活性融合蛋白的活性表达,因为两者之间的距离很短,可以使木糖还原酶有更高的几率结合利用NADH作为辅酶。
这种重组酵母和分别表达XR和X DH单体的菌株相比,木糖醇产生率降低1113%,而乙醇得率升高了2013%。
本课题组[10]的研究显示,不同的基因表达水平对木糖发酵产物有重要的影响。
在木糖摇瓶发酵实验中, XRΠX DH酶活比值为0106的菌株,共消耗木糖3125g,与XRΠX DH比值较高的菌株相比,不产生木糖醇,甘油及乙酸盐等副产物较少,但乙醇的产量却较高。
引入细菌木糖异构酶基因(xylA)是使酿酒酵母转化木糖为木酮糖的又一途径。
细菌的木糖异构酶因不需要任何辅助因子,最初被认为是构建利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。
早期多个工作组将多种来源的木糖异构酶克隆表达到酿酒酵母中,Rene等甚至从重组酵母中得到外源xyl A基因正确大小的蛋白产物[21],但均没有得到活性表达[22,23]。
可能的原因有:①细菌和酵母最适pH不同,②酶折叠不正确,③后期翻译模式不合适[22]。
直到1996年,Walfridss on等[23]选择与真核生物亲缘关系更近的古细菌———嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因(xyl A),首次在酿酒酵母中得到了活性表达。
他们将T. thermophilus的xyl A置于酿酒酵母PGK1启动子控制下,用附加体质粒作载体,转化酿酒酵母,重组酶的最高酶活温度为85℃,远高于酿酒酵母的生长发酵温度,但重组菌株不能利用木糖为唯一碳源生长,但是,限氧条件发酵可以消耗木糖而得到乙醇、乙酸和木糖醇。
随后,同一研究小组的Lonn 等[24]用易错PCR方法对T.thermophilus的xyl A进行定向改造,试图解决XI最适反应温度过高的问题,但效果仍不理想。
突变株XI最适反应温度降至60℃,但其热稳定性却大大降低。
本课题组[25]采用PCR技术,克隆得到嗜热细菌Clostridium thermohydrosulfuricum木糖异构酶基因xyl A,并在酿酒酵母H158中得到活性表达,其最高酶活条件是85℃、pH 710,在接近酵母生长温度的30℃和40℃时,其相对酶活分别下降317%和11%,这一工作为进一步在酿酒酵母中建立新的木糖代谢途径打下了基础。
另外,直接向酒精发酵液中添加细菌木糖异构酶制剂[26],是促使木糖向木酮糖的转化的又一方式,且效果较好,但成本偏高,不具有实际应用意义。
总之,酿酒酵母所缺乏的木糖到木酮糖转化的两条途径,均通过代谢途径工程,在酿酒酵母中进行尝试。
来自亲缘关系近的其他酵母菌株的XY L1及XY L2基因表达没有障碍,也得到可以发酵木糖产生酒精的工程菌株,其酒精得率不高是今后需要攻破的难点。
解决XR和X DH辅助因子不能相偶联而造成的氧化还原不平衡可能是这一难点的突破口。
XI不需要任何辅助因子,但其来源于亲缘关系较远的细菌,目前,只有少数高温细菌来源的xylA能在酿酒酵母中得到活性表达,但由于XI重组酶的最适温度和最适pH偏高,且在常温下酶活偏低,使所构建的工程菌株均不能很好地发酵木糖产生酒精。
选择在较低pH和较低温度下高活力的木糖异构酶仍然是这一领域今后努力的主要方向之一。
112 下游代谢流向酒精生成方向的强化在酿酒酵母中引入木糖到木酮糖代谢途径,仍不能很好地发酵木糖产生酒精,暗示木糖到乙醇整个代谢途径上的其他环节有障碍。
推测可能的限制因素有二:一是PPP途径中的转酮酶(TK L)和转醛酶(T AL),二是催化木酮糖代谢第一步的木酮糖激酶(XK S1)。
酿酒酵母本身含有这些酶,但酶活较低。
提高代谢途径中某个关键酶的活力,以得到高产的末端产物,是途径工程的又一个策略[1]。
